用于药物输注与电生理联合记录的微注射电极系统

摘要

我们介绍了一种微注射电极系统，该系统专为电生理记录及辅助递送实验探针（如纳米传感器、微电极）而设计，并可选择性地进行药物灌注。该系统将广泛可得的微流控组件与容纳探针的套管相连接。文中包含微注射电极构建的逐步操作方案，并展示了在猕猴皮层中灌注蝇蕈醇（muscimol）时的实验结果。

摘要

该微注射电极系统专为药物灌注、电生理记录以及实验探针（如微电极和纳米传感器）的递送与回收而设计，适用于清醒、行为自由的动物，并优化了重复使用性能。微注射电极系统可配置用于多种用途：（1）通过套管简单安置原本过于脆弱而无法穿透硬脑膜的实验探针；（2）独立进行微流体药物灌注，或与包含实验探针（即微电极、纳米传感器）的套管联合使用。在本方案中，我们将详细说明微注射电极的逐步构建方法、其与微流体组件的连接方式，以及该系统在体应用的操作流程。该系统的微流体组件可实现纳升级体积的精准递送，并将穿刺损伤降至最低。药物灌注可在清醒、行为自由的动物中独立进行，也可与微电极或纳米传感器等实验探针同步使用。该系统的应用范围广泛，既可用于研究药物对皮层电活动和行为的影响，也可基于探针或纳米传感器的测量结果，探究特定皮层区域在行为任务中的功能。为展示该系统部分功能，本文提供了一个示例：在恒河猴执行工作记忆任务期间，通过灌注蝇蕈醇（muscimol）可逆性地失活其额叶眼动区（FEF）。

引言

电生理学和药物注射方法在神经科学中被广泛用于研究啮齿类和灵长类动物体内的神经元活动与行为。在过去三十年中，早期注射电极（injectrode）模型的不断改进使得该技术更加精确且侵入性更小，能够在特定脑区同时进行记录和药物注射^1,2,3。对于灵长类动物而言，若要将该技术用于依赖高度训练动物的高级认知功能研究，实现微量药物的精准递送并最大限度减少组织损伤尤为关键。近年来的技术进展包括利用植入式探针进行长期电生理和化学信号测量并结合刺激功能⁴，以及在啮齿类动物中初步尝试结合记录与微流控药物递送系统⁵。本文所描述的注射电极系统可实现电生理记录、刺激和精确的药物递送，目前已在多个灵长类动物实验室中成功应用^6,7,8。

随着用于神经科学领域的精密专用传感器（如纳米传感器^9,10）日益普及，迫切需要一种可靠的方法，能够在不损坏脆弱的纳米级器件或微电极尖端的前提下，将探针顺利穿过硬脑膜。

我们设计了一种微注射电极系统，该系统利用 readily available、低成本的组件，克服了将这些方法结合使用时面临的技术难题，并实现了两个主要功能：（i）能够将脆弱的实验探针（如微电极或纳米传感器）穿过硬脑膜和神经组织，同时保护探针免受任何损伤。该功能可通过套管作为引导，在神经组织中将实验探针精确放置于目标位置。（ii）能够使用微电极进行结合电生理记录、电刺激与药物注射的实验。

我们的系统采用导管穿透硬脑膜，同时使用套管进行药物输送（当系统用于微注射时），并在穿过硬脑膜和神经组织时为微电极或纳米传感器提供额外保护。该系统可利用广泛 commercially available 且价格低廉、易于获取的组件轻松构建。我们通过使用小直径套管（外径 OD = 235 µm，内径 ID = 108 µm）来最小化穿刺损伤。

本文介绍了微注射电极的制备步骤以及微流控系统的配置方法。我们详细说明了微注射电极的使用流程，无论是独立使用，还是与微流控系统联用进行药物注射。该方法同样适用于其他脆弱的实验探针，例如纳米传感器^9,10。探针可根据设计从前端或后端装入套管，并在穿透硬脑膜和神经组织时免受损伤。我们提供了在非人灵长类动物上进行的体内实验示例数据：在动物执行记忆引导性眼跳（MGS）任务时，我们先使用钨丝微电极进行电刺激，随后在额眼区（FEF）注射蝇蕈醇（muscimol）。

