分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

摘要

Mycobacterium tuberculosis 在低铁条件下会增加胞外囊泡的产生和释放。本研究详细描述了一种建立低铁条件的方案，以及针对铁缺乏条件下释放的分枝杆菌胞外囊泡进行纯化和表征的方法。

摘要

分枝杆菌，包括引起人类结核病的病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），能够自然释放含有免疫活性分子的细胞外囊泡（EVs）。目前对囊泡生成的分子机制、囊泡内容物及其在病原体与宿主相互作用界面的功能等方面的认识仍十分有限。要解决这些问题，需要采用严格的细胞外囊泡分离、纯化和验证流程。先前研究发现，当结核分枝杆菌（M. tuberculosis）暴露于铁限制条件时——这种条件模拟了Mtb在宿主体内的生存环境——囊泡的产生量会增加。本文提供了一套完整且详细的实验方案，用于从缺铁培养的分枝杆菌中分离和纯化细胞外囊泡，并采用定量与定性方法对纯化后的囊泡进行验证。

引言

分枝杆菌胞外囊泡（MEVs）是大小为60−300 nm的膜结合纳米颗粒，由快速和缓慢生长的分枝杆菌自然释放¹。致病性分枝杆菌释放的MEVs可通过高浓度且受保护形式分泌的免疫活性蛋白、脂质和糖脂，作为与宿主相互作用的一种机制^2,3,4。为了表征MEVs并理解其生物发生过程和功能，严格且高效的囊泡纯化与验证方法至关重要。迄今为止，MEVs已从在富铁培养基中培养的分枝杆菌的培养滤液中分离获得^1,5,6,7,8。

然而，先前的研究表明，铁限制会显著促进结核分枝杆菌（Mtb）释放囊泡，可能是通过分泌到MEV中的铁载体分枝杆菌素（mycobactin）来捕获铁⁹。尽管已有从高铁培养基培养的Mtb中分离MEV的方法报道，但尚未见高效获取低铁培养条件下MEV的有效方法。因此，本方法的目标是从....

方案

1. 铁耗尽型限定培养基的制备

1. 在塑料容器中，将5 g KH₂PO₄、5 g L-天冬酰胺、20 mL甘油和2 g右旋糖溶于900 mL去离子水中，配制1 L最低培养基（MM）。避免使用玻璃器皿，以防铁污染。用5 N NaOH将pH值调节至6.8，并加水定容至1 L。
2. 加入50 g金属螯合树脂（MCR），使用磁力搅拌子在4 °C下轻轻搅拌24小时。通过带有塑料接收器的0.22 µm滤器过滤，以去除MCR并实现灭菌。为加快过滤速度并防止滤器堵塞，过滤前让树脂静置约30分钟。
   注意：根据原子吸收光谱法测定，该培养基中残留铁含量低于2 µM。
3. 在MM中添加0.5 mg/L ZnCl₂、40 mg/L MgSO₄和0.1 mg/L MnSO₄。分别用去离子水配制上述金属补充物的浓缩储备液（1,000倍），过滤灭菌后加入MM中。铁缺乏但补充其他金属的MM在此简称为低铁MM（LIMM）。
4. 从溶于10 mM HCl中的50 mM FeCl₃储备液中取1 mL加入1 L LIMM中（终浓度为50 µM），以制备高铁MM（HIMM）。

2. 在铁限制条件下培养分枝杆菌

1. 解冻50 µL冻存的含15%....

结果

通过密度梯度差速沉降法对MEV进行纯化（图1，图2）。在所述条件下，MEV主要分离于梯度组分3（F3），对应25%碘克沙醇。该结论基于蛋白质、膜脂的检测、完整MEV的显微观察、纳米颗粒尺寸分布以及与抗囊泡抗血清的阳性反应（图2，图3）。以菌落形成单位（CFUs）归一化的蛋白质和脂质浓度显示，在低铁条件下MEV产量较高铁条件（50 µM FeCl₃）下约增加八倍（图3）。尽管仅展示了一次代表性实验的结果，但该结果高度可重复，已通过多次（>10次）MEV分离实验验证。采用本方法从1 L低铁培养物中获得的纯MEV产量约为500 µg蛋白质。

.......

讨论

已开发出多种用于纯化真核细胞来源外泌体的方法¹²。相比之下，关于有效纯化细菌来源细胞外囊泡（EVs）的方法报道较少⁷。高效分离结核分枝杆菌（Mtb）来源的细胞外囊泡（MEVs）需考虑培养这种致病性分枝杆菌所固有的困难。Mtb分裂周期较长（约24小时），且必须在生物安全三级（BSL-3）条件下操作。因此，优化MEV分离方法的效率至关重要。由于分枝杆菌会向培养基中释放糖脂及其他疏水性分子，这些物质易于聚集并污染粗制的MEV样品，因此在进行生化和功能研究之前，对MEVs进行纯化和验证尤为重要。基于先前研究发现Mtb在铁限制条件下可增强MEV的释放，已建立了一种从铁限制培养的分枝杆菌中纯化EV的实验方案。此外，已证实非致病性的M. smegmatis在低铁条件下也会增加EV的释放（数据未显示）。因此，该相同方案也可用于在生物安全二级（BSL-2）条件下纯化该菌的EVs。

该实验步骤的关键环节是低铁培养基的制备。应按照此处所述方法制备该培养基，并将其储存于塑料容器中，而非玻璃容器.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon 搅拌式超滤池，型号 108	EMD Milipore	UFSC40001	超滤系统
BD 聚丙烯 225 mL 锥形离心管	Fisher	05-538-61	锥形离心管
Biomax 100 kDa 截留分子量超滤膜	EMD Milipore	PBHK07610	超滤膜
Chelex-100 树脂	Bio-Rad	142-2842	金属螯合树脂
Middlebrook 7H10 琼脂	BD Difco	262710	分枝杆菌琼脂平板
Middlebrook 7H9 肉汤	BD Difco	271310	分枝杆菌液体培养基
硝酸纤维素印迹膜	GE Healthcare	10600001	印迹膜
Optiprep	Sigma	D1556	碘克沙醇
聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mm	Beckman Coulter	355618	聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mm
聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mm	Beckman Coulter	344059	聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mm
蛋白定量染料	BioRad	5000006	Bradford 蛋白染色液
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	超敏蛋白染色剂
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-三甲基铵苯基)-6-苯基-1,3,5-己三烯 p-甲苯磺酸盐
真空过滤瓶	CellPro	V50022	过滤装置