从患者前列腺癌骨转移标本及其异种移植物中提取的三维（3D）有机物的建立与分析

摘要

患者BMPC标本和骨转移性前列腺癌异种移植物的三维培养，保持其原始肿瘤的功能异质性，导致囊肿、球形和复杂的肿瘤状有机体。本手稿为异质患者衍生样本的 3D 培养及其使用 IFC 进行分析提供了优化策略和方案。

摘要

人类患者肿瘤标本的三维（3D）培养和前列腺癌患者衍生异种移植（PDX）模型，称为患者衍生器官（PDO），是研究前列腺癌的肿瘤发生和转移。它们的主要优点是，与不传统的细胞系相比，它们保持了原始组织独特的基因组和功能异质性。此外，PDO的3D培养物可用于预测药物治疗对个别患者的影响，是向个性化医学迈出的一步。尽管有这些优点，但少数组通常使用此方法，部分原因是 PDO 培养条件的广泛优化，这可能需要不同的患者样本。我们之前已经证明，我们的前列腺癌骨转移PDX模型，PCSD1，重述了供体患者的骨转移对抗雄激素治疗的抵抗力。我们使用 PCSD1 3D 有机体进一步描述抗雄激素抵抗机制。在概述当前发布的 PDX 和 PDO 模型研究之后，我们描述了在优化培养条件下使用圆顶或浮动基底膜（例如 Matrigel）球体（例如 Matrigel）的 PDO 3D 培养的分步协议。介绍了本体缝合成像和细胞处理，用于本体。该协议可进一步针对其他应用进行优化，包括西印、共培养等，并可用于探索与耐药性、肿瘤发生、转移和治疗相关的3D培养PDO特性。

引言

三维培养的有机物已经引起注意，因为他们有潜力重述其原始组织^{1，2，3，4，5}的体内结构，细胞功能和遗传特征。最重要的是，从患者肿瘤组织或患者衍生异种移植（PDX）模型建立的3D类有机体提供了宝贵的机会，以了解细胞信号机制对肿瘤发生，并确定药物治疗对每个细胞群^的影响，每个细胞群6，7，8，9，10，11，12，13。Drost^{等人为建立}人类和小鼠前列腺器官制定了标准规程，在泌尿学领域得到了广泛的应用。此外，已作出重大努力，以进一步表征3D有机体，并了解肿瘤发生和转移^{4，12，14，15}的详细机制。除了以前为 3D 有机体培养建立且被广泛接受的协议之外，我们在这里还介绍了 PDO 的 3D 区域性的分步协议，在优化的培养条件下使用三种不同的点胶方法。

在这份手稿中，3D有机体被确立为骨转移性前列腺癌（BMPC）的体外模型。用于这些培养的细胞来自前列腺癌圣地亚哥（PCSD）系列，直接来自患者前列腺癌骨转移肿瘤组织（PCSD18和PCSD22）或患者衍生异种移植（PDX）肿瘤模型（样本命名为PCSD1、PCSD13和PCSD17）。由于前列腺癌细胞的自发性骨转移在基因工程小鼠模型¹⁶中很少见，我们利用直接将人类肿瘤细胞注射到雄性^{Rag2-/----/-小鼠}中建立了骨转移性前列腺癌的PDX模型^17。

一旦从异质患者肿瘤细胞或患者衍生的异种移植物中建立3D有机体，确认其作为前列腺肿瘤细胞的身份并确定其在3D器官培养物中的表型至关重要。免疫荧光化学（IFC）允许在每个细胞中原位显示蛋白质表达，通常指示特定细胞群^2、4的潜在功能。一般来说，包括组织和细胞在内的绝大多数样品的IFC协议是简单明了的，并且完全优化。然而，细胞密度和器官的数量可以明显低于传统培养物。因此，国际有机物的国际金融委员会协议要求采取额外步骤，以确保样品中所有有机物的正确处理和嵌入石蜡。我们描述了腺苷预嵌入工艺的其他步骤，并介绍了在幻灯片上标记切片有机体的位置的提示，提高了IFC在有机物上的成功率，特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。

方案

这项研究是严格按照《加州大学圣地亚哥分校机构审查委员会指南》中的建议进行的。IRB #090401 批准从 UCSD 机构审查委员会 （IRB） 收集手术标本从患者用于研究目的。获得每位患者的知情同意，并取得手术性骨前列腺癌转移标本，从股骨病理性骨折的矫形修复中获得。动物协议是在加州大学圣地亚哥分校（UCSD）动物福利和机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的协议#S10298下执行的。细胞从机械和酶分离的患者肿瘤组织被注射到6至8周大的雄性Rag2-/-;αc-/-小鼠如前所述^17。异种移植肿瘤体积是利用体内生物发光成像系统和卡钳测量确定的。当肿瘤生长达到2.0厘米（IACUC批准的最大允许大小）时，肿瘤被收获为3D器官建立。

