使用天然多酚姜黄素对脑组织中淀粉样斑块进行标记与成像

摘要

姜黄素是标记和成像脑组织中β-淀粉样蛋白斑块的理想荧光探针，因其对β-淀粉样蛋白具有优先结合性，且在结构上与其他传统的淀粉样蛋白结合染料具有相似性。与传统方法相比，姜黄素可用于更高效且更经济地标记和成像β-淀粉样蛋白斑块。

摘要

β-淀粉样蛋白（Aβ）在细胞外和细胞内的沉积是阿尔茨海默病（AD）的标志性病理特征之一。因此，检测AD脑组织中Aβ的存在是开发预防AD进展新疗法的重要工具。已有多种经典的淀粉样蛋白结合染料、荧光染料、成像探针以及Aβ特异性抗体被用于在AD脑组织中进行Aβ的组织化学检测。然而，使用这些化合物进行Aβ检测成本较高且耗时较长。由于姜黄素（Cur）具有强烈的荧光活性、对Aβ的高亲和力和特异性，并且在结构上与传统的淀粉样蛋白结合染料相似，因此它成为在死后脑组织中标记和成像Aβ斑块的有前景候选物。姜黄素是从植物Curcuma longa中提取的一种天然多酚。在本研究中，姜黄素在1分钟内即可对5x家族性阿尔茨海默病（5xFAD）转基因小鼠模型以及人类AD脑组织中的Aβ斑块进行组织化学标记。我们将姜黄素的标记能力与传统的淀粉样蛋白结合染料（如硫黄素-S（Thio-S）、刚果红（CR）和Fluoro-jade C（FJC））以及Aβ特异性抗体（6E10和A11）进行了比较。我们发现，与这些传统染料相比，姜黄素是标记和成像Aβ斑块最经济、最快的方法，其效果可与Aβ特异性抗体相媲美。此外，姜黄素可结合大多数Aβ亚型，如寡聚体和纤维。因此，姜黄素可作为检测Aβ斑块最具成本效益、操作简便且快速的荧光染料试剂。

引言

阿尔茨海默病（AD）是最常见的与年龄相关的进行性神经退行性疾病之一，也是全球主要的致死原因之一^1,2。学习、记忆和认知功能障碍以及神经精神障碍是阿尔茨海默病常见的临床表现³。尽管阿尔茨海默病的病因尚未完全阐明，但现有的遗传学、生物化学和实验证据表明，Aβ的逐步沉积是该病明确的生物标志物⁴。这种错误折叠的蛋白质在细胞内和细胞外空间积聚，被认为参与了阿尔茨海默病脑组织中皮层和海马区域的突触丢失、神经炎症加剧以及神经退行性变⁵。因此，在阿尔茨海默病组织中对Aβ进行组织化学检测，是开发无毒、抗淀粉样蛋白药物以阻止疾病进展的关键第一步。

在过去的几十年中，许多研究实验室使用多种染料和抗体来标记和成像脑组织中的 Aβ 斑块，但其中一些方法耗时较长，且所用染料或抗体价格昂贵，需要多种辅助化学品。因此，开发一种经济实惠的方法来检测阿尔茨海默病（AD）脑组织中的 Aβ 斑块将是一项受欢迎的新工具。许多实验室开始使用姜黄素（Cur），一种具有潜力的抗淀粉样变性天然多酚，用于 Aβ 的标记与成像，并将其作为 AD 的治疗剂^6,7,8,9。由于其疏水性和亲脂性、与经典淀粉样蛋白结合染料的结构相似性、强烈的荧光活性以及对 Aβ 的高亲和力，使其成为标记和成像 AD 组织中 Aβ 斑块的理想荧光探针¹⁰。姜黄素可与 Aβ 斑块及寡聚体结合，且其存在亦可在细胞内空间中被检测到^7,11,12,13。此外，已有研究表明，极低浓度（1−10 nM）的姜黄素即可在 5x 家族性阿尔茨海默病（5xFAD）脑组织中实现 Aβ 斑块的标记⁷。尽管 1 nM 浓度尚不足以提供用于计数 Aβ 斑块的最佳荧光强度，但 10 nM 或更高浓度的姜黄素可以达到理想效果。Ran 及其同事¹⁴报道，低至 0.2 nM 的二氟硼酸衍生物化姜黄素几乎可与红外探针一样有效地检测体内 Aβ 沉积物。然而，该剂量是否足以在组织中有效标记 Aβ 斑块仍不明确。大多数先前的研究采用 20−30 分钟的染色时间来使用姜黄素标记 Aβ 斑块，但最佳染色可能所需时间更短。

