福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星DNA分型与流式细胞术倍性分析

摘要

葡萄胎是一种具有异质性病因的异常人类妊娠，可根据其形态学特征及葡萄胎基因组的亲本来源进行分类。本文详细描述了对福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织进行多重微卫星DNA基因分型和流式细胞术分析的实验方案，并介绍了结果的解读与整合方法。

摘要

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征为滋养层细胞过度增殖和胚胎发育异常。根据显微镜下的形态学评估，HM可分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）。这两种类型还可根据亲本对葡萄胎基因组的贡献进一步细分。通过形态学和基因型分析对HM进行分类，对于患者的临床管理以及对该疾病病理机制的基础理解至关重要。已有充分文献表明，HM的形态学分析存在较大的观察者间差异，单独使用形态学分析不足以准确地将HM分类为CHM或PHM，也无法可靠区分葡萄胎与水肿性非葡萄胎流产。目前基因分型分析主要基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的妊娠产物组织及其DNA，但这类样本质量通常不理想，可能导致错误结论。本文提供了针对FFPE葡萄胎组织进行多重基因分型和流式细胞术分析的详细实验方案，并阐述了这些方法的结果解读、常见问题排查，以及如何将其与形态学评估、p57^KIP2免疫组织化学和荧光原位杂交（FISH）技术相结合，以实现准确且可靠的诊断。作者在此分享了过去10年中对约400例妊娠产物进行分析所积累的方法与经验。

引言

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是胚胎发育异常、滋养层细胞过度增殖以及绒毛膜绒毛（CV）的水泡样变性。传统上，葡萄胎仅根据形态学评估分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）¹。然而，研究表明，仅依靠形态学评估不足以将葡萄胎准确分类为这两种亚型（CHM 和 PHM），也难以将其与非葡萄胎性流产相区分^2,3,4。

由于完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）的恶性倾向不同，因此准确判断葡萄胎的基因型对于为患者提供恰当的随访和管理至关重要。因此，在过去几十年中，已开发并逐步完善了多种方法，用于确定葡萄胎组织的亲本来源，从而实现对葡萄胎的正确分类。这些方法包括核型分析、染色体带型多态性分析、人类白细胞抗原（HLA）血清学分型、限制性片段长度多态性分析、串联重复序列数目可变性分析、微卫星基因分型、流式细胞术以及p57^KIP2免疫组织化学染色。这些技术使得可根据基因组中亲本贡献的来源对葡萄胎妊娠进行准确分类，具体如下：完全性葡萄胎（CHM）为二倍体，其来源为单精子或双精子的雄性单亲；部分性葡萄胎（PHM）为三倍体，在99%的情况下由双精子受精形成，仅1%为单精子受精所致^5,6,7,8。此外，在过去二十年中还发现了一种新的葡萄胎基因型，即二倍体双亲型葡萄胎。这类葡萄胎多表现为复发性，可发生于单个家庭成员（单发病例）或至少两个家庭成员（家族性病例）。此类二倍体双亲型葡萄胎主要由患者NLRP7或KHDC3L基因的隐性突变引起^9,10,11,12。携带NLRP7基因隐性突变的患者所发生的二倍体双亲型葡萄胎，在形态学分析中可能被误诊为CHM或PHM，这似乎与患者突变的严重程度相关^13,14。除了根据基因型对葡萄胎进行分类外，多种基因分型技术的引入和应用还使得能够将各种类型的葡萄胎与非葡萄胎性流产（如非整倍体二倍体双亲型妊娠及其他类型的妊娠）区分开来^5,15。这些非葡萄胎性妊娠可能表现出一定程度的滋养层细胞增殖和绒毛形态异常，从而在某些方面模拟葡萄胎的部分形态学特征。

本文的目的是提供针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的多重基因分型和流式细胞术的详细实验方案，并对这些方法的结果进行综合分析，同时将其与其他方法整合，以实现对葡萄胎组织的准确且结论性的诊断。

方案

本研究已获得麦吉尔大学机构审查委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书，同意参与本研究，并同意从各病理科获取其福尔马林固定石蜡包埋的妊娠产物（POCs）。

