方法文章

使用天然多酚姜黄素对脑组织中淀粉样斑块进行标记与成像

DOI：

10.3791/60377

⸱

2019年11月1日

 ,  ,  ,  , 
1Field Neurosciences Institute, Ascension St. Mary's Hospital, 2Field Neurosciences Institute Laboratory for Restorative Neurology, Central Michigan University, 3Program in Neuroscience, Central Michigan University, 4Department of Psychology, Central Michigan University, 5Department of Health Sciences, Saginaw Valley State University

本文内容

摘要

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姜黄素是标记和成像脑组织中β-淀粉样蛋白斑块的理想荧光探针，因其对β-淀粉样蛋白具有优先结合性，且在结构上与其他传统的淀粉样蛋白结合染料具有相似性。与传统方法相比，姜黄素可用于更高效且更经济地标记和成像β-淀粉样蛋白斑块。

摘要

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β-淀粉样蛋白（Aβ）在细胞外和细胞内的沉积是阿尔茨海默病（AD）的标志性病理特征之一。因此，检测AD脑组织中Aβ的存在是开发预防AD进展新疗法的重要工具。已有多种经典的淀粉样蛋白结合染料、荧光染料、成像探针以及Aβ特异性抗体被用于在AD脑组织中进行Aβ的组织化学检测。然而，使用这些化合物进行Aβ检测成本较高且耗时较长。由于姜黄素（Cur）具有强烈的荧光活性、对Aβ的高亲和力和特异性，并且在结构上与传统的淀粉样蛋白结合染料相似，因此它成为在死后脑组织中标记和成像Aβ斑块的有前景候选物。姜黄素是从植物Curcuma longa中提取的一种天然多酚。在本研究中，姜黄素在1分钟内即可对5x家族性阿尔茨海默病（5xFAD）转基因小鼠模型以及人类AD脑组织中的Aβ斑块进行组织化学标记。我们将姜黄素的标记能力与传统的淀粉样蛋白结合染料（如硫黄素-S（Thio-S）、刚果红（CR）和Fluoro-jade C（FJC））以及Aβ特异性抗体（6E10和A11）进行了比较。我们发现，与这些传统染料相比，姜黄素是标记和成像Aβ斑块最经济、最快的方法，其效果可与Aβ特异性抗体相媲美。此外，姜黄素可结合大多数Aβ亚型，如寡聚体和纤维。因此，姜黄素可作为检测Aβ斑块最具成本效益、操作简便且快速的荧光染料试剂。

引言

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阿尔茨海默病（AD）是最常见的与年龄相关的进行性神经退行性疾病之一，也是全球主要的致死原因之一1,2。学习、记忆和认知功能障碍以及神经精神障碍是阿尔茨海默病常见的临床表现3。尽管阿尔茨海默病的病因尚未完全阐明，但现有的遗传学、生物化学和实验证据表明，Aβ的逐步沉积是该病明确的生物标志物4。这种错误折叠的蛋白质在细胞内和细胞外空间积聚，被认为参与了阿尔茨海默病脑组织中皮层和海马区域的突触丢失、神经炎症加剧以及神经退行性变5。因此，在阿尔茨海默病组织中对Aβ进行组织化学检测，是开发无毒、抗淀粉样蛋白药物以阻止疾病进展的关键第一步。

在过去的几十年中，许多研究实验室使用多种染料和抗体来标记和成像脑组织中的 Aβ 斑块，但其中一些方法耗时较长，且所用染料或抗体价格昂贵，需要多种辅助化学品。因此，开发一种经济实惠的方法来检测阿尔茨海默病（AD）脑组织中的 Aβ 斑块将是一项受欢迎的新工具。许多实验室开始使用姜黄素（Cur），一种具有潜力的抗淀粉样变性天然多酚，用于 Aβ 的标记与成像，并将其作为 AD 的治疗剂6,7

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方案

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本研究所述所有方法均已获得萨吉诺谷州立大学动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。人脑组织来自位于亚利桑那州的班纳太阳健康研究所 established 脑库15,16。

1. 动物灌注

  1. 准备固定液和灌注缓冲液。
    1. 通过加入80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、21.7 g磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）、2.59 g磷酸二氢钾（KH2PO4），并用双蒸水定容至1 L，配制0.1 M磷酸钠缓冲液。
    2. 配制4%多聚甲醛（PFA）。
      1. 将40 g多聚甲醛加入1 L PBS（0.1 M，pH 7.4）中。
      2. 将PFA溶液加热至60−65 °C，并使用磁力搅拌器搅拌。
        注：温度不得超过65 °C。
      3. 用滴管滴加数滴氢氧化钠（1 N）以完全溶解PFA。
      4. 用中等至细孔滤纸过滤PFA溶液，并于4 °C保存。
        注：该溶液可保存一个月。
  2. 进行动物麻醉与灌注。
    注：1....

