本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C. elegans胚胎进行三维延时成像，以观察胚胎发育过程。此外，还提供了图像处理与可视化工具，以简化数据分析流程。将这些方法与定制的报告基因品系相结合，可实现对胚胎发育的精细动态监测。
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本文内容
摘要
摘要
C. elegans 是研究胚胎发育过程中细胞命运决定和形态发生事件的首选体系。一个挑战在于，胚胎发育是一个动态过程，持续时间约为 13 小时；这种长达半天的时间尺度限制了可成像胚胎的数量，从而制约了实验的范围。本文介绍了一种半高通量实验方案，可在单次过夜实验中，以中等时间分辨率，同时对 80 至 100 个胚胎进行三维延时成像，涵盖最多 14 种不同条件下的发育过程。该方案操作简便，任何配备具有多点成像功能显微镜的实验室均可实施。通过成像两种自主构建的转基因线虫品系（其表达经优化的荧光标记，用于可视化胚层形成和形态发生的若干关键过程），验证了本方案的实用性。为分析数据，我们开发了一个定制程序，该程序可从多通道、多 z 层及多时间点的宽视野图像中裁剪出单个胚胎，并将每个胚胎的图像序列保存为独立的 tiff 堆栈文件。该程序配备用户友好的图形界面（GUI），可通过分离、预处理和统一胚胎朝向，显著简化数据处理流程，为后续可视化或自动化分析做好准备。同时提供一个 ImageJ 宏，可将单个胚胎的数据整合为多面板文件，展示每个胚胎在各时间点的最大强度荧光投影图像和明场图像。本文所述的实验方案与工具已通过功能验证：用于分析 40 个已知发育相关基因敲降后的胚胎发育表型，不仅重现了先前报道的发育异常，还发现了新的表型。综上所述，本研究建立了一种半高通量成像方法，并配套开发了胚胎裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，结合表达特异性荧光标记的品系，可显著加速胚胎发育相关研究的实验进程。
引言
C. elegans 胚胎是研究细胞生物学机制以及细胞命运决定和驱动胚胎发育的形态发生事件的重要模型系统1,2,3,4,5,6,7,8,9。迄今为止，对胚胎中细胞水平事件和细胞命运决定的大部分表征工作，依赖于对表达荧光标记物的胚胎进行单个、相对高时间分辨率的成像实验（即每10–100秒采集一次图像）。尽管该方法适用于持续数秒至数十分钟的事件，但在表征持续数小时至数天的较长时间过程时，其技术上存在局限性。从第一次卵裂到体轴伸长结束的胚胎发育过程大约需要10小时。在此时间尺度下，若能采用半高通量方法，同时对来自不同条件的较大量胚胎群体进行较低时间分辨率的成像（即每5–20分钟采集一次图像），将有望拓展新的实验范围；例如，实现系统性的大规模筛选，并分析足够数量的胚胎，以比较分子扰动所导致的后果。
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方案
1. 准备 秀丽隐杆线虫 用于半高通量成像的胚胎
注意：本实验方案部分的目标是将一群半同步化（2至8细胞期）的C. elegans胚胎（从合适的标记品系中解剖获得，图2）装载到玻璃底384孔板中，用于成像。其他规格的培养板也可使用，但优先选择384孔板，因为其孔径较小，可限制胚胎扩散至相对较小的区域，从而便于识别含有多个胚胎的视野，以进行延时成像。对胚胎进行大致同步化处理，可确保在同一视野中的每个胚胎均能完整记录其整个发育过程。
- 准备 5–10 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的盐酸四咪唑（TMHC）麻醉剂溶液，将其溶解于冰冻 M9 培养基（0.45 M Na2HPO4∙7H2O，0.11 M KH2PO4，0.04 M NaCl，0.09 M NH4Cl）中，用于解剖和成像过程。该培养基含有麻醉剂，可确保孵化出的活动幼虫不会干扰早期胚胎发育阶段的成像。
注意：若使用裁剪和可视化工具分析通过标准琼脂糖垫固定方法获得的数据，请直接跳至下文第 3 节。 - 将配制好的溶液每孔分装 70 µL 至玻璃底 384 孔板的各个孔中....
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结果
在表征分子扰动对C. elegans胚胎发育影响方面，一个重大挑战在于，胚胎从第一次卵裂到伸长阶段结束需要约10小时（20°C条件下）16。因此，建立一种半高通量方法，能够同时对大量胚胎进行成像，对于此类时间尺度上的事件研究具有重要意义，该方法可实现多种实验条件的平行成像，并为每种条件提供足够大的样本量，从而支持定量分析（图1A）。
半高通量成像方法与多标记菌株
本文所述的半高通量成像方法（如图1B所示）采用384孔玻璃底板；多孔板格式可并行排列最多14种条件，且小孔尺寸限制了搜索区域，简化了用于高分辨率成像的含胚胎视野的识别。此处使用了一台共聚焦扫描仪，配备微透镜增强型双Nipkow旋转盘、512 × 512 EM-CCD相机、高精度自动XY载物台（标称分辨率为0.1 µm）以及电动Z轴控.......
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讨论
本研究介绍了一套为大规模分析C. elegans胚胎发育过程中基因功能而开发的工具与方法。我们的半高通量方法可在单次实验中对80至100个胚胎进行三维时间序列成像，时间分辨率为20分钟。尽管该实验方案可适配于任何所需的标记品系，但本研究通过两种自主构建的品系展示了该方法的应用潜力：（1）胚层报告品系，其中组织特异性启动子驱动荧光组蛋白表达，以标记内胚层、中胚层和外胚层的细胞核；（2）形态发生报告品系，利用表皮和神经元特异性启动子驱动荧光标记物在细胞连接和质膜中的表达。通过对这两个品系进行成像，可详细记录分子扰动对细胞命运决定及形态发生事件的影响。为应对该方法所产生的大量数据带来的挑战，我们开发了定制化工具以简化数据处理与可视化流程。第一个工具可从三维时间序列图像中将单个胚胎裁剪出来，同时将胚胎旋转至标准的头尾轴方向，并完成背景扣除、漂移校正和衰减校正。该程序已封装为用户友好的图形界面（https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w），并为熟悉Python的用户提供源代码及更高级的批量处理版本（github.com/renatkh/embryo_crop.git）
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致谢
S.D.O. 获得了由美国国立普通医学科学研究所资助的加州大学圣地亚哥分校机构研究与学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）的支持。A.D. 和 K.O. 得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所还为本研究提供了研究经费。我们感谢 Andrew Chisholm 在本项目初期阶段提供的建议，Ronald Biggs 在初始方法开发阶段之后对本项目所作的贡献，以及 Dave Jenkins 和 Andy Shiau 提供的支持和使用小分子发现团队高内涵成像系统的机会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 吸液管组件 | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| 校准移液管（25 mL） | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager 软件 | Yokogawa Electric Corp | 随 CV1000 提供 | |
| 锥形管（15 mL） | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 显微镜 | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| 凹孔载玻片（3 孔） | Erie Scientific | 1520-006 | |
| 解剖显微镜 | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf 离心机 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | 开源软件 | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 缓冲液 | 实验室配制 | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| 微量离心管（1.5 mL） | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F型封膜 | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM 平板 | 实验室配制 | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| 15 号手术刀片 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus，384 孔，F 型底，玻璃底 | Greiner Bio-One | 781855 | |
| 盐酸四咪唑 | Sigma Aldrich | T1512-10G | |
| 镊子，Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo 物镜（10× 0.4 NA） | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo 物镜（60× 1.35 NA） | Olympus | 1-U2B832 |
参考文献
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model ....
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重印与许可