注意：尽管通过流式细胞术进行基因分型和倍性测定的方法有多种，但此处提供的方案描述了每种分析使用一个平台的一种方法。

1. 基因分型

1. 选择最佳的FFPE组织块
   1. 针对每个胚胎产物（POC）的FFPE样本，按照第1.2和1.3节所述方法，为每个可用的组织块制备4 µm厚的苏木精-伊红（H&E）染色切片，用于显微镜下的形态学评估。
   2. 使用H&E染色切片和光学显微镜，选择含有最多绒毛组织（CV）的FFPE组织块；如有可能，优先选择绒毛组织与母体组织分离、未混杂的组织块。
2. 切片
   1. 将选定的组织块置于冰上15分钟，以利于切片操作。
   2. 调整切片机，分别切割4 µm厚的切片用于显微镜形态学评估，以及10 µm厚的切片用于DNA提取。
   3. 将冷却后的组织块放入切片机中，从每个组织块切取一张切片用于H&E染色，从选定的组织块中切取10−30张切片（根据组织块中绒毛组织的含量而定）用于DNA提取。
      注意：对于富含绒毛组织的组织块，10张切片足以满足DNA提取需求。若组织块中仅约10%为绒毛组织，其余为母体组织，则需切取20−30张切片，以确保获得足够的DNA量。
   4. 使用镊子将每张切片转移至45 °C水浴中，用预先用铅笔标记好样本编号的带正电荷载玻片（材料表）捞起切片。
   5. 将带有切片的载玻片放入65 °C烘箱中，使切片牢固附着于载玻片。H&E染色用载玻片在烘箱中孵育25分钟；用于DNA提取的载玻片孵育20分钟。
      注意：较短的孵育时间使组织与载玻片的粘附性略降低，从而有助于后续去除母体组织。
3. H&E染色
   1. 让载玻片冷却至室温（10分钟）。
   2. 试剂配制
      1. 根据表1配制伊红Y工作液（0.25%），充分混匀后室温保存。
      2. 通过将苏木精储备液用水稀释5倍（即80 mL水与20 mL苏木精混合）配制苏木精工作液。
         注意：苏木精储备液应包裹铝箔避光保存。
   3. 根据表2在通风橱内准备染色缸并加入相应试剂。
   4. 按照表2规定的时间，将载玻片浸入相应的染色缸中完成H&E染色步骤。
   5. 使用封片介质和玻璃盖玻片（材料表）对4 µm切片进行封片，用于形态学分析。
      注意：用于基因分型的10 µm切片不应加盖盖玻片。
   6. 将10 µm切片置于通风橱中至少3小时，以使有毒的二甲苯气味充分挥发。
      警告：所有染色步骤均须在通风橱内进行。二甲苯试剂必须始终存放于通风橱内，因其挥发气体具有毒性。此外，二甲苯和苏木精废液必须弃置于专用容器中。当这些容器装满后，应按照实验室安全机构的建议进行处理。

试剂	用量
Eosin Y 储存液 (1%)	250 mL
80% 乙醇	750 mL
冰醋酸（浓）	5 mL

表1：伊红Y工作液（0.25%）的配制。

所用试剂（每缸100 mL）	时间
1) 二甲苯	5 min
2) 二甲苯	5 min
3) 100% 乙醇	2 min
4) 95% 乙醇	2 min
5) 70% 乙醇	2 min
6) 50% 乙醇	2 min
7) 蒸馏水	5 min
8) 苏木精	4 min
9) 蒸馏水	5 min
10) 伊红	1 min
11) 95% 乙醇	5 min
12) 100% 乙醇	5 min
13) 二甲苯	5 min
14) 二甲苯	5 min

