一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法

Summary

该协议是作为一种以简化、低成本的方式生产脑器官的方法，没有外源性生长因子或基底膜基质，同时仍然保持脑细胞类型的多样性和细胞组织的许多特征。

Abstract

与胚胎干细胞不同的人脑器官为研究三维系统中多种细胞类型的复杂相互作用提供了独特的机会。在这里，我们提出了一个相对简单和廉价的方法，产生大脑器官。在本协议中，人类多能干细胞被分解成小簇，而不是单个细胞，在基本培养基培养基中生长，没有异质基底膜基质或外源性生长因子，允许内在发育线索形成有机物的生长。这个简单的系统产生多种脑细胞类型，包括胶质和微胶质细胞、干细胞和前脑、中脑和后脑的神经元。该协议生成的有机体还显示了适当的时空组织特征，这些特征通过明场图像、组织学、免疫荧光和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。由于这些有机物含有来自大脑各个部位的细胞类型，它们可用于研究多种疾病。例如，在最近的一篇论文中，我们演示了利用从这个协议生成的有机体来研究缺氧对人脑的影响。这种方法可用于研究一系列其他难以研究的条件，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经疾病。

Introduction

由于无数的实际和伦理限制，在研究人脑方面遇到了很大的困难。虽然利用啮齿动物的研究对于我们了解人脑至关重要，但老鼠脑却^{有许多不同。}有趣的是，老鼠的神经元密度至少是灵长类脑^3、4的7倍。虽然从进化的角度来看，灵长类动物比啮齿动物更接近人类，但大多数研究人员与它们合作是不现实的。该协议的目的是使用简化且成本较低的方法重新概括人脑的许多重要特征，而无需异质基底膜基质或外源性生长因子，同时保持脑细胞多样性和细胞组织。

Sasai实验室的造形工作使用胚胎体无血清培养法（SFEBq）方法，从信号胚胎干细胞（ESCs）5、6生成二维和三维神经元细胞类型。许多人脑器官方法都遵循了一个相对相似的路径，从信号ESCs^7，8。相反，该协议从分离的人类ESCs（hESCs）开始，类似于在电镀步骤^9、10之前汤姆森和张实验室的开创性工作的初始步骤，以及Pasca实验室在添加外源性生长因子¹¹之前的大脑有机体协议的初始步骤。基底膜基质（例如，母体凝胶）已用于许多脑器官协议，并已被证明是一个有效的支架^8。然而，最常用的基底膜基质基质并非没有并发症，因为它们与未知数量的生长因子共同纯化，在生产过程中分批到批次变异^。此外，这些矩阵会使成像复杂化，并增加污染风险和成本。

虽然人脑器官可以用来回答许多问题，但有一定的局限性要记住。首先，从胚胎干细胞开始，器官比老年大脑更类似于不成熟的大脑，因此可能不是老年疾病（如阿尔茨海默氏症）的理想模型。其次，虽然我们的协议发现了前脑、中脑和后脑发育的标记物，这些标记有助于研究治疗或疾病对来自多个大脑区域的细胞的影响，但可以遵循其他协议，以专注于特定的大脑区域^13、14。最后，有机体模型的另一个限制是大小，而人脑的平均长度约为167毫米，使用搅拌使大脑器官增长到4毫米⁸和由该协议形成的器官增长到1-2毫米10周。尽管如此，该协议为研究人类脑组织和多种细胞类型的相互作用提供了重要工具。

Protocol

1. 干细胞维持

1. 根据制造商的说明，在生长因子减少的层上保持H9 hESC（参见材料表，以后简称矩阵）。
   1. 要涂覆一个 6 孔板或一个 10 厘米的盘子，请将 100 μL 的基质与 5.9 mL 的冰冷 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM）/F12 介质相结合。将板包裹在石蜡薄膜中，并在 4°C 下存放过夜。在过量的基质/培养基被吸进后，第二天使用它们进行传交细胞。
2. 以大约每 7 天 1:12 的分裂比率将细胞培养为每周到一周。在37°C低氧培养箱（5%O 2，5%CO_2）中使用mTESR-1培养基保持细胞。每天刷新媒体。使用玻璃工具将细胞与通道之间的培养分离出来。
3. H9细胞应在利用它们产生有机物之前四到六天通过。细胞应以大约1:8的细胞簇比例通过。为此，首先用DMEM F12介质冲洗细胞，用中性蛋白酶（例如，脱粒，以后简称为蛋白酶）分离细胞，用DMEM/F-12冲洗，在4个板（6孔或10厘米）的+20%汇合时将细胞作为30-60细胞簇。收获前两天，将它们转移到常规孵化器（21% O_2，5%CO₂）。板在开始有机体形成时应达到±80%的汇合度。