方案

实验程序遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及神经科学学会的指南和政策。实验和行为学操作方案已获犹他大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 刺激与记录用微电极的构建（图1a）

1. 测量套管和探针（本示例中为纳米传感器）的长度。探针必须比套管长出其从套管尖端伸出的长度（根据探针设计而定）再加上约 2 cm。
2. 在放大镜或显微镜（约 10 倍放大）下，将探针装入套管；如有可能，建议采用后端装入方式，以保护探针尖端。
   注意： 此步骤为手动操作，具有挑战性。建议在使用实际实验探针前，先在放大镜下用微电极进行练习。
3. 将装有探针的套管穿过顶部卡套、T 型接头和底部卡套。
   1. 如果探针仅为一根无任何附件的单线，则从后端装入套管，并从底部卡套一侧将组件插入 T 型接头。套管顶部（平端侧）应位于 T 型接头中部，处于底部卡套内但不在顶部卡套内。实验探针或生物传感器应从顶部卡套上方伸出。
      注意： 也可使用微型钻头在卡套塞上钻孔来自制定制卡套，孔的尺寸应根据将套管固定到 T 型接头所需的直径确定。
4. 使用卡套扳手拧紧 T 型接头顶部和底部的卡套。切勿过度拧紧。可在顶部卡套内添加一小段管材以增强电极的支撑。
5. 根据探针的规格，将金针焊接到探针的各个端子（信号、接地等）上。
6. 调整探针与套管的相对位置。在放大条件下测量探针从套管伸出的距离，并从顶端手动调节（探针可在卡套内自由滑动）。
7. 在金针与顶部卡套之间添加环氧胶，以将探针固定在卡套上。
8. 拧松顶部卡套，将探针缩回套管内。在放大条件下目视确认探针已完全进入套管内。
9. 将注射电极连接至微驱动装置。

2. 药物输注用微注射电极的构建（图1b）

1. 使用卡套将套管的"非斜面"或平端连接到T型接头底部。使用卡套扳手拧紧卡套。
2. 将一小段毛细管（约1.5 cm）穿过标准卡套，并连接到T型接头顶部，再用卡套扳手拧紧。
3. 通过毛细管、T型接头、套管及相应的卡套，从后端装入微电极。
4. 确保电极后端从毛细管后部伸出的长度小于1 cm，且电极尖端从套管底部以所需距离伸出。可通过顶部手动调节电极位置。
5. 将金针焊接到微电极的终端。
6. 在金针与顶部卡套之间添加环氧胶，以将微电极固定在卡套上。
7. 拧松顶部卡套，使探针缩回套管内。目视确认微电极已完全缩入套管中。

3. 微流控电路的构建（图2）

1. 将面包板放置在稳定的表面上。将两个三通阀平行于面包板的长边放置，相距约6英寸，使其中一个端口（始终开启的端口）彼此相对。使用螺丝将阀门固定在面包板上。
2. 将一把尺子放置在阀门旁边（用于测量和追踪毛细管内液体的移动）。
3. 将1:1的低黏度油与食用色素（标记物）混合液装入气密注射器中，并将其安装到标记物泵上。截取一段毛细管，使用标准卡套和鲁尔锁接头将注射器连接至输入阀的一个端口。此即为"标记线"。
4. 截取一段较短的毛细管作为"标尺线"。使用标准卡套将其紧固至两阀门相对的端口上。
5. 截取两段较长的毛细管，分别用于连接输出阀与微注射电极，以及连接药物泵与输入阀（使用标准卡套）。
   注意：这两段管路的长度取决于实验装置的具体布局，其中一段需足够长以从输注装置连接至动物，另一段则需从药物泵连接至输入阀。使用切割石切割毛细管。

