福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织微卫星DNA基因分型与流式细胞术倍性分析

摘要

葡萄胎是一种具有异质性病因的异常人类妊娠，可根据其形态学特征及葡萄胎基因组的亲本来源进行分类。本文详细描述了对福尔马林固定石蜡包埋的葡萄胎组织进行多重微卫星DNA基因分型和流式细胞术分析的实验方案，并介绍了结果的解读与整合方法。

摘要

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征为滋养层细胞过度增殖和胚胎发育异常。根据显微镜下的形态学评估，HM可分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）。这两种类型还可根据亲本对葡萄胎基因组的贡献进一步细分。通过形态学和基因型分析对HM进行分类，对于患者的临床管理以及对该疾病病理机制的基础理解至关重要。已有充分文献表明，HM的形态学分析存在较大的观察者间差异，单独依靠形态学不足以准确地将HM分类为CHM或PHM，也难以将其与水肿性非葡萄胎流产相区分。基因分型分析通常在来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的妊娠产物组织及其DNA上进行，但这类样本质量欠佳，可能导致错误结论。本文提供了针对FFPE葡萄胎组织进行多重基因分型和流式细胞术分析的详细实验方案，并阐述了这些方法的结果解读、常见问题的排查，以及如何将其与形态学评估、p57^KIP2免疫组织化学和荧光原位杂交（FISH）技术相结合，以实现准确且可靠的诊断。作者在此分享了过去10年中对约400例妊娠产物分析所积累的方法与经验。

引言

葡萄胎（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是胚胎发育异常、滋养层细胞过度增殖以及绒毛膜绒毛（CV）的水泡样变性。传统上，葡萄胎仅根据形态学评估分为两种类型：完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）¹。然而，研究表明，仅依靠形态学评估不足以将葡萄胎准确分类为这两种亚型（CHM 和 PHM），也难以将其与非葡萄胎性流产相区分^2,3,4。

由于完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）的恶性倾向不同，因此准确判断葡萄胎的基因型对于为患者提供恰当的随访和管理至关重要。因此，在过去几十年中，已开发并发展出多种方法，用于确定葡萄胎组织的亲本来源，从而实现对葡萄胎的正确分类。这些方法包括核型分析、染色体带型多态性分析、人类白细胞抗原（HLA）血清学分型、限制性片段长度多态性分析、串联重复序列可变数目分析、微卫星基因分型、流式细胞术以及p57^KIP2免疫组织化学染色。这些技术使得可根据基因组中亲本贡献的来源对葡萄胎妊娠进行准确分类，具体如下：完全性葡萄胎（CHM）为二倍体，其来源为单精子或双精子的雄性基因组；而部分性葡萄胎（PHM）为三倍体，其中99%为双精子来源，1%为单精子来源⁵

方案

本研究已获得麦吉尔大学机构审查委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书，同意参与本研究，并同意从各病理科获取其福尔马林固定石蜡包埋的妊娠产物（POCs）。

注意：尽管可通过流式细胞术进行基因分型和倍性测定的方法有多种，但此处提供的方案仅描述了每种分析使用一个平台的一种方法。

1. 基因分型

1. 选择最佳的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块
   1. 针对每个妊娠产物（POC）的FFPE样本，按照第1.2和1.3节所述方法，为每个可用的组织块制备4 µm厚的苏木精-伊红（H&E）染色切片，用于显微镜下的形态学评估。
   2. 使用H&E染色切片和光学显微镜，选择含有最多绒毛组织（CV）的FFPE组织块；如有可能，优先选择绒毛组织与母体组织分离、未混杂的组织块。
2. 切片
   1. 将选定的组织块置于冰上15分钟，以利于切片操作。
   2. 调整切片机，分别切割4 µm厚的切片用于显微镜形态学评估，以及10 µm厚的切片用于DNA提取。
   3. 将冷却后的组织块放入切片机中，从每个组织块切取一张切片用于H&E染色，从选定的组织块中切取10−30张切片（根据组织块中绒毛组织的含量而定）用于D....