注:图1显示了建立3D有机体的工作流程和实验过程每个步骤的协议编号。

1. 治疗患者衍生异种移植（PDX）肿瘤组织

注:这是从异种移植小鼠模型衍生的肿瘤的器官建立的第一步。该协议改编自Drost等人之前发表的^5，我们已经修改了培养条件，包括血清补充到有机体培养物。

1. 处理肿瘤标本，如下所述。
   1. 敏丝肿瘤样品至1-3mm³大小片，在室温下用10mL细胞解散溶液消化样品45分钟。
   2. 要终止消化，向样品中添加 20 mL 的 DMEM 完整介质。
   3. 通过 70 μm 细胞过滤器过滤悬浮液。使用无菌柱塞法兰将任何剩余组织推至 70 μm 细胞过滤器的顶部。
   4. 在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
   5. 用新鲜的adDMEM完整介质清洗细胞颗粒三次。将洗涤和重新悬浮的介质体积与表 3中建议的介质体积相匹配。例如，对于 24 孔板培养条件，洗涤的体积应为 500 μL。
      注:如表3所示，该协议适用于不同的区域性条件。
   6. 使用 Trypan 蓝色染料和血细胞计确定最终细胞计数。
   7. 获得细胞计数后，在 PBS 中每 2 x 10⁶肿瘤细胞中重新悬浮 80 μL 的 2% FBS 中的细胞颗粒。
   8. 每2 x 10⁶个肿瘤细胞加入20μL小鼠细胞消耗鸡尾酒。混合良好，在2-8°C下孵育15分钟。
   9. 每 2 x 10⁶肿瘤细胞在 PBS 缓冲液中调整音量至 500 μL，在 PBS 缓冲液中为 2% FBS。
      注:在2.5 mL细胞悬浮液中，可处理多达1 x 10⁷个肿瘤细胞，在一个LS柱上处理。
   10. 在磁柱分离器上加载 LS 柱，并将一个 15 mL 锥形管放在下面的机架上以收集流。
   11. 在 PBS 缓冲液中用 3 mL 的 2% FBS 冲洗每列。丢弃带洗涤流管的锥形管，并更换为新的无菌 15 mL 锥形管。
   12. 将细胞悬浮液（高达 2.5 mL 的 1 x 10⁷肿瘤细胞）添加到柱上。收集流通过，将丰富的人类肿瘤细胞。
   13. 在 PBS 缓冲区中使用 1 mL 的 2% FBS 洗涤柱两次。
       注: 一旦列为空，立即执行洗涤步骤非常重要。此外，尽量避免形成气泡。
2. 将适当的电池悬浮量与1.5 mL管进行比，用于建立所需的培养液（表3）。
3. 在 300 x g和 4 °C 下离心 1.5 mL 管 5 分钟。
4. 小心地取出并丢弃上清液。

2. 患者原发性肿瘤组织的处理

注:这是组织机构建立的第一步。

1. 遵循除小鼠细胞耗尽过程之外的所有步骤 1，这是处理患者原发性肿瘤组织所不需要的。

3. 在板上形成一个附加的圆形圆顶

注:本手稿描述了由细胞颗粒和基底膜（例如，Matrigel）混合体制成圆顶的三种方法，如图1和图2所示。在步骤2-4中，细胞和基底膜应保存在冰上，以防止地下室膜凝固。

1. 将细胞颗粒重新悬浮在适当体积的基底膜（例如，40 μL）中，用于设置24个孔板（表3）。
2. 上下轻轻移液，确保细胞在地下室膜中重新悬浮。
3. 将细胞基底膜混合物（和可选的adDMEM完整介质的10μL）的适当体积（表3）移入预加热组织培养板的中心。
4. 反转板并立即将板倒置在 CO₂细胞培养培养箱中，设定为 5% CO_2，37°C 15 分钟。这可以防止细胞沉淀和粘附在板底，同时允许基底膜凝固。
5. 将含有10μM Y-27632二盐酸的预热介质的适当体积（表3）移入每个井中。
6. 将板右侧放在 CO₂细胞培养箱内（5% CO₂，37 °C）。
7. 每 3-4 天更换一次介质。5-7天后，使用不含10μM Y-27632二盐的培养基来维持培养物。