4. 将微电极安装到微驱动装置（图3）

1. 安装前，确保微电极/实验探针已缩回套管内。
   注意：导向管应已安装在微驱动装置中。
2. 将定制的适配器连接到微注射电极上。
3. 通过导向管从上方装入微注射电极，并使用螺丝将其固定在适配器上。
4. 测量微驱动装置的位置（深度），使微注射电极从导向管中伸出，然后将其回缩约 1 cm，以准备插入。
5. 对于微灌注实验，将"脑部导管"连接至微注射电极的未使用T型接头开口处。使用标准卡环，并用卡环扳手拧紧。

5. 微流控系统的冲洗与准备

1. 将微驱动装置与微注射电极置于废液杯上方。
2. 将氯己定（例如，Nolvasan；溶解浓度为 20 g/L）吸入 1 mL 气密注射器中，并将其放入药物泵。调节阀门流向，使液体从药物泵经阀门流向阀管路，并从"脑部管路"流出。
3. 以低流速（50–200 µL/min）用氯己定冲洗管路至少 10 分钟。随后用无菌生理盐水重复步骤 5.2 至 5.3，再用空气冲洗。
   注意：此阶段必须检查是否存在泄漏。可在接头处轻轻使用无尘擦拭纸，以帮助发现套管处的液体渗漏。
4. 将药物装入 500 µL 气密注射器，压缩其中空气后，放入药物泵。以 50 µL/min 流速推动，直至微注射电极末端有数滴液体流出。
5. 将导管浸入氯己定溶液（溶解浓度为 20 g/L）中浸泡 15 分钟。
6. 将输出阀的流向转向"冲洗管路"。推动标记物泵，直至在标尺管线上观察到清晰的颜色与油相界面。确保药物与染料之间始终存在油相，以防止两种水溶性物质混合并失去清晰的分界线。标记该油/染料界面的起始位置（可用胶带或记号笔标记）。
7. 将输出阀的流向转向脑部管路。

6. 进行记录或灌注实验

注意：动物操作步骤将根据实验室和实验的不同而有所差异。以下步骤应在完成必要的手术设置和准备工作以暴露硬脑膜后进行。实验结束后，必须根据机构批准的方案执行所有必要的术后操作步骤。

1. 将微型驱动装置连接至记录室。降低导管使其穿透硬脑膜。
   注意：导管不应穿透硬脑膜过深，以避免损伤皮层。
2. 将微注射电极下降至脑内记录/注射位点上方约 2 mm 处。
3. 拧紧顶部卡环（微电极/生物传感器外露部分），并将金针连接至记录系统。继续推进微注射电极至目标位点。
   注意：计算时需计入微电极超出套管的部分长度。
4. 进行灌注实验时，使用手动微量注射泵每 3 分钟推动油柱前进 1 cm（约 60 nL/min）。当完成目标体积灌注后，将输出阀切换至冲洗管路。
   注意：灌注体积取决于实验动物模型及靶向脑区。过快的流速可能损伤神经组织。
5. 实验结束后，将微注射电极回撤至导管内（保持探头外露）。随后取下微型驱动装置进行冲洗。按照步骤 5.1–5.5 所述方法冲洗微流控系统，以备重复使用。
   注意：根据我们的经验，若妥善维护，微注射电极可多次使用。电生理记录质量的下降速度通常快于注射功能的退化。

结果

我们在动物执行记忆引导扫视任务的同时，注射GABAa受体激动剂（蝇蕈醇）以可逆性失活额叶眼动区（FEF）¹¹。在此任务中，动物需保持注视，同时呈现一个外周视觉目标。动物在持续注视的同时记住目标位置，当注视点消失后，即向记忆中的位置执行一次扫视眼动以获得奖励。微注射电极的制备方法见图1b。示例实验的灌注体积为850 nL。记忆引导扫视（MGS）任务中，动物在蝇蕈醇灌注前后不同时间和位置的行为表现如图4所示。灌注后2至3小时观察到最显著的行为表现下降。

