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基于光子芯片的高通量全内反射荧光与直接随机光学重建显微技术

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DOI：

10.3791/60378

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2019年11月16日

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1Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, 2Vascular Biology Research Group, Department of Medical Biology, UiT The Arctic University of Norway

本文内容

摘要

基于芯片的超分辨率光学显微镜是一种荧光显微镜的新方法，在成本效益和通量方面具有优势。本文展示了用于全内反射荧光（TIRF）显微镜和基于定位的超分辨率显微镜的芯片制备与成像方案。

摘要

全内反射荧光（TIRF）常用于基于单分子定位的超分辨率显微成像，因其具有光学切片能力而能提供更高的对比度。传统方法采用高数值孔径的显微镜TIRF物镜进行激发和信号收集，严重限制了视场范围和通量。本文介绍一种利用光学波导产生TIRF激发的新方法，称为芯片式纳米显微成像（chip-based nanoscopy）。本实验方案旨在演示在已有装置上如何实现基于芯片的成像。芯片式纳米显微成像的主要优势在于激发与收集光路相互解耦，从而可使用低倍率物镜进行成像，获得大视场的TIRF图像，仅以轻微降低分辨率为代价。本研究利用该方法对肝窦内皮细胞（LSECs）进行了成像。 直接 随机光学重建显微镜（dSTORM），其分辨率可与传统的超分辨率显微镜相媲美。此外，我们通过使用低倍物镜对500 µm × 500 µm区域进行成像，展示了该技术的高通量能力，实现了76 nm的分辨率。由于其结构紧凑，基于芯片的成像系统可被集成至大多数常规显微镜中，并可与其他片上光学技术（如片上传感、光谱学、光镊等）相结合。因此，该技术不仅非常适用于高通量二维超分辨率成像，还为多模态分析提供了广阔的应用前景。

引言

自从首次实现单分子定位显微技术以来，已发展出多种变体以应对不同的挑战1,2,3。然而，一个持续存在的挑战是大视野的dSTORM成像。许多dSTORM系统使用同一物镜既用于激发样品，也用于成像。为了扩大视野，需要使用低倍率物镜。低倍率和低数值孔径（NA）的物镜通常具有较大的景深，导致来自焦平面外的信号增加，从而降低定位精度。全内反射荧光（TIRF）物镜常被用来通过减少焦平面外的荧光来提高图像对比度。借助TIRF，通过渐逝场将激发光限制在样品表面约150 nm的光学厚度范围内4。TIRF物镜需要较大的NA，因而导致视场较小（例如，50 × 50 µm2），显著限制了通量。然而，也存在其他生成渐逝场的方法。

光学波导是一种能够将耦合进入其中的光进行限制和引导的结构。波导最常用于基于光纤的通信系统中。为了开发二维集成波导作为光子集成电路的主要组成部分，人们已投入大量努力。该技术已取得显著进展，如今低损耗纳米结构光学波导的制备已可常规实现5。目前，全球已有若干家代工厂可用于开发光子集成电路。波导通过全内反射来引导光传播，同时在表面产生倏逝场。通过精心设计波导结构，可在倏逝场中实现高强度。因此，直接放置在波导表面的样品也可被倏逝场照射，适用于成像应用。倏逝场将在波导的整个长度和宽度方向上产生，因而其范围可以任意扩大6。

我们提出了一种新颖的TIRF dSTORM方法，可实现任意大的视场。该方法不使用TIRF物镜进行激发和信号收集，而是利用光学波导产生的隐逝场进行激发。这种设计将激发光路与收集光路解耦，使得在收集光路方面具有完全的自由度，同时不损害波导芯片照明为特定波长所提供的光学切片能力。因此，可以使用低倍率物镜在TIRF模式下对非常大的区域进行成像，尽管较小的数值孔径（NA）会降低横向分辨率。此外，使用波导还极大地简化了多色成像7，因为多个波长可被同时引导并检测，而无需重新调节系统。这对dSTORM具有显著优势，因为可以利用较短波长来增强荧光分子的闪烁效应，并实现多色成像。需要注意的是，隐逝场的穿透深度会随波长变化而变化，但这并不影响成像操作的实施方式。该芯片适用于活细胞成像8，并特别适合与微流控技术集成等应用。每块芯片可包含数十条波导，使用户能够在不同条件下进行成像，或同时应用光镊9和拉曼光谱技术10。

