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方法文章

分离与表征铁限制条件下分枝杆菌产生的细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/60359

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2019年10月31日

 , 
1Public Health Research Institute, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey

本文内容

摘要

Mycobacterium tuberculosis 在低铁条件下会增加胞外囊泡的产生和释放。本研究详细描述了一种建立低铁条件的方案，以及针对铁缺乏条件下释放的分枝杆菌胞外囊泡进行纯化和表征的方法。

摘要

分枝杆菌，包括引起人类结核病的病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），能够自然释放含有免疫活性分子的细胞外囊泡（EVs）。目前对囊泡生成的分子机制、囊泡内容物及其在病原体与宿主相互作用界面的功能等方面的认识仍十分有限。要解决这些问题，需要采用严格的细胞外囊泡分离、纯化和验证流程。先前研究发现，当结核分枝杆菌（M. tuberculosis）暴露于铁限制条件时——这种条件模拟了Mtb在宿主体内的生存环境——囊泡的产生量会增加。本文提供了一套完整且详细的实验方案，用于从缺铁培养的分枝杆菌中分离和纯化细胞外囊泡，并采用定量与定性方法对纯化后的囊泡进行验证。

引言

分枝杆菌胞外囊泡（MEVs）是大小为60−300 nm的膜结合纳米颗粒，由快速和缓慢生长的分枝杆菌自然释放1。致病性分枝杆菌释放的MEVs可通过高浓度且受保护形式分泌的免疫活性蛋白、脂质和糖脂，作为与宿主相互作用的一种机制2,3,4。为了表征MEVs并理解其生物发生过程和功能，严格且高效的囊泡纯化与验证方法至关重要。迄今为止，MEVs已从在富铁培养基中培养的分枝杆菌的培养滤液中分离获得1,5,6,7,8。

然而，先前的研究表明，铁限制会显著促进结核分枝杆菌（Mtb）释放囊泡，可能是通过分泌到MEV中的铁载体分枝杆菌素（mycobactin）来捕获铁9。尽管已有从高铁培养基培养的Mtb中分离MEV的方法报道，但尚未见高效获取低铁培养条件下MEV的有效方法。因此，本方法的目标是从低铁培养物中分离、纯化并定量MEV，以便用于生化和功能分析，以及研究分枝杆菌囊泡生成的遗传决定因素。

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方案

1. 铁耗尽型限定培养基的制备

  1. 在塑料容器中，将5 g KH2PO4、5 g L-天冬酰胺、20 mL甘油和2 g右旋糖溶于900 mL去离子水中，配制1 L最低培养基（MM）。避免使用玻璃器皿，以防铁污染。用5 N NaOH将pH值调节至6.8，并加水定容至1 L。
  2. 加入50 g金属螯合树脂（MCR），使用磁力搅拌子在4 °C下轻轻搅拌24小时。通过带有塑料接收器的0.22 µm滤器过滤，以去除MCR并实现灭菌。为加快过滤速度并防止滤器堵塞，过滤前让树脂静置约30分钟。
    注意：根据原子吸收光谱法测定，该培养基中残留铁含量低于2 µM。
  3. 在MM中添加0.5 mg/L ZnCl2、40 mg/L MgSO4和0.1 mg/L MnSO4。分别用去离子水配制上述金属补充物的浓缩储备液（1,000倍），过滤灭菌后加入MM中。铁缺乏但补充其他金属的MM在此简称为低铁MM（LIMM）。
  4. 从溶于10 mM HCl中的50 mM FeCl3储备液中取1 mL加入1 L LIMM中（终浓度为50 µM），以制备高铁MM（HIMM）。

