Method Article

半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育

DOI:

10.3791/60362

⸱

October 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ludwig Institute for Cancer Research, San Diego, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 3Recursion Pharmaceuticals, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Diego, 5Cell Biology Section, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health, 6Department of Biology, San Diego State University, 7Developmental and Stem Cell Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在胚胎发育过程中，胚胎学是系统分析细胞命运规范和形态遗传事件的首要系统。一个挑战是胚胎生成在大约13小时的时间内动态展开;这个半天的时间尺度限制了可以成像的胚胎数量，限制了实验的范围。在这里，我们描述了一个半高通量协议，它允许在一次夜间运行中，以中等时间分辨率、从多达 14 个不同条件对 80-100 个胚胎进行同步 3D 延时成像。该协议非常简单，任何实验室都可以通过具有点访问能力的显微镜进行实施。该协议的效用通过用它来成像两个定制的菌株来演示荧光标记，这些荧光标记经过优化，以可视化细菌层规范和形态生成的关键方面。为了分析数据，构建了一个自定义程序，该程序在所有通道、z 步长和时间点中从更广泛的视野中裁剪单个胚胎，并将每个胚胎的序列保存到单独的 tiff 堆栈中。该程序包括用户友好的图形用户界面 （GUI），通过隔离、预处理和统一定向单个胚胎来简化数据处理，为可视化或自动分析做好准备。还提供了一个 ImageJ 宏，该宏将单个胚胎数据编译为多面板文件，在每个时间点显示每个胚胎的最大强度荧光投影和亮场图像。本文描述的协议和工具通过使用它们来描述胚胎发育的特征，在击倒40个先前描述的发育基因之后;此分析可视化了以前用的分着的发育表型，并揭示了新的表型。总之，这项工作详细介绍了半高通量成像方法，以及裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，当与表达信息荧光标记的菌株结合使用时，可以大大加快分析实验胚胎发育。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎是机械细胞生物学的重要模型系统，分析细胞命运规范和形态遗传事件，推动胚胎发育1、2、3、4，5，6，7，8，9。 迄今为止，胚胎中细胞级事件和细胞命运规范的大部分特征都是通过相对高的时间分辨率一次进行成像实验（即每10-100s采集一次）表达的胚胎来实现的。荧光标记。尽管这种方法非常适合从秒到几十分钟的事件，但这种方法在技术上对较长过程的特征进行了限制，从小时到天的顺序。从第一次裂解到伸长结束的胚胎发育大约需要10小时。在这个时间尺度，半高通量的方法，将允许同时降低时间分辨率成像（即，在5-20分钟的时间间隔获得）更大的胚胎组，从不同的条件，将开辟一个新的实验范围;例如，进行系统的大规模筛选工作，并分析足够数量的胚胎，以便比较分子扰动的后果。

在这里，我们描....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 为半高通量成像准备C. elegans胚胎

注:该协议的这一部分的目标是将半同步（2至8细胞阶段）的C.elegans胚胎（从合适的标记菌株（图2）解剖到玻璃底384孔板中进行成像。其他板格式也可以工作，但384孔板是首选，因为小井大小限制胚胎传播到相对较小的区域，这有利于识别含有多个胚胎的场进行延时成像。大致同步胚胎可确保捕获一个领域中每个胚胎的整个发育过程。

  1. 准备5⁄10 mL 0.1 mg/mL的盐酸四甲盐碱（TMHC）麻醉剂溶解在冰冷M9介质（0.45 M Na2HPO4+7H2O，0.11 M KH2PO4， 0.04 M NH4Cl） 期间使用解剖和成像。这种介质包括麻醉剂，以确保移动孵化的幼虫不会在早期发育阶段破坏胚胎的成像。
    注:如果使用裁剪和可视化工具分析使用标准甘草垫安装方法获得的数据，请跳到下面的第 3 节。
  2. 将制备溶液的70 μL加到玻璃底384孔板的单个孔中，每个孔有一口;避免板的外侧两行，以防止边缘效应。
    注:使用粘合 PCR 板箔覆盖周围井非常有用（参见

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在描述分子扰动对C.elegans胚胎发育的影响时，一个重大挑战是，胚胎从第一次裂解到20°16的伸长结束大约需要10小时。一种半高通量方法，其中可以同时成像大量胚胎，这种方法对于此时间尺度的事件非常有用，因为它允许同时对多个条件进行成像，并为每个条件提供足够的组合大小，从而实现定量分析 （图 1A.