基于芯片的系统在衍射极限成像和超分辨率成像中均表现出良好的性能。2005年曾提出一种类似方法，利用棱镜产生倏逝场激发4。光子芯片同样通过倏逝场实现激发，但借助现代波导制备技术，可利用波导生成复杂的光场模式。目前基于芯片的纳米显微成像技术仅限于二维成像，因为激发场被限制在波导表面内。未来的发展方向是实现三维应用。此外，其他超分辨率技术，如结构光照明显微术，也正在基于同一芯片式显微镜平台进行开发11。

方案

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）层的制备

  1. 配制 Sylgard 184 单体与固化剂按 10:1 的比例混合的溶液。
  2. 将混合液置于真空腔中，直至气泡完全消失。
  3. 在直径为 3.5 英寸的培养皿中心加入 1.7 g PDMS 混合液。
  4. 将培养皿放置在旋涂仪的真空吸盘上。
  5. 以 75 rpm/s 的加速度，在 900 rpm 的转速下旋涂 20 秒。
  6. 将培养皿置于热板上，在 50 °C 下固化至少 2 小时。

2. 样品制备

  1. 波导清洗
    1. 将清洗剂浓缩液（材料表）用去离子水（DI）稀释至1%，配制100 mL溶液。
    2. 使用晶圆镊子将芯片放入玻璃培养皿中，并用清洗液完全覆盖。
    3. 将培养皿置于70 °C的加热板上，加热10分钟。
    4. 仍在加热板上时，用洁净室专用擦拭纸轻轻擦拭芯片表面。
    5. 从培养皿中取出芯片，用至少100 mL去离子水冲洗。
    6. 用至少100 mL异丙醇冲洗，注意避免溶剂在表面干燥，以防产生蒸发残留痕迹。
    7. 再用至少100 mL去离子水冲洗，并用氮气枪吹干芯片。
  2. 腔室制备
    1. 在培养皿中制备一层150 µm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）（见第1节）。
    2. 使用手术刀从PDMS层上切下一尺寸为1.5 cm × 1.5 cm的框架。
    3. 用镊子将该框架从培养皿中取出，平整地放置在洁净且抛光的芯片上。样品现已准备好用于细胞接种。
  3. 荧光标记
    1. 准备以下试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）、染料溶液（多种）、dSTORM成像缓冲液。
    2. 完成细胞接种后，将芯片从培养基中取出。
    3. 使用移液器清除PDMS腔室外周多余的液体。
    4. 用移液器吸除PDMS腔室内的现有液体，同时加入约60 µL新鲜PBS。
      注意：加入腔室的液体体积需根据腔室尺寸进行调整。操作时注意不要将细胞表面的培养基完全吸除。
    5. 更换为60 µL新鲜PBS，孵育1分钟。
    6. 重复上一步操作，此次孵育5分钟。
    7. 吸除PBS，加入60 µL染料溶液，将样品避光孵育约15分钟。
      注意：此步骤可能因所用荧光染料的不同而有显著差异。本实验使用CellMask Deep Red对细胞膜进行标记。
    8. 按照步骤2.3.3–2.3.5的方法用PBS洗涤样品。
    9. 吸除PBS，同时加入40 µL成像缓冲液。
      注意：不同荧光染料需使用不同的成像缓冲液。
    10. 盖上盖玻片，注意避免产生气泡。轻轻按压盖玻片，使成像腔室中多余的液体排出。
    11. 使用移液器清除盖玻片外周多余的液体，并用蘸水的擦拭棒清洁盖玻片周围区域，防止浸油残留物干燥后形成结晶。