2. 在铁限制条件下培养分枝杆菌

  1. 解冻50 µL冻存的含15%甘油的结核分枝杆菌（Mtb）菌种，将其划线接种于添加了10% ADN增补剂（含5 g/L白蛋白、2 g/L葡萄糖、0.85 g/L氯化钠、0.2%甘油和0.05%吐温-80）的琼脂平板上10。将平板在37 °C培养至可见菌落。
  2. 挑取单个Mtb菌落10，接种至2 mL添加ADN增补剂的分枝杆菌液体培养基中（材料表）。在37 °C振荡培养。
  3. 使Mtb培养物生长至对数期末期（OD540 约为0.8）。为确认生长状态，使用分光光度计测定OD540。
  4. 取200 µL对数期末期培养物，均匀涂布于添加0.2%甘油、0.05%吐温-80及ADN增补剂的分枝杆菌琼脂平板（材料表）上。至少接种5块平板。将平板在37 °C培养至细菌生长形成融合菌层。Mtb约需1周时间。
  5. 用LIMM润湿无菌棉签，用其从琼脂平板上刮取细菌，并接种至100 mL LIMM中，制备浓度约为OD540 1.0的浓缩菌悬液。
  6. 将该菌悬液用LIMM稀释10倍至1 L，并分装至两个无菌塑料瓶中，每瓶500 mL。
  7. 取2 mL培养物转移至5 mL培养管中，加入10 µL 10%（v/v）tyloxapol。
  8. 将培养物静置于37 °C培养14天。

3. MEVs 的收集

  1. 在收集时测定2 mL培养物在540 nm处的光密度（OD540）。将培养物进行10倍系列稀释，取每种稀释液100 µL接种于含有ADN和0.05% Tween-80的琼脂平板上。
  2. 将培养物转移至五个225 mL锥形离心管中，在20 °C条件下以2,850 × g离心7分钟。
  3. 用50 mL移液管收集培养上清液，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。

4. MEVs 的分离

  1. 将培养滤液转移至置于 4 °C 的搅拌式超滤系统中，使用 100 kDa 截留分子量的滤膜在 <50 psi 条件下过滤浓缩至约 50 mL。
  2. 在 4 °C 条件下，以 15,000 x g 离心浓缩后的培养滤液 15 分钟，并收集上清液。
  3. 将培养滤液置于聚碳酸酯超速离心管中，在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 2 小时。
  4. 通过轻柔吹打，用总共 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬膜性沉淀物。
  5. 取步骤 4.4 中获得的沉淀物悬液 0.5 mL，与 1.5 mL 的 60% 碘克沙醇溶液混合，得到终浓度为 45%（w/v）的碘克沙醇溶液。将该混合液加至 13 mm x 51 mm 聚丙烯薄壁超速离心管底部。
  6. 在 MEV-碘克沙醇 45% 悬液上方，依次覆盖 1 mL 的 40%、35%、30%、25% 和 20%（v/v，溶于 PBS）碘克沙醇溶液，最上层加入 1 mL PBS。
  7. 在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 18 小时。
  8. 使用 1 mL Hamilton 注射器从顶部开始收集 1 mL 的密度梯度组分。
  9. 将每份收集的组分用 PBS 稀释至 20 mL，并在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 2 小时。
  10. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 0.5 mL PBS 中，并于 4 °C 保存该沉淀物。

5. MEVs 的定量分析

  1. 通过Bradford法测定各组分中的蛋白质浓度（材料表），遵循制造商的说明书。
  2. 进行膜脂质分析。
    1. 将每种梯度组分各10 µL与荧光膜探针1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene共同孵育 p- 在96孔黑色板中，于50 µL PBS体积内，加入对甲苯磺酸盐（TMA-DPH），终浓度为1 µg/mL。
    2. 将培养板在33 °C下孵育20分钟。
    3. 在360 nm激发波长和430 nm发射波长下测定荧光。

6. MEV的定性分析

  1. 进行蛋白质电泳。
    1. 将约 1 µg 的 MEV 样品与 16 µL 样品混合，加入 4 µL 的 5 倍上样缓冲液（10% w/v SDS，10 mM 二硫苏糖醇，20% v/v 甘油，0.2 M Tris-HCl，pH 6.8，0.05% w/v 溴酚蓝），在 85 °C 下加热 5 分钟。
    2. 将样品上样至 10% Tris/甘氨酸 SDS-聚丙烯酰胺凝胶11，在电泳缓冲液（25 mM Tris 碱，190 mM 甘氨酸，0.1% SDS）中以 10 V/cm 的电压电泳，直至蓝色染料前沿迁移至凝胶底部。
    3. 使用超敏蛋白质染色液（材料表）对凝胶进行染色。
  2. 进行点印迹（dot blot）。
    1. 取浓度约为 0.5 µg/µL 的 MEV 悬液 2 µL，进行两倍系列稀释后，点样至硝酸纤维素膜上，并按照制造商说明书进行点印迹操作。
    2. 以针对 MEV 制备物免疫小鼠获得的抗血清作为一抗，稀释比例为 1:5,000；以辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗，稀释比例为 1:10,000。使用适当的 HRP 底物显影试剂和成像系统检测抗原-抗体复合物。
  3. 进行负染色及电子显微镜观察。
    1. 在室温下，用含 2% 戊二醛的 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液固定 250 µL MEV 样品 2 小时，随后在含 4% 甲醛、1% 戊二醛和 0.1% PBS 的溶液中 4 °C 过夜孵育。
    2. 用 2% 四氧化锇对固定后的样品染色 90 分钟。
    3. 用乙醇逐级脱水样品，并包埋于 Spurr 环氧树脂中。
    4. 在透射电子显微镜下观察 MEV。