表2：H&E染色方案所用试剂及作用时间。

4. 绒毛膜绒毛（CV）的分离
   1. 在体视显微镜下，使用镊子和用水润湿的小块擦拭纸（材料表）从经H&E染色的10 µm厚切片上刮除不需要的母体组织。
      注意： 最终目标是仅保留绒毛膜绒毛（CV）或胎儿膜（如存在），完全去除其他所有组织。此步骤可能需要大量时间和耐心，具体取决于组织块，因其要求极为细致的操作。
   2. 清洁完成后，应由第二人对切片进行复核，确保无母体组织残留。
   3. 对清洁后的切片拍照，或记录以下信息以辅助数据分析：1）组织是否难以清洁、是否有出血或非常干净；2）所用切片数量；3）清洁后组织的大致量。
      注意： 图1 展示了一个易于清洁的切片示例。对于含有大致该量CV的组织块，10张切片足以用于DNA提取。而 图2 中的切片仅含少量CV，且与母体组织混杂，因此清洁极为困难且耗时。对于含有大致该量CV的组织块，需要30张切片才能满足DNA提取需求。
   4. 使用湿润的小块擦拭纸收集CV。用镊子从湿润的擦拭纸上撕下一小片，并用其收集CV。
   5. 将附着有CV的擦拭纸片放入已标记的1.5 mL离心管中。
   6. 尽量减少本步骤中擦拭纸的使用量，过多可能堵塞DNA提取柱，从而降低最终获得的DNA量。平均而言，每个样本使用的擦拭纸小片应少于七片。若因CV量较大而无法实现，则应将样本分装至两个离心管中，以利于后续提取。

图1：用于基因分型的代表性切片。 上图：需要“清理”以去除母体组织的切片。下图：同一张切片在清理后，仅含有用于DNA提取的绒毛膜绒毛（CV）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：基因分型代表性切片。 上图：需要“清理”以去除母体组织的切片。下图：同一张切片在清理后，仅含有用于DNA提取的绒毛膜绒毛（CV）。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 按照 FFPE 样本 DNA 提取试剂盒（材料表）的说明书进行 DNA 提取。
   注意：某些试剂盒建议在最终洗脱时使用 15−20 µL 洗脱缓冲液。根据经验，使用 15 µL 洗脱缓冲液对大多数样本效果良好。可根据需要以原始 DNA 储备液进行稀释。

6. DNA 定量
   1. 使用实验室分光光度计设备，加入 1 µL DNA 样品，测定其在 260 nm 处的吸光度以进行定量。
   2. 将 1 µL DNA 加样至 2% 琼脂糖凝胶上，以 80−100 V 的电压进行凝胶电泳，用于定性评估。
   3. 根据步骤 1.6.1 和 1.6.2 的结果，选择用于多重短串联重复序列（STR）聚合酶链式反应（PCR）扩增的 DNA 体积。后续 PCR 扩增中建议至少使用 1000 ng 的 DNA。
      注意： 图 3 展示了典型的凝胶结果示例，以及根据分光光度计测定得到的 DNA 浓度，并推荐了后续多重 STR PCR 所需的 DNA 溶液体积。

图3：DNA定量的代表性凝胶图。 图中包含使用分光光度计测定的每种DNA的浓度，以及用于多重PCR的DNA用量。请点击此处查看该图的放大版本。

7. PCR 扩增
   1. 使用多重 STR 系统（材料表）进行荧光微卫星基因分型。
   2. 采用 图 4 所示的 PCR 条件，使用多重 STR 系统（材料表）进行 PCR 扩增。
      注意： 本多重 STR 系统中使用的引物如下：D18S51、D21S11、TH01、D3S1358、Penta E、FGA、TPOX、D8S1179、vWA、Amelogenin、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818 和 Penta D。

图4：多重STR系统的PCR循环条件。 请点击此处查看此图的放大版本。

8. 通过毛细管电泳分离PCR产物。
   1. 将每个扩增样品的1 µL与0.5 µL多重系统内部标准片段以及9.5 µL高纯度去离子甲酰胺混合（材料表）。
   2. 使用适用于该仪器和多重系统荧光染料组合的分离基质（材料表），在毛细管电泳仪（材料表）上运行样品。