3. 成像步骤

  1. 组件设置
    注意：此版本的装置包含三个主要组件：显微镜、耦合平台和样品平台。参见材料表。
    1. 使用配备滤光片架、白光光源、相机和物镜转盘的显微镜。
    2. 使用带有光纤耦合激光器和耦合透镜的三轴压电耦合平台。
    3. 使用带倾斜和俯仰调节功能及真空夹具的一轴手动样品平台。
    4. 将耦合平台和样品平台均安装在二维电动平台上，以实现样品平移。
  2. 波导耦合
    1. 将芯片放置在真空卡盘上，使耦合端面朝向耦合物镜。确保芯片距离耦合物镜约一个焦距。
    2. 打开真空泵。
    3. 开启激光器至1 mW。粗略调节芯片高度，使光束照射到其边缘。关闭激光器。
    4. 打开白光光源。选择低倍率物镜（例如10倍）。将显微镜聚焦在波导上。
    5. 沿波导方向移动显微镜，检查其是否与光路良好对准。将显微镜移至耦合边缘。
    6. 以1 mW或更低功率开启激光器。沿耦合边缘移动显微镜以找到激光光斑。将光束聚焦在芯片边缘。
    7. 沿光路方向调节耦合平台，使激光光斑尺寸减小直至消失。此时光束位于芯片表面之上或之下。
    8. 调节耦合平台的高度，直到光斑重新出现并达到最大亮度。
    9. 重复前两个步骤，直到激光形成聚焦光斑。
    10. 将聚焦光斑移动至目标波导位置。
    11. 将显微镜从边缘短距离移开，使聚焦光斑不再可见。关闭白光光源。
    12. 调节对比度。如果波导正在导光，则沿波导的散射光应清晰可见。
    13. 调节耦合平台的各轴，使散射光强度最大化。关闭激光器。
    14. 打开白光光源。如有必要，调节对比度。
    15. 导航至成像区域。
  3. 衍射极限成像
    1. 使用所需的成像物镜进行聚焦。关闭白光光源。
    2. 插入荧光滤光片，并将激光功率设为1 mW。
    3. 将相机曝光时间设为约100 ms。根据需要调节对比度。确保耦合仍处于最佳状态。
    4. 定位感兴趣的成像区域。开启压电平台循环扫描以平均模式波动。
      注意：对于大多数波导结构，20 µm扫描范围、步长50 nm是合适的。
    5. 采集至少300张图像。
    6. 使用虚拟堆栈在Fiji中加载采集的图像堆栈。在Fiji的图像菜单中选择堆栈和z-投影。
    7. 选择投影类型为平均强度，计算TIRF图像。
  4. dSTORM成像
    1. 将激光器开启至1 mW，并将相机曝光时间设为30 ms。
    2. 调节对比度和焦距。
    3. 逐步增加激光功率，直至观察到闪烁现象。
      注意：这可能需要一段时间，具体取决于倏逝场强度。
    4. 对样品的小区域进行放大。
    5. 调节对比度。
    6. 采集几张图像，检查闪烁点是否充分分离。
    7. 调节相机曝光时间以获得最佳闪烁效果。
      注意：优化闪烁是一个复杂的过程，但已有大量相关文献可供参考12。
    8. 开启压电平台循环扫描。
    9. 根据闪烁密度，记录至少30,000帧的图像堆栈。
  5. dSTORM图像重建
    1. 打开Fiji，并将dSTORM图像堆栈作为虚拟图像加载。
    2. 如有必要，调节对比度。
    3. 使用矩形工具选择需要重建的区域。
    4. 在Fiji的Thunderstorm13插件中打开运行分析。
    5. 在Thunderstorm中设置与设备对应的基本相机参数。其余默认参数通常已足够。
    6. 开始重建。
      注意：由于文件较大，对于完整视场，数据可能需要划分为子堆栈处理。
    7. 对重建软件提供的定位列表进行筛选，去除非特异性定位。如有必要，额外应用漂移校正。

结果

全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种常用技术，因其可消除焦平面外的荧光背景，提高对比度，从而改善图像质量，且相较于其他基于荧光的显微技术，光毒性更低。与传统的物镜式方法相比，基于芯片的显微技术可在不使用TIRF专用物镜的情况下实现TIRF激发，避免了通常由TIRF物镜带来的通量限制。本研究中所展示装置的总体结构如图1A所示。我们展示了从小鼠中提取的肝窦内皮细胞（LSEC）的衍射极限分辨率图像以及dSTORM超分辨图像。同时展示了一幅标记了微管蛋白的LSEC大视野图像，以体现高通量成像的能力。传统的dSTORM装置通常采用油浸式TIRF物镜（放大倍数为60倍或100倍），其成像区域一般为50 µm × 50 µm，而本研究中使用25倍、0.8 NA物镜在芯片上实现的成像区域比其大100倍，如图2所示。

