Summary
We presenteren een microinjectrode systeem ontworpen voor elektrofysiologie en geassisteerde levering van experimentele sondes (dat wil zeggen, nano sensoren, micro-elektroden), met optionele drug Infusion. Op grote schaal beschikbare microfluïdische componenten worden gekoppeld aan een canule met de sonde. Een stap-voor-stap protocol voor de microinjectrode constructie is inbegrepen, met resultaten tijdens infusie van muscimol in de makaak cortex.
Abstract
Dit microinjectrode systeem is ontworpen voor drug Infusion, elektrofysiologie, en levering en het ophalen van experimentele sondes, zoals micro-elektroden en nano sensoren, geoptimaliseerd voor herhaald gebruik in wakker, dieren gedragen. Het microinjectrode systeem kan voor meerdere doeleinden worden geconfigureerd: (1) eenvoudige opstelling van de canule voor plaatsing van een experimentele sonde die anders te kwetsbaar zou zijn om de dura mater te penetreren, (2) microfluïdische infusie van een geneesmiddel, ofwel afzonderlijk of gekoppeld aan een canule met een experimentele sonde (d.w.z. micro-elektrode, nano sensor). In dit protocol leggen we de stap voor stap constructie van de microinjectrode, de koppeling naar microfluïdische componenten, en het protocol voor het gebruik van het systeem in vivo. De microfluïdische componenten van dit systeem zorgen voor de levering van volumes op de nanoliter schaal, met minimale penetratie schade. Geneesmiddel infusie kan zelfstandig of gelijktijdig worden uitgevoerd met experimentele sondes zoals micro-elektroden of nano sensoren in een wakker, gedragen dier. Toepassingen van dit systeem variëren van het meten van de effecten van een medicijn op corticale elektrische activiteit en gedrag, om de functie van een specifieke regio van cortex te begrijpen in de context van gedrags prestaties op basis van sonde of nano sensormetingen. Om een aantal van de mogelijkheden van dit systeem te demonstreren, presenteren we een voorbeeld van de infusie van muscimol voor omkeerbare inactivatie van het frontale oogveld (fef) in rhesus makaak tijdens een werkgeheugen taak.
Introduction
Elektrofysiologie en drug injectie methoden worden veel gebruikt in de neurowetenschappen te bestuderen van neuronale activiteit en gedrag, in vivo, bij knaagdieren en primaten. In de afgelopen drie decennia, verbeteringen van de vroege injectrode modellen toegestaan een preciezere en minder invasieve techniek, en gelijktijdige opname en drug injectie op specifieke hersengebieden1,2,3. Voor primaten in het bijzonder is het vermogen om kleine volumes nauwkeurig te leveren met minimale weefselbeschadiging van cruciaal belang als de techniek moet worden gebruikt voor de studie van geavanceerde cognitieve functies waarvoor goed opgeleide dieren nodig zijn. Recente vooruitgang omvatten chronische elektrofysiologische en chemische metingen in combinatie met stimulatie met behulp van geïmplanteerde sondes4, en gecombineerde opname en microfluïdische drug levering is onlangs getest in knaagdieren5. Het injectrode-systeem dat hier wordt beschreven, maakt elektrofysiologische opname, stimulatie en precieze geneesmiddelafgifte mogelijk, en het is al met succes geïmplementeerd in meerdere primaat Labs6,7,8.
De toenemende beschikbaarheid van delicate, gespecialiseerde sensoren, zoals nano sensoren9,10 met neurowetenschappen toepassingen, vereist een betrouwbare methode voor het verkrijgen van de sonde door de dura mater zonder beschadiging van de fragiele nanoschaal apparaten of micro-elektrode tips.
We ontwierpen een microinjectrode systeem dat de technische uitdagingen overkomt van het combineren van deze methoden met behulp van gemakkelijk beschikbare, goedkope componenten, en vergemakkelijkt twee belangrijke functies: (i) de mogelijkheid om een fragiele experimentele sonde te plaatsen, zoals een micro-elektrode of nano sensor, door de dura mater en zenuwweefsel, beschermd tegen elke beschadiging. Deze functionaliteit maakt plaatsing van de experimentele sonde op gerichte locaties mogelijk, geleverd door het gebruik van de canule als een gids door het zenuwweefsel. (II) de mogelijkheid om een micro-elektrode te gebruiken om experimenten uit te voeren, waarbij elektrofysiologie-opnames en elektrische stimulatie met medicijn injectie worden gecombineerd.