9. 数据分析
   1. 使用DNA片段分析软件分析数据，并将POC等位基因与亲本等位基因进行比较，以确定其来源。
   2. 建立一个大小标准。
      注意：这使得软件能够识别在多重STR系统中使用的分子量标记（ladder），并根据该标记为扩增子分配碱基对。以下步骤针对某一特定软件（材料表），但也可为设置其他类型软件提供参考。
      1. 打开软件，点击新建项目，然后点击新建大小标准。
      2. 为大小标准命名（例如，ABI_600）。
      3. 在名为输入新的大小标准定义的框中输入以下数值：60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600。然后点击添加大小。
         注意：输入的数字将显示在右侧名为当前大小标准定义的框下方（见图5）。
      4. 点击保存。
   3. 要导入并分析文件，请点击添加文件，选择要分析的fsa文件，点击添加所选文件，然后点击确定。接着执行以下步骤：
      1. 找到大小标准列，并选择ABI_600（或您为大小标准指定的其他名称）。
      2. 在分析方法下，点击定尺默认 - NPP，然后点击绿色的分析按钮。
      3. 文件现在已准备好查看。根据需要调整查看选项以显示数据。
   4. 故障排除——分析方法
      注意：软件有时可能无法正确识别峰或对其进行正确对齐。这种情况通常发生在峰过高或过低时。以下两种分析方法可用于纠正此类问题，在重新检测样本前应优先尝试。
      1. 适用于高信号峰的分析方法1：
         1. 点击新建分析方法，将其命名为高信号峰（或根据个人偏好命名）。
         2. 点击范围，然后在分析和定尺中选择部分范围。接着在起始点和起始大小处输入100。
         3. 对于终止点，输入10,000；对于终止大小，输入1000。
         4. 然后点击最小峰高，修改数值，使各颜色的峰阈值如下：蓝色：50；绿色：50；黄色：20；红色：100；橙色：5000。
         5. 保存新的分析方法。
      2. 适用于低信号峰的分析方法2：
         1. 点击新建分析方法，将其命名为低信号峰（或根据个人偏好命名）。
         2. 点击范围，然后在分析和定尺中选择部分范围。接着在起始点和起始大小处输入100。
         3. 对于终止点，输入10,000；对于终止大小，输入1000。
         4. 然后点击质量标记，修改通过范围，使其显示为从0.5到1；修改低质量范围，使其显示为从0.0到0.0；将假设线性设置为：从(bp) 100.0到(bp) 800.0。
         5. 保存新的分析方法。
            注意：现在可以通过在分析方法下选择低信号峰或高信号峰，然后点击绿色的分析按钮，重新分析文件。

图5：显示大小标准编辑器的截图。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 流式细胞术

1. 选择理想的石蜡包埋组织块
   1. 利用苏木精-伊红（H&E）染色切片和光学显微镜，选择一个约50−70%组织成分为绒毛（CV）的石蜡包埋组织块。
      注意：图6 是适用于流式细胞术分析的合适组织块的代表性示例，该组织块约由50%的绒毛组织（切片右侧）和50%的母体组织（左侧）构成。母体组织的存在至关重要，因其可作为二倍体峰的内部对照。
   2. 对于绒毛成分未达理想比例的组织块，可在切片过程中进行绒毛富集。具体操作为：根据相应H&E染色切片判断新鲜切片中哪一侧含有更多的绒毛组织，然后使用刀片切除需丢弃的另一侧，以实现绒毛富集。
      注意：图7 显示了一个绒毛组织含量不足以进行流式细胞术分析的组织块。对于此类组织块，需在切片时丢弃绒毛较少的一半，以提高绒毛组织相对于母体组织的比例，如图所示。务必多切若干切片，以弥补被丢弃的部分。