在本方法中，我们采用多模 Si3N4 波导进行激发。所使用的芯片由沉积在硅片上2 µm厚氧化层上方的150 nm厚条形刻蚀Si3N4导光层构成。芯片结构示意图见图1B。波导宽度可在200至1000 µm范围内变化。制造细节可参见其他文献8。由于传播模式之间的干涉，激发光的强度分布并非均匀，而是呈现空间变化的图样。图2A展示了一幅清晰可见模式图样的图像。该干涉图样会随激光束在波导边缘位置的变化而改变。为了在最终图像中实现均匀激发，我们使用压电平台沿耦合端面进行振荡。在整个成像过程中，干涉图样产生足够多的变化，从而可通过平均化消除图像中的强度波动。图像堆栈将包含多幅类似图2A的图像，尽管其图样各不相同，但经平均后，该堆栈将生成一幅具有均匀激发的图像，如图2B所示。另一种方法是采用绝热锥形结构以实现宽幅单模波导8,14，从而避免模式平均的需要。然而，为维持单模条件并实现100 µm的波导宽度，需要数毫米的锥形长度。多模波导可绕过这一锥形结构需求，对结构宽度无任何限制。除照明图样外，模式的高有效折射率还为结构化照明显微技术11和涨落显微技术7提供了前所未有的可能性。

成像的第一步是采集一幅衍射极限图像。该实验产生约300张图像的堆栈，最终图像通过对该堆栈取平均获得。图2展示了使用60倍、1.2数值孔径水浸物镜对经CellMask Deep Red标记的肝窦内皮细胞（LSECs）进行的衍射极限成像和dSTORM成像。图2A显示了由于模式平均不充分导致的非均匀照明，而成功的模式平均结果如图2B所示。图2C为同一区域的dSTORM图像，其中标记区域在图2D中放大显示。肝窦内皮细胞的质膜上具有纳米级孔隙15，此处可清晰观察到。通过傅里叶环相关分析，获得的分辨率为46 nm。

图3 展示一种 dSTORM 图像 500 µm x 500 µm 区域，展示了该技术的高通量能力。该区域的放大图像 图3A，对应于典型的 dSTORM 视场与衍射极限图像一并呈现 图3B采用傅里叶环相关法估算分辨率，结果为76 nm。

成像与光谱学光学装置、激光器、物镜和波导示意图。
图1：成像系统与波导。（A）成像系统的照片。样品置于样品台上的真空卡盘上，波导的耦合端面朝向耦合物镜。光纤耦合激光器和耦合物镜安装在三维压电平台顶部。带有成像透镜的镜头转轮从上方捕获图像并将其传递至相机。（B）带有耦合与成像透镜的波导示意图。耦合透镜将光耦合进入波导。样品（橙色微珠）被置于密封的PDMS腔室内。沿波导传播的倏逝场将激发样品，成像物镜则捕获所发射的荧光信号。请点击此处查看该图的放大版本。

显示蛋白质分布的细胞荧光显微图像；显微镜，细胞分析。
图 2：衍射极限成像与 dSTORM 成像。 （A）肝窦内皮细胞图像，模式平均不足，导致激发模式清晰可见。（B）与（A）相同区域，但进行了充分的模式平均，实现了均匀激发。（C）（B）中插图区域的衍射极限成像；（D）同一区域的 dSTORM 成像。（E）（D）的插图，清晰显示细胞质膜上的窗孔结构。请点击此处查看该图的高清版本。

显微图像显示细胞结构。放大插图详细展示细胞内丝状网络。
图3：dSTORM 成像大鼠肝窦内皮细胞（LSECs）。（A）大视野下dSTORM 成像显示 Alexa 647 标记的大鼠 LSECs 中微管蛋白（tubulin）。比例尺 = 50 µm。（B）来自（A）中标记的较大区域，比较衍射极限成像（左下）与dSTORM 成像（右上）。（C）来自（A）中标记的较小区域。比例尺 = 1 µm。该图像分辨率为 76 nm。经 Helle 等人 20196 许可改编。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

基于芯片的成像与传统的 dSTORM 成像类似，因此图像质量可采用与传统 dSTORM 成像相同的方法进行评估。对用户而言，主要区别在于将透明的玻璃载玻片替换为不透明的硅晶圆。尽管两者外观差异明显，但样品操作实际上与玻璃载玻片几乎相同。这些芯片结构坚固，可使用晶圆镊子轻松操作。成像过程及图像重建与常规 dSTORM 实验相同。搭建一套功能性的基于芯片的显微镜系统无需特殊组件，只需光子芯片本身即可。有关该系统的更多细节可参见先前的研究6,7。本研究中使用的芯片采用标准光刻技术制备8。