2. 组织文化hESC的分离

1. 对蛋白酶溶液（5 U/mL）进行比分。
   注意:我们通常在-20°C下冻结1 mL等分，以在几个月内使用。
2. 通过为每个 6 孔或 10 厘米板的 hESC 添加 1 mL 的库存溶液加上 5 mL 的 DMEM/F12，将蛋白酶溶液稀释到工作浓度。
3. 吸气并去除细胞培养基，然后用蛋白酶溶液覆盖hESC。将板放在培养箱中10-15分钟，或直到菌落的边缘四舍五入并开始从基质分离。
4. 倾斜板，吸出蛋白酶溶液，用DMEM/F12轻轻清洗细胞三次。使用 6 孔板时，每次洗涤使用 2 mL/孔，使用 10 厘米板时使用 6 mL。执行此步骤时，请确保菌落与矩阵保持连接。
5. 将大约 1.5 mL 的新鲜 mTESR 介质再添加到每口孔中（或 10 厘米板的 5 mL），并使用温和的移液将细胞从板上冲洗。
6. 使用 10 mL 移液器，轻轻吸气并在板内分配 hESC，直到其达到其原始^{尺寸的大约}1/30。完成这些步骤后，菌群簇应类似于 ±250-350 μm 大小的正方形。

3. 器官的生成

1. 将细胞转移到单个超低附件T75烧瓶中，该瓶中含有30 mL的mTESR介质，没有基本的成纤维细胞生长因子（bFGF）。
2. 第二天，倾斜烧瓶，使活细胞池在角落里（这可能需要5-10分钟的第一天，但会更快，因为集群变大）。
   注:如果此步骤或任何后续步骤中大量细胞粘附在烧瓶底部，则将细胞转移到新的烧瓶中。头两天有大量死细胞是正常的。执行介质更换时，请确保清除尽可能多的电池碎屑。
3. 一旦细胞沉降，吸出介质和死细胞留下约10 mL的含有活细胞的介质。
4. 加入±20 mL的低bFGF介质（DMEM/F12辅以1xN2、1x B27、1x L谷氨酰胺、1x NEAA、0.05%牛血清白蛋白（BSA）和0.1m单二甘油（MTG）补充30纳克/mL bFGF）。
5. 检查第 2 天的单元格。如果大多数细胞看起来健康和明亮，就没有必要做任何事情。但是，如果超过三分之一的细胞出现暗，则用 ±20 mL 的低 bFGF 介质，辅以 20 纳克/mL bFGF，将介质（使用与步骤 3.2 中的相同倾斜技术）替换。
6. 在第 3 天，用 20 mL 的低 bFGF 介质（使用步骤 3.2 中的倾斜技术）替换一半的介质，并辅以 10 纳克/mL bFGF。
7. 在第 5 天，用 20 mL 的神经感应介质（NIM:DMEM/F12、1x N2 补充剂、0.1 mM MEM NEAA、2 μg/mL 肝素）替换一半的介质（使用步骤 3.2 中的倾斜技术）。
   注:如果有任何大簇的细胞或器官比其他细胞或有机体大得多，它们应该从培养物中删除。大小根据显微镜下的外观估计;例如，使用带心的目镜。大多数有机物的大小相似（大约100×20μm）。我们移除了大约2倍小于或大于其他的有机物。
8. 每隔一天用 NIM 替换一半的介质（±15 mL）（使用倾斜技术）。
9. 在培养3周后，向介质中加入100x青霉素/链霉素（NIM:DMEM/F12，1x N2补充剂，0.1mM MEM NEAA，2 μg/mL肝素），最终浓度为1倍（如果需要的话）。每隔一天刷新一次媒体。
   注:在这种方式下，我们在文化中保持了长达6个月的有机物。

4. RNA提取和制备

1. 使用 10 mL 移液器从烧瓶中轻轻提取大约 15 个有机物（取决于大小），然后放入 1.5 mL 管中。
   1. 在离心机中轻轻颗粒有机物（200 x g 1 分钟），然后用 1x Dulbeco 的 PBS （DPBS） 冲洗三次。
2. 使用经过验证的系统或协议（例如，RNeasy 试剂盒）提取 RNA。
3. 测量每个样品的光学密度值为 260 和 280 nm。
4. 使用经过验证的系统或协议（例如，iScript cDNA 合成试剂盒）准备 cDNA。
5. 使用预先验证的引源 （表 1） 执行 qRT-PCR，包括至少一个内务管理基因。