半高通量成像方法和多标记菌株
此处描述的半高通量成像方法（如图 1B所示），采用 384 孔玻璃底板;多井格式允许并行排列多达 14 个条件，而小井的体积限制了搜索区域，简化了包含胚胎的用于高分辨率成像的场的识别。在这里，使用了共聚焦扫描仪盒，配备了微透镜增强型双Nipkow旋转盘、512 x 512 EM-CCD摄像机、高精度自动XY级（指定分辨率0.1 μm）和电动z轴控制（指定分辨率0.1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作描述了一套工具和方法，开发，使更大规模的努力，以分析基因在胚胎发育在C.elegans的功能。我们的半高通量方法允许在一次实验中以 20 分钟分辨率对胚胎发育进行 3D 延时成像，用于 80-100 个胚胎。虽然此协议可以适用于任何所需的标记菌株，但此工作演示了使用两种定制菌株来监测胚胎生成过程中事件的方法的潜力:（1） 胚层报告菌株，其中组织特定启动子驱动荧光组蛋白的表达，以标记内皮、中生代和外皮核，以及（2）形态发生报告应变，利用表皮和神经元启动子驱动细胞结中的荧光标记的表达，等离子膜。通过成像这两种菌株，可以非常详细地捕捉分子扰动对细胞命运规范和形态遗传事件的影响。为了应对这种方法生成的数据量所带来的挑战，开发了自定义工具，以简化数据处理和可视化。第一个工具在3D延时序列中从胚胎领域中裁剪单个胚胎，同时将胚胎旋转到标准的前后方向，并执行背景减法、漂移校正和衰减校正。这个程序被打包为一个用户友好的GUI（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w）和源代码和更高级的批处理版本的程序为Python精明的用户（github.com/renatkh/embryo_.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.D.O.得到了美国国家普通医学研究所赞助，加州大学圣地亚哥分校机构研究和学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）。A.D.和K.O.得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所也为他们提供了用于支持这项工作的研究资金。我们感谢安德鲁·奇斯霍尔姆在这个项目的早期阶段的建议，罗纳德·比格斯在最初方法开发阶段后为这个项目做出了贡献，戴夫·詹金斯和安迪·肖为小分子发现提供支持和访问组的高含量成像系统。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
吸液管组件Drummond Scientific2-000-000
校准移液器 （25 mL）Drummond Scientific2-000-025
Cell Voyager 软件河电机公司CV1000
锥形管 （15 mL） 附带横USA Scientific1475-0501
CV1000 显微镜横河电机公司CV1000
凹陷载玻片（3 孔）Erie Scientific1520-006
解剖显微镜NikonSMZ-645
Eppendorf 离心机 5810REppendorf5811 07336
ImageJ/FIJI开源https://imagej.net/Fiji
M9 缓冲液实验室制备https://openwetware.org/wiki/M9_salts
微量离心管 （1.5 mL）USA Scientific1615-5500
Microseal F-foil SealBio-RadMSF1001
NGM 板实验室制备http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
手术刀 #15Bard ParkerREF 371615
Sensoplate Plus，384 孔，F 底，玻璃底Greiner Bio-One781855
盐酸四咪唑Sigma AldirchT1512-10G
镊子，杜蒙 #3电子显微镜科学0109-3-PO
U-PlanApo 物镜（10 次; 0.4 NA）奥林巴斯1-U2B823
U-PlanApo 物镜（60 次; 1.35 NA）奥林巴斯1-U2B832
横河电机公司

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
  2. Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic DevelopmentSemi high throughput Imaging3D Time lapse ImagingEmbryo Cropping ProgramImageJ Visualization ToolkitFluorescent Marker StrainsConfocal MicroscopyAutomated Data AnalysisRNAi based ScreeningEmbryo Preparation Protocol

Related Articles