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结果

通过密度梯度差速沉降法对MEV进行纯化（图1，图2）。在所述条件下，MEV主要分离于梯度组分3（F3），对应25%碘克沙醇。该结论基于蛋白质、膜脂的检测、完整MEV的显微观察、纳米颗粒尺寸分布以及与抗囊泡抗血清的阳性反应（图2，图3）。以菌落形成单位（CFUs）归一化的蛋白质和脂质浓度显示，在低铁条件下MEV产量较高铁条件（50 µM FeCl3）下约增加八倍（图3）。尽管仅展示了一次代表性实验的结果，但该结果高度可重复，已通过多次（>10次）MEV分离实验验证。采用本方法从1 L低铁培养物中获得的纯MEV产量约为500 µg蛋白质。

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讨论

已开发出多种用于纯化真核细胞来源外泌体的方法12。相比之下，关于有效纯化细菌来源细胞外囊泡（EVs）的方法报道较少7。高效分离结核分枝杆菌（Mtb）来源的细胞外囊泡（MEVs）需考虑培养这种致病性分枝杆菌所固有的困难。Mtb分裂周期较长（约24小时），且必须在生物安全三级（BSL-3）条件下操作。因此，优化MEV分离方法的效率至关重要。由于分枝杆菌会向培养基中释放糖脂及其他疏水性分子，这些物质易于聚集并污染粗制的MEV样品，因此在进行生化和功能研究之前，对MEVs进行纯化和验证尤为重要。基于先前研究发现Mtb在铁限制条件下可增强MEV的释放，已建立了一种从铁限制培养的分枝杆菌中纯化EV的实验方案。此外，已证实非致病性的M. smegmatis在低铁条件下也会增加EV的释放（数据未显示）。因此，该相同方案也可用于在生物安全二级（BSL-2）条件下纯化该菌的EVs。

该实验步骤的关键环节是低铁培养基的制备。应按照此处所述方法制备该培养基，并将其储存于塑料容器中，而非玻璃容器...

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致谢

我们感谢 Rafael Prados-Rosales 分享抗 MEV 抗血清，以及 Navneet Dogra 进行纳米颗粒追踪分析。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amicon 搅拌式超滤池，型号 108EMD MiliporeUFSC40001超滤系统
BD 聚丙烯 225 mL 锥形离心管Fisher05-538-61锥形离心管
Biomax 100 kDa 截留分子量超滤膜EMD MiliporePBHK07610超滤膜
Chelex-100 树脂Bio-Rad142-2842金属螯合树脂
Middlebrook 7H10 琼脂BD Difco262710分枝杆菌琼脂平板
Middlebrook 7H9 肉汤BD Difco271310分枝杆菌液体培养基
硝酸纤维素印迹膜GE Healthcare10600001印迹膜
OptiprepSigmaD1556碘克沙醇
聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mmBeckman Coulter355618聚碳酸酯超速离心管 25 mm × 89 mm
聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mmBeckman Coulter344059聚丙烯薄壁离心管 13 mm × 15 mm
蛋白定量染料BioRad5000006Bradford 蛋白染色液
SYPRO RubyMolecular ProbesS12000超敏蛋白染色剂
TMA-DPHMolecular ProbesT2041-(4-三甲基铵苯基)-6-苯基-1,3,5-己三烯 p-甲苯磺酸盐
真空过滤瓶CellProV50022过滤装置

参考文献

  1. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
  2. Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
  3. Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
  4. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
  5. Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
  6. White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778(2018).
  7. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).
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  9. Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
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  11. Harlow, E., Lane, L. Antibodies. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).
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