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结果

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姜黄素在1分钟内即可标记Aβ斑块。当我们用姜黄素对5xFAD组织进行染色时，发现姜黄素在1分钟内即可标记Aβ斑块。尽管延长姜黄素孵育时间可略微增强Aβ斑块的荧光强度，但在1分钟与5分钟染色时间之间，所观察到的Aβ斑块数量并无显著差异（图1）。

姜黄素可标记冷冻切片机制备的、石蜡包埋的小鼠和人类阿尔茨海默病（AD）组织中的Aβ斑块，且在小鼠AD脑组织中与Aβ特异性抗体共定位。当我们对冷冻切片、石蜡包埋的切片（图2A）以及人类AD组织（图2B）进行染色时，观察到在所有类型的组织切片中均有姜黄素标记的Aβ斑块。此外，为确认姜黄素确实结合于Aβ斑块，我们首先使用6E10抗体对斑块进行标记，随后进行姜黄素染色。结果显示.......

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讨论

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我们的假设是，与其它经典的淀粉样蛋白结合染料以及 Aβ 特异性抗体相比，姜黄素（Cur）可作为标记和成像死后阿尔茨海默病（AD）脑组织中 Aβ 斑块最快、最简便且成本最低的方法。本研究旨在确定在死后 AD 脑组织中使用姜黄素标记和成像 Aβ 斑块所需的最短时间，并验证姜黄素是否可作为 Aβ 抗体标记 Aβ 斑块的替代方案。为此，我们在不同时间点观察了姜黄素对 Aβ 的标记能力。结果显示，姜黄素可在一分钟内标记 Aβ。此外，姜黄素对 Aβ 的标记效果优于其他常规的淀粉样蛋白结合染料，如硫黄素-S（Thio-S，0.1%）、刚果红（CR，1%）和氟代碱性品红（FJC，0.001%）。

姜黄素（Cur）被认为是用于Aβ标记的独特且理想的荧光探针，因为它具备大多数传统淀粉样蛋白结合染料所共有的结构、物理、化学和生物学特性10。此外，由于其成本低廉，大多数研究人员倾向于使用这种天然多酚化合物。为了验证姜黄素（Cur）对Aβ斑块和寡聚体结合的特异性，我们采用了6E10和A11（Aβ寡聚体特异性抗体）。结果显示，姜黄素与组织中存在的各种Aβ形式几乎.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究得到了阿森松圣玛丽医院田野神经科学研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）IHC world, Woodstock, MD
阿尔茨海默病动物模型Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
无水乙醇VWR,Radnor, PA
Alexa 594Santacruz Biotech, Dallas, TX
抗体6E10Biolegend, San Diego, CA
抗体A11Millipore, Burlington, MA
普通光学显微镜Olympus, Shinjuku, JapanOlympus BX51
刚果红Sigma, St. Louis, MO
冷冻切片机GMI, Ramsey, MNLeicaCM1800
姜黄素Sigma, St. Louis, MO
磷酸氢二钠Sigma, St. Louis, MO
二甲苯基增塑剂邻苯二甲酸二烯丙酯BDH, Dawsonville, GA
滤纸Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342Sigma, St. Louis, MO
倒置荧光显微镜Leica, Buffalo Grove, ILLeica DMI 6000B
倒置荧光显微镜Olympus, Shinjuku, JapanOlympus 1x70
正常山羊血清Sigma, St. Louis, MO
石蜡Sigma, St. Louis, MO
多聚甲醛Sigma, St. Louis, MO
聚赖氨酸包被的带电玻璃载片Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
氯化钾Sigma, St. Louis, MO
磷酸二氢钾Sigma, St. Louis, MO
叠氮化钠Sigma, St. Louis, MO
氯化钠Sigma, St. Louis, MO
氢氧化钠EMD Millipore, Burlington, MA
戊巴比妥钠Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
硫黄素-SSigma, St. Louis, MO
吐温-100Sigma, St. Louis, MO
二甲苯VWR,Radnor, PA

参考文献

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  1. Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
  2. Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
  3. Tarawneh, R., Holtzman, D. M.

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