结果

由于葡萄胎组织的复杂性及其可能存在多种基因型，必须进行严格的分析，并采用多种方法，如形态学评估、p57免疫组织化学、微卫星基因分型、流式细胞术和FISH。例如，一名患者（1790号）因两次被诊断为部分性葡萄胎（PHM）而转诊，仅通过对产物组织（POCs）的微阵列分析发现其为三倍体。因此，该患者被诊断为复发性部分性葡萄胎（PHM）。然而，对其两次所谓的“PHM”样本以及患者及其配偶的DNA进行微卫星基因分型后发现，患者的第一个葡萄胎为三倍体双精受精来源（图9A），而第二个“PHM”则具有三倍体双母源基因型（图9B），因此并非真正的PHM，而是一次非葡萄胎性流产。

第一个标记物在 图9A

讨论

葡萄胎是一种具有异质性病因的异常人类妊娠，其组织学和基因型类型多样，导致准确分类和诊断较为困难。组织病理学形态学评估常被证明不够准确，因此单独依靠该方法对完全性葡萄胎（CHM）和部分性葡萄胎（PHM）进行分类，并将其与非葡萄胎性流产相区分并不可靠。因此，葡萄胎的准确诊断需要结合其他方法，如多重微卫星DNA基因分型、流式细胞术进行倍性分析、FISH进行倍性分析，以及p57^KIP2免疫组织化学检测。这些方法各自具有一定的局限性和优势。

多重基因分型与流式细胞术的局限性与优势

母体污染是处理FFPE组织时最常见的问题之一，可能导致误诊，因此强调了将母体组织与产物组织（POC）分离的重要性。识别母体污染对于预判基因分型峰的特征及其结果解读具有重要意义。如果污染程度过高而影响结果的可靠判读，则应重复DNA的分离与提取过程，并格外注意彻底清除所有可能的母体组织。在组织形态不清晰的区域，应优先去除这些区域，以最大限度地降低母体污染的风险。本方案所述方法的第一个优势在于，除了成本较低外，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACS Canto II	BD BioSciences	338960
毛细管电泳仪：Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA 分析仪	Applied Biosystems	313001R	由加拿大基因组应用中心提供服务 (http://www.tcag.ca)
柠檬酸	Sigma	251275
组织病理学封片介质：Cytoseal 60	Fisher	23244257
伊红Y储备液（1%）	Fisher	SE23-500D
FCSalyzer - 流式细胞术分析软件	SourceForge	-	https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/
FFPE Qiagen 试剂盒	Qiagen	80234
镊子	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	11295-51	用于切片及清洗过程
冰乙酸（浓）	Sigma	A6283-500mL
玻璃盖玻片：Cover Glass	Fisher	12-541a
苏木精	Fisher	CS401-1D
高纯度去离子甲酰胺：Hi-Di Formamide	Thermo Fisher	4311320
免疫组化平台：Benchmark Ultra	Roche	-
吸水纸（Kimwipes）	Ultident	30-34120
切片机	Leica	RM2135
切片机刀片	Fisher	12-634-1C
Nitex 滤网，48 μm	Filmar	74011	http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ；其他滤膜亦可使用，但此产品来自非科研公司，价格低廉且效果良好
p57 抗体	Cell Marque	457M
巴斯德移液管	VWR	53499-632
PCR 仪	Perkin Elmer, Applied Biosystems	GeneAmp PCR System 9700
PeakScanner 1.0	Applied Biosystems	4381867	基因分型分析软件。
来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶	Sigma	P7012
聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352058
带正电荷载玻片：Superfrost Plus 25×75 mm	Fisher	1255015
PowerPlex 16 HS 系统	Promega Corporation	DC2102
碘化丙啶	Sigma	P4864
来源于牛胰腺的核糖核酸酶A	Sigma	R4875
分离基质：POP-7 聚合物	Thermo Fisher	4352759
UltraPure 琼脂糖	Fisher	16500-500
二甲苯	Fisher	X3P1GAL