Ons systeem gebruikt een geleidings buis om de Dura te penetreren, samen met een canule die zowel voor de levering van geneesmiddelen (bij gebruik van het systeem voor micro infusie) functioneert en extra bescherming biedt voor de micro-elektrode of nano sensor (zowel bij het passeren van de Dura als zenuwweefsel). Dit systeem kan eenvoudig worden geconstrueerd met veel commercieel verkrijgbare componenten, die goedkoop en gemakkelijk te vinden zijn. We minimaliseren penetratie schade door gebruik te maken van een kleine diameter canule (buitendiameter OD = 235 μm, binnendiameter ID = 108 μm).
Hier presenteren we stapsgewijze instructies voor de microinjectrode constructie en configuratie van het microfluïdische systeem. We verklaren de stappen die nodig zijn voor het gebruik van de microinjectrode, onafhankelijk of gekoppeld aan het microfluïdische systeem voor de injectie van geneesmiddelen. Een soortgelijke aanpak kan worden toegepast met elke fragiele experimentele sonde, zoals een nano sensor9,10. De sonde kan worden voor-of back-geladen in de canule (afhankelijk van het ontwerp), en zal worden beschermd tegen beschadiging bij het binnendringen van de Dura en zenuwweefsel. We bieden voorbeeldgegevens van een in vivo experiment met niet-menselijke primaten, waarbij we een Tungsten micro-elektrode gebruikten om elektrische stimulatie uit te voeren, en vervolgens muscimol geïnjecteerd in het frontale oogveld (FEF) terwijl het dier een door het geheugen geleide Saccade (MGS)-taak voerde.
Protocol
Experimentele procedures volgde de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren en de Society for Neuroscience richtlijnen en beleid. De protocollen voor experimentele en gedrags procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Utah institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. constructie van de Microinjectrode voor stimulatie en opname (Figuur 1a)
- Meet de lengte van de canule en de sonde (in dit voorbeeld een nano sensor). De sonde moet langer zijn dan de canule door de lengte van de canule-tip (afhankelijk van het ontwerp van de sonde) plus ongeveer 2 cm.
- Onder een vergrootglas of een microscoop (~ 10x vergroting), laadt u de sonde in de canule; indien mogelijk heeft een back-loading de voorkeur om de punt van de sonde te beschermen.
Opmerking: Deze stap, handmatig uitgevoerd, is uitdagend. Het wordt aanbevolen om te oefenen met een micro-elektrode onder een vergrootglas voordat u probeert met een echte experimentele sonde. -
Doorloop de canule (met de sonde) door de bovenste Ferrule, T-Junction en onderste Ferrule.
- Als de sonde is slechts een enkele draad zonder eventuele bijlagen, back-load het in de aan en plaats de assemblage in de T-splitsing van de onderste Ferrule. Bovenkant van de canule (platte zijde) moet worden geplaatst in het midden van de T-splitsing, binnen de bodem, maar niet de bovenste Ferrule. De experimentele sonde of biosensor moet boven de bovenkant van de bovenste Ferrule uitsteeren.
Opmerking: Op maat gemaakte adereindhulzen kunnen ook worden gemaakt door het boren van een gat in de Ferrule stekkers met behulp van micro boor bits, de grootte van het gat wordt gebaseerd op de diameter die nodig is voor het aanspannen van de canule op de T-splitsing.
- Als de sonde is slechts een enkele draad zonder eventuele bijlagen, back-load het in de aan en plaats de assemblage in de T-splitsing van de onderste Ferrule. Bovenkant van de canule (platte zijde) moet worden geplaatst in het midden van de T-splitsing, binnen de bodem, maar niet de bovenste Ferrule. De experimentele sonde of biosensor moet boven de bovenkant van de bovenste Ferrule uitsteeren.
- Gebruik de moersleutel om de adereindhulzen aan de boven-en onderkant van de T-splitsing aan te spannen. Niet te strak vastdraaien. Een klein stukje slang kan worden toegevoegd om de elektrode ondersteuning binnen de bovenste Ferrule te versterken.
- Soldeer gouden pinnen aan elk van de sonde terminals (signaal, grond, enz.), volgens de specificaties van de sonde.