本研究旨在检测姜黄素（Cur）标记阿尔茨海默病（AD）脑组织中Aβ斑块所需的最短时间，并比较姜黄素与其它传统Aβ结合染料（如硫黄素-S（Thio-S）、刚果红（CR）和Fluoro-jade C（FJC））在5xFAD小鼠脑组织中对Aβ斑块标记和成像的敏感性。这些经典淀粉样蛋白结合染料的Aβ标记能力与姜黄素染色进行了比较，所用样本包括5xFAD小鼠以及年龄匹配的人类AD患者和对照组脑组织的石蜡包埋及冰冻冠状脑切片。研究结果表明，姜黄素标记Aβ斑块的效果与Aβ特异性抗体（6E10）相似，且优于Thio-S、CR或FJC。此外，当对5xFAD小鼠进行腹腔注射姜黄素持续2−5天后，该物质可穿过血脑屏障并与Aβ斑块结合⁷。有趣的是，已有研究使用纳摩尔浓度的姜黄素对5xFAD小鼠脑组织中的Aβ斑块进行标记和成像^7,14。此外，姜黄素对形态各异的Aβ斑块（如核心型、神经炎性、弥散型和烧尽型斑块）的标记效率高于其他任何传统淀粉样蛋白结合染料⁷。总体而言，姜黄素可用于AD动物模型和/或人类AD死后脑组织中Aβ斑块的标记与成像，操作简便且成本低廉，是Aβ特异性抗体的一种可靠替代方案。

方案

本研究所述所有方法均已获得萨吉诺谷州立大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。人脑组织来自位于亚利桑那州的班纳太阳健康研究所 established 脑库^15,16。

1. 动物灌注

1. 准备固定液和灌注缓冲液。
   1. 通过加入80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、21.7 g磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·7H₂O）、2.59 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄），并用双蒸水定容至1 L，配制0.1 M磷酸钠缓冲液。
   2. 配制4%多聚甲醛（PFA）。
      1. 将40 g多聚甲醛加入1 L PBS（0.1 M，pH 7.4）中。
      2. 将PFA溶液加热至60−65 °C，并使用磁力搅拌器搅拌。
         注：温度不得超过65 °C。
      3. 用滴管滴加数滴氢氧化钠（1 N）以完全溶解PFA。
      4. 用中等至细孔滤纸过滤PFA溶液，并于4 °C保存。
         注：该溶液可保存一个月。
2. 进行动物麻醉与灌注。
   注：12月龄B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J（5×FAD）年龄匹配的对照小鼠（每组n = 6）购自供应商，并在中国台湾彰化县的Saginaw Valley State University动物房内繁殖饲养。基因型通过聚合酶链式反应（PCR）确认，方法如前所述⁷。人类阿尔茨海默病（AD）脑组织包括死后AD脑组织及年龄匹配的对照组织。
   1. 通过腹腔注射（使用27 G针头和1 mL注射器）给予适当的麻醉剂（如戊巴比妥钠，390 mg/kg体重，或氯胺酮/赛拉嗪混合物，氯胺酮最高80 mg/kg体重，赛拉嗪10 mg/kg体重）对动物进行麻醉。通过轻捏脚趾检查麻醉深度；若动物无反应，则可进行灌注手术。
   2. 将麻醉后的动物仰卧置于灌注手术托盘上，使用小型虹膜剪在左心室后端做一切口。
   3. 将22 G灌注针插入左心室，并在右心耳处做一小切口以排出灌注液。使用重力驱动灌注系统，使冰冻的灌注液（0.1 M PBS，pH 7.4）流动5−6分钟（流速20−25 ml/min）。
      注：肝脏变清是灌注充分的指标。
   4. 切换缓冲液阀门至冰冻的4%多聚甲醛溶液进行固定，持续灌注8−10分钟。
      注：出现震颤，随后肢体变硬或僵直，是固定良好的标志。
   5. 使用剪刀从颅骨中取出脑组织。用刮勺收集脑组织，放入盛有4% PFA的样品瓶中（体积至少为脑组织体积的10倍），4 °C保存以备后续使用。