4. 从板上的附着圆形圆顶形成浮动圆顶

1. 步骤 3.7 后，使用细胞刮刀拆下圆顶。

5. 形成浮珠

注:此协议被命名为浮珠，因为基底膜、介质和有机物的混合物看起来像珠子。

1. 切割 2 英寸 x 4 英寸石蜡薄膜。
2. 将石蜡薄膜放在 1000 μL 塑料移液器吸头盒的空吸头架顶部。
3. 轻轻按下石蜡薄膜，用戴手套的食指追踪石蜡膜，但不突破石蜡膜。
4. 用 70% 乙醇喷洒石蜡薄膜，并在细胞培养罩中打开 UV 灯，对制备的石蜡薄膜进行至少 30 分钟的消毒。
5. 制备细胞和20μL基底膜的混合物。播种密度可以是每个圆顶50，000 -250，000个细胞。
6. 将从步骤1或2和20μL的基底膜加工的细胞混合物移入制备的石蜡膜中形成的divot的模具中。
7. 在基底膜中重新悬浮细胞颗粒，在制备的石蜡薄膜中移液细胞悬浮液。
8. 将凝固的珠子和石蜡薄膜放入 6 孔板中。6 孔板中的一口孔可容纳多达 5 个珠子。
9. 含有10μM Y-27632二氯化物的预加热介质3-5 mL，同时轻轻刷掉石蜡薄膜上的珠子。
   注:作为最小音量，建议使用 3 mL。对于每口井的最大珠数 （N=5），建议使用 5 mL 的介质。
10. 将板放在_CO2培养箱内（5% CO₂，37 °C）。
11. 每3-4天更换一次有机体介质。5-7天后，使用不含10μM Y-27632二盐的培养基来维持培养物。

6. 使用显微镜⁸进行体内器官图像拼接

注:某些显微镜无法到达细胞板的外周（边缘壁）;因此，我们建议在图像拼接时使用靠近细胞板周长的孔。

1. 将细胞培养板置于键显显微镜中的板支架中。
2. 将镜头放在目标圆顶的中心。
3. 通过选择帧数来设置自动拼接过程。例如，可以选择 3 x 3 或 5 x 5 生成 9 个图像或总共 25 个图像。
4. 按捕获按钮启动成像过程。
5. 打开图像查看器软件并加载步骤 4 拍摄的一组图像。
6. 单击"图像拼接"以创建高分辨率拼接图像。
   注: 可通过手动或自动设置来对焦单元执行串行 9 或 25 图像的捕获。

7. 组织学的有机体处理:腺糖自旋方法

注:此协议改编自弗拉乔吉安尼斯等人以前的出版物^。我们增加了一个步骤，涉及甘蔗糖嵌入成功嵌入所有群体的有机体。

1. 从井中取出现有介质。小心不要吸气地下室膜圆顶。
2. 添加相等（等于从步骤 1 中删除的介质体积）的细胞恢复溶液，并在 4°C 下孵育 60 分钟。
3. 使用移液器拆除地下室膜圆顶，并使用移液头粉碎地下室膜圆顶。在 1.5 mL 管中收集分离的圆顶和细胞恢复溶液。
4. 在300 x g和4°C下离心5分钟。
5. 取出上清液（细胞恢复溶液）。将所有上生物保存在单独的管中，直到最终颗粒步骤中确认有机物的存在时结束。
6. 添加所需的冷PBS体积（表3），并轻轻上下移液以机械干扰颗粒。
7. 在300 x g和4°C下离心5分钟。
8. 拆下上清液 （PBS）。
9. 将颗粒固定在匹配体积中（例如，24 孔板培养条件下的一粒颗粒为 500 μL，表 3）为 4% PFA，在室温下 60 分钟。
10. 固定后，在300 x g和4°C下离心5分钟。
11. 拆下上清液 （PFA）。
12. 用匹配的体积（例如，从24孔板培养条件中一粒颗粒（例如，500 μL）清洗，表3）的PBS和离心机在300 x g和4°C下5分钟。
13. 准备温暖的甘蔗（PBS中2%的甘蔗）。
    注:此处，冷冻部分的细胞颗粒可在OCT化合物的200μL中直接重新悬浮，无需在协议7中采取进一步步骤。
14. 在200 μL的甘蔗素（PBS中为2%）中重新悬浮细胞颗粒。
    1. 加入甘草后，使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头，从 1.5 mL 管壁轻轻分离细胞颗粒。如图3所示，如果细胞颗粒没有物理上与1.5 mL管壁分离，那么在甘蔗素嵌入过程中有失去全部或部分细胞颗粒的风险。
15. 等待，直到PBS中的2%甘蔗完全凝固。
16. 使用连接到 1 mL 注射器的 25 G 针头从 1.5 mL 管中分离凝固的甘草块。
17. 将含有细胞颗粒的分离的甘蔗组转移到新的1.5 mL管中。
18. 用70%EtOH填充管，并使用传统的组织脱水和石蜡嵌入方案进行进一步。