- Pas de relatieve positie van de sonde en de canule aan. Meet de afstand die de sonde uitsteekt uit de canule onder vergroting, en pas handmatig aan vanaf het bovenste uiteinde (sonde kan vrij glijden binnen Ferrules).
- Voeg epoxy lijm toe tussen de gouden pennen en de bovenste Ferrule om de sonde aan de Ferrule te bevestigen.
- Schroef de bovenste Ferrule los om sonde in de canule te intrekken. Controleer visueel of de sonde zich volledig in de canule onder vergroting bevindt.
- Bevestig de injectrode aan de Microdrive.
2. bouw van de Microinjectrode voor geneesmiddel infusie (Figuur 1b)
- Bevestig de "niet-schuine" of platte kant van de canule aan de onderzijde van de T-splitsing met behulp van een Ferrule. Gebruik de moersleutel om de Ferrule aan te scherpen.
- Bevestig een klein stukje capillaire slang (~ 1,5 cm) aan de bovenkant van de T-splitsing door het door de standaard-Ferrule te passeren. Draai met een moersleutel.
- Back-load de micro-elektrode door de capillaire slang, T-splitsing, canule en bijbehorende Ferrules.
- Zorg ervoor dat de achterkant van de elektrode uitsteekt minder dan 1 cm van de achterkant van de capillaire slang, en de punt van de elektrode uitsteekt uit de canule op de gewenste afstand aan de onderzijde. De elektrodepositie kan vanaf de bovenkant handmatig worden aangepast.
- Soldeer een gouden speld aan op de micro-elektrode Terminal.
- Voeg epoxy lijm toe tussen de gouden speld en de bovenste Ferrule om de micro elektrode aan de Ferrule te bevestigen.
- Schroef de bovenste Ferrule los om de sonde in de canule te intrekken. Controleer visueel of de micro-elektrode volledig is ingetrokken in de canule.
3. constructie van het Microfluïdische circuit (Figuur 2)
- Plaats een breadboard op een stabiel oppervlak. Plaats de 2 3-wegkleppen parallel aan de langste zijden van de breadboard, ongeveer 6 in. apart met één poort (die altijd open is) tegenover elkaar. Gebruik schroeven om de kleppen op de breadboard te bevestigen.
- Plaats een liniaal naast de kleppen (om de beweging van vloeistoffen in de capillaire slang te meten en te volgen).
- Laad een mengsel van 1:1 lage viscositeit olie en voedselkleuring (marker) in de gasdichte spuit en plaats in de marker pomp. Snijd één stukje capillaire slang, en gebruik standaard adereindhulzen en Luer-lock connectors om de spuit aan te sluiten op een van de poorten op de ingangs klep. Dit is de "markeringslijn".
- Snijd een kort stukje capillaire slang voor de "liniaal lijn". Gebruik standaard adereindhulzen om de tegenoverliggende poorten van de kleppen aan te spannen.
- Knip twee langere stukjes capillaire slang om de uitgangs klep aan te sluiten op de microinjectrode en om de geneesmiddel pomp aan te sluiten op de ingangs klep (gebruik standaard Ferrules).
Opmerking: De lengte van deze twee lijnen is afhankelijk van de experimentele opstelling, men moet lang genoeg zijn om van de infusie apparatuur naar het dier te reiken, en de andere van de geneesmiddel pomp tot de ingangs klep. Gebruik een klieft steen om de capillaire slang te snijden.
4. de micro Injectrode op de Microdrive monteren (Figuur 3)
- Zorg ervoor dat de micro-elektrode/experimentele sonde vóór montage in de canule is ingetrokken.
Opmerking: De geleidings buis moet op zijn plaats in de Microdrive. - Bevestig een op maat gemaakte adapter aan de microinjectrode.
- Top-laad de microinjectrode door de geleidings buis en bevestig deze met behulp van schroeven aan de adapter.
- Meet de Microdrive positie (diepte) waarbij de microinjectrode uitsteekt uit de geleidings buis, vervolgens intrekken ~ 1 cm ter voorbereiding voor het inbrengen.
- Voor micro infusie experimenten, Verbind de "hersen lijn" met de ongebruikte T-Junction opening van de microinjectrode. Gebruik een standaard Ferrule en draai deze vast met de Ferrule-moersleutel.
5. blozen en bereiding van het Microfluïdische systeem
- Plaats de Microdrive met de microinjectrode over een afval beker.