图1：微注射电极的逐步制备过程。（a）独立于微流控系统使用的配置。测量套管和探针，以确认探针尖端可伸出至所需长度（例如150 µm）。将探针从前端装入套管中。套管穿过T型接头，并固定在底部一侧，使其平端位于T型接头中间；探针的后端继续穿过顶部卡套。通过在探针各电极终端焊接金针，并在金针与顶部卡套之间添加胶水以增强稳定性，完成微注射电极的组装。与信号采集系统的连接方式取决于探针的设计。在本示例中，我们的探针为具有三个引线的纳米传感器。（b）与微流控系统联用的配置。为将微注射电极连接至微流控系统，T型接头顶部一侧使用一段毛细管。探针可从前端或后端装入。微流控管道则连接至T型接头的第三个开口。本示例中我们使用了一根微电极。请参见套管尖端的放大图，图中通过拧紧顶部卡套使微电极伸出。有关制作所用材料的清单，请参见材料表。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：微流控系统。 双阀配置可控制流体流向微注射电极或冲洗管路，便于故障排查。该回路由两个三通阀通过毛细管和标准接头连接构成。使用气密性注射器装载并注入输注药物和示踪剂。可编程注射泵可实现系统的自动冲洗和药物加载。手动微量注射泵可用于精确控制注射过程并实现可视化操作。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：将微注射电极安装至液压微驱动器（含或不含注射功能）。 步骤4.1：使用定制的适配器将微注射电极连接至微驱动器。通过单个螺钉将适配器固定在微驱动器上；两个螺钉将微注射电极固定在适配器上。在将微注射电极装入微驱动器的导管时，应至少松开顶部套管两圈，以保护微电极/实验探针的尖端。步骤4.3：从顶部将微注射电极插入导管。步骤4.4：若进行微量输注，使用塑料套管将药物管路连接至第三个三通接口。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：在额叶眼区（FEF）注入蝇蕈醇期间进行的记忆引导扫视任务。（a）微注射电极被植入右侧半球的额叶眼区（FEF）。（b）在记忆引导扫视（MGS）任务中的行为表现，该任务中八个目标呈现在周围视野。我们在注射前及注射后三个时间点各进行了4个MGS任务区块。极坐标图显示了在各个时间点（不同颜色）相对于注视点不同位置（极坐标图上的角度）的表现（偏心度）。注射后2小时，左侧视野半区的表现明显下降（蓝色轨迹，极坐标图左半部分）。（c）MGS任务中8个周围记忆位置的扫视轨迹，在FEF区注射蝇蕈醇之前（左图）和之后（右图，灌注后1小时和3小时）。蝇蕈醇注射后，左侧视野半区（极坐标图左半部分）的扫视准确性下降。比例尺单位为视觉角度（dva）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前已有多种方法可实现同步药物递送与电生理记录。本系统设计灵活，既可单独用于记录，也可与药物注射联合使用，并能够精确地将任何脆弱的实验探针（如纳米传感器或微电极）在免受损伤的情况下穿过硬脑膜和神经组织进行定位。该系统可通过肉眼精确控制药物输注体积（本实验室先前研究已证明精度可达17 nL³）。

已有更专业的压力注射系统采用更小的直径¹²。这些系统允许多个记录位点，但其控制所需的软硬件设置复杂，导致各个组件成本较高，且与尚未大规模商业化的实验探针连接时灵活性较差。此外，我们的注射电极无需慢性植入，具有很高的灵活性：可与用于检测化学和电生理信号的生物传感器兼容，同时能够输注药物，有望测量局部药物输注对这些反应的影响。

该设计允许实验探针在穿透硬脑膜后伸出，从而避免探针结构受损。这一特性使设备具备多功能性，可在不损坏任何实验探针（如纳米级纳米传感器¹⁰）的情况下穿透硬脑膜。然而，探针伸出长度受限于套管螺纹的圈数，标准套管的伸出长度限制在约 1 mm。由于套管直径较小（228 µm），对组织造成的损伤极小。