8. 有机体的组织学和免疫荧光细胞化学（IFC）

1. 选择组织学或国际金融公司的幻灯片。
2. 在开始染色过程之前，找出细胞在幻灯片上的位置，并使用标记在幻灯片上的单元格周围画一个圆圈。
3. 在幻灯片的边缘或板周围绘制周长，以及位于实验室笔记本中幻灯片上的圆圈的位置，以记录其位置。
4. 执行所需的染色。
   注:在此过程中，标记的圆圈消失，因为常规制造商对化学品没有抵抗力。甚至一些信息学永久标记也可能在染色过程中被抹去。
5. 染色过程结束后，将幻灯片放在实验室笔记本上的绘图上，以查找幻灯片上细胞的位置。

结果

3D有机体成功地建立了从患者衍生异种移植（PDX）模型骨转移前列腺癌（BMPC）以及直接从患者骨转移前列腺癌组织（图4）。简单地说，我们的BMPCPDX模型是通过将肿瘤细胞注射到雄性^{Rag2-/----c-/-}小鼠中建立的，然后PDX肿瘤被采集和处理，如本手稿所述。如图4所示，PCSD系列的PDX肿瘤组织产生了具有差异表型的3D类有机体，这些表型表现为囊肿、球形和更高的复杂度有机体，使用该协议形成。

从25个高分辨率10倍放大图像缝合的图像显示了整个圆顶的地下室膜和有机物（图5）。使用图像分析软件，可以选择整理大于特定大小的细胞或细胞簇，或手动选择球形或囊肿。

将胶体培养物嵌入的胶合物和提示的步骤，在幻灯片上标记被切片的有机体的位置，可提高在有机体上执行IFC的成功，特别是当有机体样本的细胞密度低于预期时。...

讨论

从患者骨转移性前列腺癌细胞中提取的3D器官仍然相对少见。在这里，我们描述了成功建立BMPC串行3D患者衍生器官（PDO）的策略和进一步优化的协议。此外，还描述了用于保护具有较低细胞密度的样品中的有机物的协议，用于IFC和IHC分析。囊肿、球形和更复杂的有机体形式的差分表型表明，该协议提供了培养条件，允许患者的异体肿瘤细胞群保持其细胞表型和结构。因此，本文描述的培养条件，改编自Drost等人⁵与FBS血清补充修改，已被证明是最适合患者BMPC衍生细胞的培养，以便它们保持其主体内和学科间异质性（手稿在准备）。

我们的优化方案适用于从初级或 PDX 肿瘤组织到设置 3D 有机体培养的有限起始材料的多个端点的实验设置。一般来说，从患者原发性肿瘤组织建立3D器官比从PDX肿瘤组织建立3D器官要少。因此，建议从患者原发性肿瘤组织中建立3D有机体，其细胞的播种密度（高达四倍）高于PDX肿瘤。在肿瘤组织处理过程中提高细胞产量的一种方法是，通过过滤细胞悬浮液再次通过滤网，恢复70μm细胞过滤器顶部的任何肿瘤组织剩余。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器	Gilson	F123602
1 mL 注射器	BD 注射器	329654
1.5 mL 管	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G 针	BD PrecisionGlide 针	头 305122
4% 多聚甲醛 （PFA）	Alfa Aesar	J61899
70% 乙醇 （EtOH）VWR		BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innovative Cell Technologies， Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
琼脂糖	Lonza	50000
抗体 - 细胞角蛋白 5	Biolegend	905901
细胞角蛋白 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
生物发光成像系统，IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
细胞培养板 - 24 孔	Costar	3524
细胞培养板 - 48 孔	Costar	3548
细胞培养板 - 6 孔	Costar	3516
细胞解离溶液，Accumax	Innovative Cell Technologies， Inc.	AM105
细胞回收解决方案	康宁	354253
细胞刮刀	Sarstedt	83.180
细胞过滤器	Falcon （Corning）	352350
CO2 培养箱	Fisher Scientific	3546
DAPI	载体 Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
镊子	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS 色谱柱	Miltenyi	130-0420401
磁性色谱柱分离器：QuadroMACS 分离器	Miltenyi	130-090-976
标记物	VWR	52877-355
基质胶（生长因子降低）	Mediatech Inc. （Corning）
基质胶（高浓度）	BD（Fisher Scientific）	CB354248
显微镜成像软件，Keyence	BZ-X800（最新软件）BZ-X700（旧软件）
显微镜，Keyence	BZ-X700（型号2016-2017）/BZ-X710（型号2018-2019）
小鼠细胞耗竭试剂盒	Miltenyi	130-104-694
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-5G
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT 化合物	组织-Tek	4583
封口膜	美国国家罐	N/A
笔-Strep	Mediatech Inc. （Corning）	30-002-CI-1
用于 1 mL 的移液器吸头（蓝色吸头）	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
柱塞（来自 3 mL 注射器）	BD 注射器	309657
前列腺素 E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
小桌面离心机	ThermoFisher Scientific	75002426
水浴	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817