- Laad chloorhexidine (bijv. nolvasan; opgelost bij 20 g/L) in de 1 mL gasdichte spuit en plaats deze in de geneesmiddel pomp. Draai de stroomrichting van de kleppen zodanig dat vloeistof van de geneesmiddel pomp door de klep naar de kleppen lijn gaat en de "hersen lijn" uit.
- Spoel het circuit met chloorhexidine af met een laag debiet (50-200 μL/min) gedurende minimaal 10 min. Herhaal stap 5,2 tot en met 5,3 met steriele zoutoplossing en vervolgens lucht.
Opmerking: Het is belangrijk om in dit stadium te controleren op lekkages. Breng pluisvrije doekjes zachtjes aan op de knooppunten om eventuele vloeibare lekken door de Ferrules te helpen onthullen. - Laad het geneesmiddel in de 500 μL gasdichte spuit, Comprimeer de lucht en plaats deze in de geneesmiddel pomp. Debiet bij 50 μL/min tot enkele druppels uit de microinjectrode.
- Week de geleidings buis in chloorhexidine (opgelost bij 20 g/L) gedurende 15 minuten.
- Draai de richting van de uitgangs klep naar de "Flushing Line". Vooruit de marker pomp tot een duidelijke rand van kleur en olie wordt waargenomen op de liniaal lijn. Zorg ervoor dat er altijd olie tussen het medicijn en de kleur is om de twee in water oplosbare materialen niet te mengen en de scherpe rand ertussen te verliezen. Markeer de startpositie van deze olie/kleurstof lijn (met een stukje tape of marker).
- Draai de richting van de uitgangs klep naar de hersen lijn.
6. opname of een infusie experiment uitvoeren
Opmerking: De stappen voor het verwerken van dieren zullen variëren afhankelijk van het lab en het experiment. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd na de noodzakelijke chirurgische opstelling en voorbereiding is uitgevoerd om de Dura bloot te leggen. Na het experiment moeten alle noodzakelijke stappen na de procedure worden uitgevoerd in overeenstemming met institutioneel goedgekeurde protocollen.
- Bevestig de Microdrive aan de opname kamer. Verlaag de geleidings buis om de Dura te penetreren.
Opmerking: De geleidings buis mag niet verder dringen dan de Dura om beschadiging van de cortex te voorkomen. - Verlaag de microinjectrode tot ongeveer 2 mm boven de plaats voor opname/injectie in de hersenen.
- Draai de bovenste Ferrule (uitstekende micro-elektrode/biosensor) aan en verbind de gouden pinnen met het opnamesysteem. Blijf de microinjectrode naar de doellocatie bevorderen.
Opmerking: Vergeet niet de afstand op te nemen dat de micro-elektrode zich in de berekeningen buiten de canule bevindt. - Gebruik voor infusie experimenten de handmatige micro spuitpomp om de olie kolom elke 3 min 1 cm te verplaatsen (~ 60 nL/min). Zodra het gewenste volume is geïnfundeerd, schakelt u de uitgangs klep naar de afboekings lijn.
Opmerking: Het volume is afhankelijk van de model soort en het beoogde hersengebied. Snellere stroomsnelheden kunnen zenuwweefsel beschadigen. - Wanneer de experimenten voltooid zijn, trek de microinjectrode in de geleidings buis (laat de sonde uitstek). Verwijder vervolgens de Microdrive voor het leegmaken. Spoel het microfluïdische systeem uit zoals beschreven in stap 5.1-5.5. om zich voor te bereiden op hergebruik.
Opmerking: In onze ervaring, de microinjectrode zal duren voor verschillende toepassingen als de juiste zorg wordt genomen. Elektrofysiologische opnamekwaliteit daalt sneller dan de mogelijkheid van injectie.
Representative Results
We voerden injectie van een GABAa agonist (muscimol) voor omkeerbare inactivatie van de frontale oogveld (FEF), terwijl het dier voerde een geheugen geleide Saccade taak11. In deze taak wordt het dier gefixeert en een perifeer visueel doelwit gepresenteerd. Het dier handhaaft fixatie bij het onthouden van de doellocatie, en zodra het fixatie punt verdwijnt, voert een saccadische oogbeweging naar de herinnerd locatie om een beloning te ontvangen. De microinjectrode werd gebouwd volgens de instructies in Figuur 1b. Het infusie volume voor het voorbeeld experiment was 850 nL. Gedrags prestaties op de geheugen geleide Saccade (MGS) taak op verschillende locaties en tijden ten opzichte van de infusie van muscimol wordt weergegeven in Figuur 4. De grootste prestatie tekorten werden waargenomen bij 2 tot 3 uur na de infusie.