2. 组织处理

1. 切片冷冻切片机切片。
   1. 将脑组织转移至梯度蔗糖溶液（10%、20% 和 30%）中，于 4 °C 分别保存 24 小时，直至使用。
   2. 在 -22 °C 使用冷冻切片机切取 40 µm 厚的切片。将每孔 10−20 片切片收集至盛有 PBS 和叠氮化钠（0.02%）的 6 孔板中。
2. 对小鼠和人脑组织切片进行石蜡包埋。
   1. 对于石蜡切片，将灌注后并固定 24 小时的脑组织在室温下依次用梯度乙醇（50%、70%、90%）各脱水 2 小时，随后用 100% 乙醇处理两次，每次 1 小时，再用二甲苯处理两次，每次 1 小时。
   2. 在覆盖铝箔的玻璃锥形瓶中，于 56 °C 使用二甲苯-石蜡（1:1）溶液渗透组织两次，每次 1 小时。
   3. 将组织浸入熔化的石蜡（56 °C）中 4−6 小时。
   4. 在室温下使用旋转式切片机切取 5 µm 厚的切片，并将其置于 45 °C 的组织水浴中。
3. 使用姜黄素（Cur）对冷冻切片中的 Aβ 斑块进行组织化学标记。
   1. 用 PBS（pH 7.4）将步骤 2.1.2 中的切片漂洗三次，每次 5 分钟。
   2. 在室温下将切片浸入 70% 乙醇中 2 分钟。
   3. 将姜黄素储备液（1 mM）溶于甲醇，并用 70% 乙醇稀释，获得终工作浓度为 10 µM 的溶液。
   4. 在室温下将切片置于工作浓度的姜黄素溶液中，于 150 rpm 摇床上孵育 1−5 分钟。
   5. 弃去姜黄素溶液，用 70% 乙醇洗涤三次，每次 2 分钟。
   6. 将切片置于聚-L-赖氨酸包被的载玻片上，使用有机封片剂（如二甲苯-苯乙烯-增塑剂混合物，DPX）加盖盖玻片封片。
   7. 使用 480/550 nm 激发/发射滤光片在荧光显微镜下观察。
4. 使用姜黄素（Cur）对石蜡包埋的小鼠和人脑组织切片中的 Aβ 斑块进行组织化学标记。
   1. 在室温下用二甲苯脱蜡两次，每次 5 分钟，处理步骤 2.2.4 中的组织切片。
   2. 在室温下依次用梯度乙醇溶液（100%、80%、70%、50%，各 1 分钟）和蒸馏水洗涤两次，每次 5 分钟，进行复水。
   3. 在避光、150 rpm 摇动条件下，于室温用姜黄素（10 µM）染色 10 分钟。随后用 70%、90% 和 100% 乙醇各洗涤 2 分钟。
   4. 用二甲苯透明两次，每次 5 分钟，并用 DPX 封片。
   5. 按照步骤 2.3.7 所述方法在荧光显微镜下观察。
5. 在 Aβ 斑块和寡聚体中实现姜黄素与 Aβ 抗体的共定位。
   1. 在 12 孔板中用 PBS 漂洗步骤 2.1.2 中的冷冻切片三次。
   2. 在室温下用含 0.5% Triton-X-100 的 PBS 溶液配制的 10% 正常山羊血清（NGS）封闭切片 1 小时。
   3. 弃去封闭液。将切片与 Aβ 特异性抗体（6E10 或 A11，稀释比例 1:200）在含 10% NGS 和 0.5% Triton-X-100 的新鲜封闭液中，于 4 °C 在 150 rpm 摇床上孵育过夜。
   4. 弃去抗体溶液，用 PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟。
   5. 在避光条件下，室温下用带有红色荧光标记的二抗（例如 Alexa 594）孵育 1 小时。
   6. 用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
   7. 用 70% 乙醇洗涤一次。
   8. 在室温下用姜黄素（10 µM）孵育切片 5 分钟。
   9. 用 70% 乙醇洗涤三次，每次 1 分钟。
   10. 依次用 90% 和 100% 乙醇脱水各 1 分钟，用二甲苯透明两次，每次 5 分钟，最后用 DPX 封片。
   11. 使用适合红色和绿色信号的激发/发射滤光片在荧光显微镜下观察。
   12. 对于细胞内 Aβ 的共定位，先用 Aβ 抗体（6E10）染色切片，然后在避光、150 rpm 摇动条件下于室温用姜黄素复染，再用 Hoechst-33342（1 mg/ml）和/或 DAPI（1 µg/ml）在避光、150 rpm 摇动条件下于室温复染 10 分钟。最后用 PBS 洗涤三次。
   13. 使用 100 倍物镜（总放大倍数 1,000 倍）分别用红、绿、蓝滤光片拍摄图像。
6. 使用硫黄素-S（Thio-S）、刚果红（CR）和氟代杰克逊染料（FJC）标记 Aβ 斑块。
   注意：Thio-S 和 CR 染色的详细方案已有先前报道⁷。
   1. 对于 FJC 染色，将步骤 2.1.2 获得的游离切片用 PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
   2. 将切片置于 12 孔板中，在避光、室温条件下用 FJC（0.001%）染色 10 分钟。
   3. 弃去 FJC 溶液，用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
   4. 在室温下用氯化铵（NH₄Cl，50 mM 溶于 PBS）孵育 10 分钟。
   5. 弃去 NH₄Cl 溶液，用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
   6. 按照第 2.4 节的步骤，依次用梯度乙醇脱水、透明、封片，并使用 450/520 nm 激发/发射滤光片在荧光显微镜下观察。