在本实验中，我们使用该系统对额叶眼动区（FEF）进行蝇蕈醇的可控递送，以实现可逆性失活，同时结合微电极进行电刺激或细胞外记录（单个神经元记录、局部场电位记录）。该 FEF 实验需要先对 FEF 进行微刺激，以确认失活前的眼跳向量，随后通过药物灌注研究可逆性 FEF 失活期间的工作记忆功能。药物注射前后维持对同一孤立单个神经元的记录较为困难；然而，我们能够在灌注前后成功记录局部场电位。本文展示了一项结合药物注射、电生理记录与电刺激的实验。

一旦建立，该方法非常可靠且稳健。然而，由于小分子（如盐）会在微管和端口内析出沉淀，每次实验后必须进行彻底冲洗，以确保微流控系统无堵塞和泄漏。由于整个回路结构简单，每个组件均可独立更换，便于故障排查。

尽管该方法是在非人灵长类动物的额眼区（FEF）中演示的，但其原理可应用于任何需要结合电刺激、记录和药物注射的脑区，适用于啮齿类或更大体型的物种。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三通手动阀门	LabSmith	手动三通选择阀 (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
套管	Vita Needle Company	304不锈钢管，外径228μm，内径165μm	Vita Needle Master Tubing Gauge Chart
切割石	Molex	切割石 1" x 1" (部件号 1068680064)	强烈推荐遵循毛细管切割方法：https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
双乙酸氯己定	Walmart	Nolvasan溶液消毒剂 (AAP311)	用于微流控回路冲洗，溶解浓度为20 g/L
定制适配器	定制供应商	-	定制加工的适配器，用于连接微注射电极与液压微驱动装置
螺丝刀	LabSmith	T7 TORX螺丝刀，用于安装面包板螺丝 (LS-TORX Driver)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
环氧胶	LabSmith	双组分高强度环氧粘合剂 (LS-EPOXY)，适用于金属与塑料粘接	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
卡套	LabSmith	一体式接头 (C360-100)，用于连接毛细管，通孔尺寸适配外径360μm的毛细管	https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
卡套堵头	LabSmith	一体式堵头 (C360-101)，用于任何-C360接口	https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
卡套扳手	LabSmith	1/8" 六角扳手，用于安装一体式接头和堵头 (LS-HEX 1/8" Hex Wrench)	https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24
气密性注射器	Hamilton Company	500μL 气密性注射器型号1750 (81220) 和 1 mL 气密性注射器型号1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
金针	Aim-Cambridge	镀金公端压接连接器针 (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
无尘擦拭布	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes Delicate Task	无尘擦拭布，用于检测系统泄漏
液体食用色素	McCormick & Co.	水基黑色液体食用色素 (52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
低粘度油	Clearco Products Co.	纯硅油八甲基三硅氧烷，25°C时粘度为1cSt (PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
鲁尔锁接头	LabSmith	鲁尔锁适配器 (C360-300)，母接头，用于将鲁尔锁注射器连接至外径360μm的毛细管	https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
微型钻头	Grainger	微型钻头，0.23 mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
微电极	FHC	金属微电极，钨丝带环氧绝缘层	https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
油压液压微操纵器	Narishige Group	带导管的油压液压微操纵器 (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Polymicro毛细管	Molex	Polymicro柔性熔融石英毛细管 (TSP150375)，外径375µm，内径150µm	Polymicro Capillary Tubing
可编程注射泵	Harvard Apparatus	标准推注/回吸泵，可编程 (70-2213)	https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html
直尺	Empire	不锈钢6"硬质直尺 (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
螺丝套装	LabSmith	阀门安装螺丝套装 (LS-SCREWS .25)，自攻螺钉 (2-28 x 1/4”)，用于将阀门固定在面包板上	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
标准面包板	LabSmith	4" x 6" 平台 (LS600)，孔距0.25"，用于安装流体回路	https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
无菌生理盐水（氯化钠）0.9%	Baxter	0.9% 氯化钠无菌溶液	无菌静脉输注液
无菌注射器滤器	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex™-GP 无菌注射器滤器，聚醚砜膜 (SLGPM33RS)	https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs
Stoelting手动微量注射泵	Stoelting Company	手动推注/回吸泵 (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T型接头	LabSmith	互连三通接头 (C360-203)，用于合并流路，适用于外径360μm的毛细管	https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24