Figuur 1: stap voor stap fabricage van microinjectrode. a) configuratie voor gebruik, onafhankelijk van microfluïdisch systeem. De canule en sonde worden gemeten om te bevestigen dat de punt van de sonde op de gewenste lengte kan worden uitstegen (bijv. 150 μm). De sonde is voorgeladen in de canule. De canule wordt door de T-splitsing heen en bevestigd aan de onderzijde, met het vlakke uiteinde in het midden van de T-splitsing; de back-end van de sonde gaat door de bovenste Ferrule. De microinjectrode wordt voltooid door het solderen van gouden pinnen op elk van de sonde terminals en het toevoegen van lijm tussen hen en de bovenste Ferrule voor stabiliteit. De verbinding met het acquisitie systeem is afhankelijk van het ontwerp van de sonde. In dit voorbeeld is onze sonde een nano sensor met drie leads. b) configuratie voor gebruik met microfluïdisch systeem. Om de microinjectrode te koppel aan het microfluïdische systeem, wordt een stukje capillaire slang gebruikt voor de bovenzijde van de T-splitsing. De sonde kan aan de voor-of achterzijde worden geladen. De microfluïdische lijn wordt vervolgens aangesloten op de derde T-Junction opening. In dit voorbeeld gebruikten we een micro-elektrode. Zie het ingezoomde beeld van de punt van een canule waarin de micro-elektrode uitsteerde door het aandraaien van de bovenste Ferrule. Zie de tabel met materialen voor een lijst met artikelen die in de bouw worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Microfluïdisch systeem. De twee-kleppen configuratie maakt controle van de stroomrichting naar de microinjectrode of naar de spoel lijn voor het oplossen van problemen. Het circuit is gebaseerd op twee 3-poorts afsluiters die zijn aangesloten met behulp van capillaire slangen en standaard Ferrules. Gastight-spuiten worden gebruikt om het infuus medicijn en de marker te dragen en te injecteren. Een programmeerbare spuitpomp zorgt voor het automatisch afspoelen van het systeem en het laden van het medicijn. Een handmatige micro spuitpomp zorgt voor gecontroleerde injectie en visualisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: montage van microinjectrode op een hydraulische micro aandrijving met en zonder injectie capaciteit. Stap 4,1: een op maat gemaakte adapter zorgt voor de bevestiging van de microinjectrode naar de Microdrive. Een enkele schroef verbindt de adapter met de Microdrive; twee schroeven beveiligen microinjectrode aan de adapter. De bovenste Ferrule moet ten minste 2 bochten worden losgeschroefd om de punt van de micro-elektrode/experimentele sonde te beschermen bij het laden van de microinjectrode in de geleidings buis van de Microdrive. Stap 4,3: plaats microinjectrode in de geleidings buis vanaf de bovenkant. Stap 4,4: als u micro infusie uitvoert, sluit u de geneesmiddel lijn aan op de derde T-Junction opening met behulp van een plastic Ferrule. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: geheugen geleide Saccade-taak tijdens infusie met muscimol in FEF. a) de microinjectrode werd in het rechter halfrond, fef-gebied geplaatst. (b) gedrags prestaties tijdens een MGS-taak waarbij acht doelstellingen periaal worden geplaatst. We liepen 4 blokken van de MGS taak, voor en na drie keer na de injectie. Polar plot toont de prestaties (excentricatie) op elk van deze tijden (kleur), voor verschillende locaties ten opzichte van het bindings punt (hoek op pool plot). De prestaties duidelijk gedaald in de linker Visual hemifield 2 h na injectie (blauwe Trace, linker helft van de pool plot). c) Saccade traceringen voor 8 perifere geheugenlocaties vóór (links) en na injectie met muscimol in de fef (rechts, 1 en 3 uur na de infusie). Saccade-nauwkeurigheid in het linker visuele hemifield (linkerhelft van pool plots) daalde na injectie met muscimol. Schaal in graden van visuele hoek (dva). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Op dit moment zijn er verschillende methoden beschikbaar om gelijktijdige levering van geneesmiddelen en elektrofysiologie uit te voeren. Ons systeem is bedoeld om de flexibiliteit te hebben om te worden gebruikt voor opnames, onafhankelijk of in combinatie met medicijn injectie, en om de mogelijkheid te hebben om een kwetsbare experimentele sonde nauwkeurig te plaatsen, zoals een nano sensor of een micro-elektrode, beschermd tegen elke beschadiging, via de dura mater en het zenuwweefsel. Het systeem maakt nauwkeurige controle van geneesmiddel infusievolumes met het blote oog mogelijk (17 nL precisie getoond in eerdere studies in ons lab3).