结果

姜黄素在1分钟内即可标记Aβ斑块。当我们用姜黄素对5xFAD组织进行染色时，发现姜黄素在1分钟内即可标记Aβ斑块。尽管延长姜黄素孵育时间可略微增强Aβ斑块的荧光强度，但在1分钟与5分钟染色时间之间，所观察到的Aβ斑块数量并无显著差异（图1）。

姜黄素可标记冷冻切片机制备的、石蜡包埋的小鼠和人类阿尔茨海默病（AD）组织中的Aβ斑块，且在小鼠AD脑组织中与Aβ特异性抗体共定位。当我们对冷冻切片、石蜡包埋的切片（图2A）以及人类AD组织（图2B）进行染色时，观察到在所有类型的组织切片中均有姜黄素标记的Aβ斑块。此外，为确认姜黄素确实结合于Aβ斑块，我们首先使用6E10抗体对斑块进行标记，随后进行姜黄素染色。结果显示...

讨论

我们的假设是，与其它经典的淀粉样蛋白结合染料以及 Aβ 特异性抗体相比，姜黄素（Cur）可作为标记和成像死后阿尔茨海默病（AD）脑组织中 Aβ 斑块最快、最简便且成本最低的方法。本研究旨在确定在死后 AD 脑组织中使用姜黄素标记和成像 Aβ 斑块所需的最短时间，并验证姜黄素是否可作为 Aβ 抗体标记 Aβ 斑块的替代方案。为此，我们在不同时间点观察了姜黄素对 Aβ 的标记能力。结果显示，姜黄素可在一分钟内标记 Aβ。此外，姜黄素对 Aβ 的标记效果优于其他常规的淀粉样蛋白结合染料，如硫黄素-S（Thio-S，0.1%）、刚果红（CR，1%）和氟代碱性品红（FJC，0.001%）。

姜黄素（Cur）被认为是用于Aβ标记的独特且理想的荧光探针，因为它具备大多数传统淀粉样蛋白结合染料所共有的结构、物理、化学和生物学特性¹⁰。此外，由于其成本低廉，大多数研究人员倾向于使用这种天然多酚化合物。为了验证姜黄素（Cur）对Aβ斑块和寡聚体结合的特异性，我们采用了6E10和A11（Aβ寡聚体特异性抗体）。结果显示，姜黄素与组织中存在的各种Aβ形式几乎...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	IHC world, Woodstock, MD
阿尔茨海默病动物模型	Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
无水乙醇	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
抗体6E10	Biolegend, San Diego, CA
抗体A11	Millipore, Burlington, MA
普通光学显微镜	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus BX51
刚果红	Sigma, St. Louis, MO
冷冻切片机	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
姜黄素	Sigma, St. Louis, MO
磷酸氢二钠	Sigma, St. Louis, MO
二甲苯基增塑剂邻苯二甲酸二烯丙酯	BDH, Dawsonville, GA
滤纸	Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342	Sigma, St. Louis, MO
倒置荧光显微镜	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
倒置荧光显微镜	Olympus, Shinjuku, Japan	Olympus 1x70
正常山羊血清	Sigma, St. Louis, MO
石蜡	Sigma, St. Louis, MO
多聚甲醛	Sigma, St. Louis, MO
聚赖氨酸包被的带电玻璃载片	Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
氯化钾	Sigma, St. Louis, MO
磷酸二氢钾	Sigma, St. Louis, MO
叠氮化钠	Sigma, St. Louis, MO
氯化钠	Sigma, St. Louis, MO
氢氧化钠	EMD Millipore, Burlington, MA
戊巴比妥钠	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
硫黄素-S	Sigma, St. Louis, MO
吐温-100	Sigma, St. Louis, MO
二甲苯	VWR,Radnor, PA