图6：苏木精-伊红（H&E）染色切片，显示一个适用于流式细胞术的POC组织块。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：代表流式细胞术分析中较难处理组织块的 H&E 染色切片。 该代表性 H&E 染色切片显示，仅应使用此切片的下半部分进行流式细胞术分析，以富集静脉导管（CV）组织。标注区域标记为“CV”，主要由静脉导管（CV）构成。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 切片
   1. 将组织块置于冰上15分钟，以利于切片操作。
   2. 使用质量最佳的FFPE组织块，用切片机切取4张厚度为50 µm的切片（或2张厚度为100 µm的切片）。
      注意：用于流式细胞术时，建议使用较厚的切片。
   3. 若无法获得理想的FFPE组织块，仍应尽量保持绒毛（CV）与母体组织的比例。例如，若组织块中仅有30%为CV组织，其余为母体组织，则应去除至少一半含母体组织的切片部分，并增加切片数量以进行补偿（参见图7）。
   4. 将切片放入已标记的15 mL离心管中。
      注意：务必用胶带覆盖标签，因为在下一步中使用的有机试剂可能会溶解并去除油墨。
3. FFPE组织流式细胞术操作流程
   1. 脱蜡与复水
      1. 在通风橱内进行以下洗涤步骤（表3）。
      2. 按照表3所示顺序，向15 mL离心管中加入6 mL相应试剂，将切片在各试剂中孵育指定时间后，使用真空抽吸装置和玻璃巴氏吸管移除试剂。
      3. 每一步之间，先将巴氏吸管浸入70%乙醇，再浸入蒸馏水中，然后进行下一步操作。
      4. 操作时需格外小心，避免随试剂移除组织碎片。可将15 mL离心管倾斜至60度角，以便抽吸液体试剂时避免吸入组织。
         注意：废弃液体含有二甲苯，应弃置于二甲苯废液容器中。
   2. 溶液配制
      1. 将2 g柠檬酸溶于1 L双蒸水中配制柠檬酸溶液，调节pH至6，4 °C保存。
      2. 将0.01 g胃蛋白酶溶于2 mL千分之九的NaCl溶液（pH 1.64）中，配制胃蛋白酶溶液。此剂量适用于一个样本。
         注意：胃蛋白酶具有毒性，易扩散并形成气溶胶。操作其粉末时应佩戴口罩，使用后需彻底清洁工作区域。
      3. 单个样本的碘化丙啶（PI）-核糖核酸酶A溶液配制。
         1. 将50 µL PI与450 µL PBS混合（稀释10倍）。
         2. 向混合液中加入50 µL核糖核酸酶A（1 mg/mL）。全程避光保存，用铝箔包裹。
   3. 消化与染色
      1. 向15 mL离心管中加入4 °C的柠檬酸溶液，置于80 °C水浴中孵育2小时。
      2. 让溶液自然冷却至室温（约15分钟），然后移除柠檬酸溶液。
      3. 加入6 mL 1x PBS，涡旋混匀，静置1–2分钟使组织沉降至管底，再用真空抽吸装置和玻璃巴氏吸管移除1x PBS。
      4. 加入1 mL预热至37 °C的胃蛋白酶溶液，置于37 °C干浴中孵育30分钟，每10分钟涡旋一次。在孵育的最后10分钟内配制PI-核糖核酸酶A溶液。
      5. 加入6 mL 1x PBS，涡旋混匀，静置1–2分钟使组织沉降，再用真空抽吸装置和玻璃巴氏吸管移除1x PBS。
      6. 加入550 µL PI-核糖核酸酶A溶液，将样本置于37 °C干浴中孵育30分钟。
         注意：此时样本可用铝箔包裹后于4 °C过夜保存至次日早晨。
      7. 将溶液通过48 µm滤网过滤，滤液收集至聚苯乙烯圆底管中（可用于流式细胞仪检测）。使用镊子将一块5 cm × 5 cm的滤网置于管口上部，使液体可通过滤网滴入管内。
         注意：样本现已准备好进行流式细胞术检测。在检测前应始终保持避光状态。
   4. 在机构流式细胞仪平台技术人员协助下运行样本。
      注意：使用PE通道检测PI染色的DNA，采集时流速应设置为慢速。电压应调整至使二倍体峰在PE-A横轴上大致位于200处，以便于数据分析与解读。每个样本至少记录20,000个事件。

所用试剂（每种6 mL）	时间
1) 二甲苯	2 × 10 min
2) 100% 乙醇	2 × 10 min
3) 95% 乙醇	10 min
4) 70% 乙醇	10 min
5) 50% 乙醇	10 min
6) 蒸馏水	2 × 10 min