样品制备包括样品腔的准备。将PDMS框架固定到芯片上时，必须避免出现任何可能导致空气进入的小褶皱或撕裂。如果在安装过程中PDMS发生折叠，只需用镊子小心取下并重新安装即可。当样品在PDMS腔室内准备就绪后，必须将盖玻片紧压在上面，以密封该区域。在安装盖玻片时，应避免产生任何气泡。如果形成气泡，应轻轻取下盖玻片，并向样品腔内添加PBS，确保样品被完全覆盖，然后可重新进行盖玻片的安装与密封。

使用本文提出的方案可简化将光耦合进波导的过程。然而，仍存在一些常见挑战可能限制耦合效率。首先，若芯片未彻底清洗干净，残留的磷酸盐缓冲液（PBS）可能在波导表面形成污垢或结晶，导致显著的光损耗，从而使成像区域的光功率极低。使用湿润的棉签清洁盖玻片外部区域可显著提高输出光功率。其次，若波导的耦合端面因操作不当而受损，耦合损耗可能急剧增加。通过光学显微镜检查端面通常能轻易发现损伤。整个芯片的耦合端面可参照光纤的处理方式小心抛光，获得光滑的端面，从而提高耦合光功率。

在完成光耦合后，成像过程与任何常规的 dSTORM 装置相同。如果图像出现激发不均匀的情况，如图2A所示，则很可能是模式平均效果不佳所致。造成这种情况的两个最常见原因是：1）用于生成平均图像堆栈的图像数量过少；2）振荡距离过短或步长过大。采集图像数量过少可能导致部分激发模式未被包含，从而使平均结果不均匀。这一问题可通过增加平均图像堆栈中的图像数量轻松解决。振荡距离过短也会导致图像不均匀，因为未能激发足够的模式。该问题同样可通过增大振荡距离和/或减小步长来轻松解决。在本研究中，我们使用压电平台将入射激光束扫描20 µm，并采集至少300幅图像。另一种方法是使用高速振镜，在单次采集时间内（例如10–30 ms）将光快速扫描过输入波导端面。该方案适用于活细胞TIRF成像，其中亚细胞器处于持续运动状态。

基于芯片的 dSTORM 技术提供了前所未有的大范围 TIRF 激发区域，使其非常适用于高通量成像。其紧凑的结构可方便地改装到商用系统上，芯片可倒置用于倒置光路配置，也可开发透明基底。这些芯片可大规模制备，并可根据多种需求进行修改。目前主要的限制是仅适用于二维成像。由于倏逝场仅存在于波导表面约 200 nm 的范围内，因此只有在此区域内的荧光分子才会被激发。总体而言，集成光学领域在未来将为基于芯片的显微技术带来众多机遇，不仅能够应对新的成像问题，还能为现有问题提供新的解决可能。

披露

B.S. Ahluwalia 已针对基于芯片的光学纳米显微技术申请了专利 GB1606268.9。其他作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者谨此致谢欧洲研究理事会（B.S.A. 获资助编号 336716）。作者还要感谢 Irati Lagfragua 在视频录制与编辑过程中提供的宝贵协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
单轴样品台Standa7T173-20
双轴样品平移台Mad City Labs定制订单
三轴NanoMax位移台ThorlabsMAX311D
BXFM显微镜机身OlympusOLY-LSM-037018
CellMask深红色染料，Life technologiesThermoFisherC10046
洁净室级棉签MRC TechnologyMFS-758
光纤耦合激光器CoboltFlamenco
滤光片支架自制
Hellmanex III，Hellma GmbhSigma-AldrichZ805939清洗用浓缩洗涤剂
异丙醇Sigma-Aldrich563935-1L
KL 1600 LEDOlympusOLY-LSM-E0433314
Olympus耦合透镜OlympusLMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2Hamamatsu
PBS片剂Sigma-AldrichP4417-50TAB按说明配制
SYLGARD 184硅酮弹性体1.1 kg套装Dow1673921
倾斜-俯仰调节台ThorlabsAPR001
真空夹持器ThorlabsHWV001
晶圆镊子Type 2WAgar scientificAGT5051

参考文献

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