Er zijn meer gespecialiseerde systemen voor druk injectie met kleinere diameters12. Deze systemen maken meerdere opname sites mogelijk, maar de complexe installatie van software en hardware die nodig is voor de controle van het systeem draagt hogere kosten voor elk van de componenten, en heeft minder flexibiliteit om te kunnen samenvallen met experimentele sondes die nog niet op grote schaal zijn gecommercialiseerd. Bovendien vereist onze injectrode geen chronisch implantaat en biedt het een grote mate van flexibiliteit: compatibel met biosensoren om chemische en elektrofysiologische signalen te meten, en in staat zijn om drugs te gebruiken, met de potentie om het effect van gelokaliseerde drug infusies op deze reacties te meten.
Het ontwerp kan de experimentele sonde te worden uitstek na Dura penetratie om schade aan de structuur van de sonde te voorkomen. Deze functie maakt de multifunctionaliteit van het apparaat mogelijk, om de Dura te penetreren zonder schade te riskeren van een experimentele sonde zoals nano sensoren met nanometer-schaal10. Er is echter een beperking van de lengte die kan worden uitstekt, beperkt door het aantal omwentelingen van de Ferrule, beperkt tot ~ 1 mm voor de standaard Ferrules. Er is minimale weefselbeschadiging door de kleine canule diameter (228 μm).
In het experiment dat we toonden, werd het systeem gebruikt om een gecontroleerde levering van muscimol uit te voeren voor reversibele inactivatie van FEF, gelijktijdig met ofwel elektrische stimulatie of extracellulaire opname (één neuron, lokaal veld potentieel) met behulp van een -elektrode. Dit experiment in FEF vereist micro stimulatie van de FEF om Saccade-vectoren te bevestigen voorafgaand aan inactivatie, en het medicijn werd geïnfundeerd om werkgeheugen te bestuderen tijdens reversibele FEF-inactivatie. Het is onwaarschijnlijk dat een opname van hetzelfde geïsoleerde enkele neuron kan worden gehandhaafd voor en na de injectie van het geneesmiddel; We waren echter in staat om lokale veld potentialen voor en na de infusie op te nemen. Hier tonen we een experiment waarin injectie, opname en elektrische stimulatie worden gecombineerd.
Zodra het is ingesteld, is de methode zeer betrouwbaar en robuust. Echter, als gevolg van precipitatie van kleine moleculen (bijv. zout) binnen de kleine buis en havens, is een grondige spoeling nodig na elk experiment om de microfluïdica vrij van obstakels en lekkages te houden. Door de eenvoud van het gehele circuit kan elk onderdeel onafhankelijk worden vervangen voor eenvoudige probleemoplossing.
Hoewel de methode in het FEF-gebied in een niet-humane primaat werd gedemonstreerd, kan het principe worden toegepast op elk ander hersengebied waar een combinatie van elektrische stimulatie, opname en medicijn injectie gewenst is, in soorten van knaagdieren of grotere maten.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de financiering van de National Institutes of Health (NIH), subsidies EY026924 en EY014800 (to B.N.), een onbeperkte subsidie van onderzoek ter voorkoming van blindheid, Inc., New York, NY aan het Department oftalmologie en visuele wetenschappen, Universiteit van Utah, en de start-up fondsen die aan R.E. werden verstrekt door de Henry Samueli school of Engineering en de afdeling elektrotechniek van de University of California, Irvine. Deze methode is gebaseerd op een eerdere rapport van een soortgelijke methode ontwikkeld in Dr. Tirin moore's Lab, gepubliceerd in Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience methoden. De auteurs danken Dr. Kelsey Clark voor haar commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | Vita Needle Master Tubing Gauge Chart |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | - | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | Polymicro Capillary Tubing |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9% | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