表3：脱蜡和复水所用的试剂及持续时间。

4. 流式细胞术数据分析
   1. 使用流式细胞术分析软件进行数据分析（材料表）。
      注意：以下步骤针对某一特定软件（材料表），但也可为设置其他类型软件提供参考。
      1. 在流式细胞仪上运行样本后，下载 FCS 2.0 文件用于分析。
      2. 打开流式细胞术分析软件，点击 文件 | 新建文档。
      3. 点击 直方图 图标（），然后拖动指针绘制一个矩形。
      4. 浏览选择 FCS 文件，然后点击 打开。在横轴上点击 FCS-A，然后选择 PE-A。
      5. 点击 点图图标（），然后拖动指针在直方图下方创建另一个矩形。随后浏览并选择与直方图相同的 FCS 文件。
      6. 将点图的横轴更改为 PE-A，纵轴更改为 PE-W。
         注意：图8A 展示了此时图表的显示效果。
      7. 点击 区域图标（），在点图上绘制一个矩形区域，起始位置在二倍体峰之前（如 图8B 中横轴约 100 处），结束位置在横轴约 700 处，如 图8B 中点图所示。
         注意：图8 中的二倍体峰横轴位置约为 200。该数值为任意设定，因样本通过流式细胞仪记录时仅为便于分析和结果解读而选择。
      8. 点击 图表 | 编辑区域/门控，然后在 策略 下 G0 单元格旁边的单元格中输入 R0，然后点击 关闭。
      9. 在直方图任意位置点击，然后选择 图表 | 格式化图表/叠加。在 门控 下选择 G0 = R0，然后点击 确定。
         注意：此为门控步骤，有助于更清晰地观察倍性峰。此时直方图应与 图8B 中的直方图相似。可通过调整第 2.4.1.7 步绘制的矩形区域，进一步聚焦于点图中的特定区域。
      10. 为标注图表，点击 文本区域图标（），然后拖动指针在文档顶部创建一个文本框，并输入以下信息：患者编号、POC 编号以及所用组织块（因单个 POC 可能包含多个组织块）、组织块中存在的 CV 百分比、运行样本时使用的电压，以及日期。

图8：显示代表性样本未设门（A）和设门后（B）的直方图与点图的截图。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

由于葡萄胎组织的复杂性及其可能存在不同基因型，必须进行严格的分析，并采用多种方法，如形态学评估、p57免疫组织化学、微卫星基因分型、流式细胞术和FISH。例如，一名患者（1790号）因两次被诊断为部分性葡萄胎（PHM）而转诊，仅通过对清宫组织（POCs）进行微阵列分析发现其均为三倍体。因此，该患者被诊断为复发性部分性葡萄胎（PHM）。然而，对其两次所谓的“PHM”组织以及患者及其配偶的DNA进行微卫星基因分型后发现，患者的第一个葡萄胎为三倍体双精受精来源（图9A），而第二个“PHM”则具有三倍体卵源性（digynic）基因型（图9B），因此并非真正的PHM，而是一次非葡萄胎性流产。

第一个标记物在 图9

讨论

HM are abnormal human pregnancies with heterogeneous etiologies and have different histological and genotypic types, which makes their accurate classification and diagnosis challenging. Histopathological morphological evaluation was often proven inaccurate and is therefore unreliable on its own to classify HM into CHM and PHM and distinguish them from non-molar miscarriages. Therefore, an accurate diagnosis of HM requires the use of other methods such as multiplex microsatellite DNA genotyping, ploidy analysis by flow cy...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACS Canto II	BD BioSciences	338960
毛细管电泳仪：Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA 分析仪	Applied Biosystems	313001R	由加拿大基因组应用中心提供服务 (http://www.tcag.ca)
柠檬酸	Sigma	251275
Cytoseal 60 组织病理学封片介质	Fisher	23244257
伊红Y储备液（1%）	Fisher	SE23-500D
FCSalyzer - 流式细胞术分析软件	SourceForge	-	https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen 试剂盒	Qiagen	80234
镊子	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	11295-51	用于切片和清洁过程
冰醋酸（浓）	Sigma	A6283-500mL
玻璃盖玻片：Cover Glass	Fisher	12-541a
苏木精	Fisher	CS401-1D
高纯度去离子甲酰胺：Hi-Di Formamide	Thermo Fisher	4311320
IHC 平台：Benchmark Ultra	Roche	-
Kimwipes 擦拭纸	Ultident	30-34120
切片机	Leica	RM2135
切片机刀片	Fisher	12-634-1C
Nitex 过滤网，48 μm	Filmar	74011	http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ；其他任何滤膜均可使用，但此产品来自非科研公司，价格低廉且效果良好
p57 抗体	Cell Marque	457M
巴斯德移液管	VWR	53499-632
PCR 仪	Perkin Elmer, Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0	Applied Biosystems	4381867	基因分型分析软件。
来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶	Sigma	P7012
聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352058
带正电荷载玻片：Superfrost Plus 25×75 mm	Fisher	1255015
PowerPlex 16 HS 系统	Promega Corporation	DC2102
碘化丙啶	Sigma	P4864
来源于牛胰腺的核糖核酸酶A	Sigma	R4875
分离基质：POP-7 聚合物	Thermo Fisher	4352759
UltraPure 琼脂糖	Fisher	16500-500
二甲苯	Fisher	X3P1GAL