5. 免疫性化学

1. 固定
   1. 制备4%的甲醛（PFA）溶液，并将其置于4°C。
   2. 使用无菌剃须刀，切断无菌转移移液器的尖端。
   3. 使用切割转移移液器轻轻提取有机物，因为它们很容易破碎，特别是当它们变大时，并将其放入带有附加介质或 DPBS 的 6 孔板中。
   4. 倾斜板，吸气介质，然后更换为 1x DPBS。用1x DPBS再冲洗两次细胞。
   5. 用 4% PFA 溶液替换 DPBS，并在 4°C 处放在摇摇器上。
      注:虽然我们固定2天（对于小器官）到7天（对于器官>3个月），较短的时间（例如，16-24小时）也可能是可能的。
   6. 在 DPBS 中制备 30%、20% 和 10% 蔗糖溶液。
   7. 在 PFA 中固定后，用 10% 蔗糖溶液更换，并在 4°C 的摇摇器上放置 24 小时。
   8. 用20%蔗糖代替10%蔗糖，并在4°C下放在摇摇器上24小时。
   9. 用30%蔗糖代替20%蔗糖，并在4°C下放在摇摇器上24小时。
2. 冻结部分
   1. 准备一层平坦的干冰，并在上面放置一个贴有标签的塑料模具。
   2. 将一层最优切削温度介质 （OCT） 倒入模具中，使其开始变硬（几秒钟内）。
   3. 使用切尖的转移移液器在模具中将一些有机体放在 OCT 的顶部，并密切注意有机体的位置。
   4. 慢慢加入OCT，直到模具饱满，有机物被覆盖。让它完全硬化10分钟。
      注:虽然冷冻超过10分钟有助于确保多种有机物在切片时的理想相对位置，但可以使用乙醇干冰混合物或液氮更快地冻结。
   5. 用标记标记器官的相对位置，使其在切割时更容易找到它们。
   6. 将模具放入袋子或包装盒中，并储存在 -80°C，直到准备好切割部分。
   7. 使用低温片，切片 10 μm 部分，并将组织放在贴有正电荷的幻灯片上。
3. 染色
   1. 制备阻断液（0.3%Triton X-100，PBS中4%正常驴血清）。
   2. 使用疏水性纸笔在组织周围绘制。
   3. 用 PBS 冲洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。
   4. 在室温下用阻隔溶液更换PBS1小时。
   5. 在4°C过夜4°C时，用抗体溶液（适当浓度的抗体，0.1%Triton X-100，PBS中4%正常驴血清）替换阻断溶液。
   6. 第二天，用PBS洗3次幻灯片，每次10分钟。
   7. 在室温下，用在抗体溶液中稀释1小时的适当二级抗体（在适当浓度下）替换PBS。
   8. 每次用 1x PBS 冲洗 3 次 10 分钟。
   9. 涂抹 4'，6-二酰胺-2-苯胺醇 （DAPI） 污渍，用 1x PBS 冲洗三次，每次 10 分钟。
   10. 用安装解决方案将盖板贴在幻灯片的前面，在黑暗中室温下晾干，并在黑暗中储存在 4°C 处。

Results

图 1显示了多个时间点的代表性亮场图像，以演示细胞/有机体在协议的不同阶段的外观。hESCs被从组织培养板中取出，分解成小块，并放置在T75超低附着瓶中，在那里形成球体。需要注意的是，这些细胞看起来明亮，大小相似，这些簇的中心没有黑暗的垂死细胞。细胞逐渐断掉bFGF。第5天，他们被安置在神经诱导介质中，在整个文化时期，他们一直留在这种媒介中。虽然随着时间的推移，有机体变大，因此变暗，但重要的是要注意神经玫瑰花状结构（黑色箭头），这些结构存在于整个大脑器官发育和膨胀中。玫瑰花表示神经分化的开始，并包含胚胎神经管的特征，显示上皮特征和周围一个表干^15。

在培养中5个月对有机体进行血氧素和欧辛染色表明，即使在中心也没有大量坏死，这是最初关注的，因为文化系统停滞（图2A）。这些器官在由经验丰富的神经病理学家进行光微观评估的基础...

Discussion

与其他有机体模型类似，这是一个带有几个警告的人工系统。虽然在整体表达水平上几乎没有批次变化，但单个器官确实表现出差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每一个有机体中并不相同（图 3）。虽然qPCR适合寻找细胞批次的整体变化，但附加技术，如单细胞RNAaq，将在今后的研究中使用，以逐细胞收集更多信息。这个系统的另一个限制是，它没有像最近的一些研究17、18、19那样，将血管整合在有机体中。然而，将hESC从低氧环境过渡到高氧环境可能更类似于发育中的胚胎中的厌氧过渡到有氧过渡。

该协议中的关键步骤是形成神经球以及适当的维护，包括使用适当的培养基进行介质变化，以确保生长的有机体的健康细胞和足够的营养，而不会过度拥挤.为了解决细胞增殖或分化不足的问题，我们建议从一批新的低通道ESC和新鲜准备的介质（包括补充剂）开始。有时可能会有试剂和材料的批次变化。因此，我们建议购买多...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A11029
Alexa Fluor 546 山羊抗兔	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A11035
B27 补充剂	Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	17504-044
bFGF	Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A9647
BX43 显微镜	奥林巴斯，日本
DAPI 染色 Thermo	Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies，加拿大温哥华	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	11330-032
DPBS	Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023
FluroSave	MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿	345789
GFAP 抗体	NeuroMab，Davis，CA	N206A/8
生长因子还原基质胶（基质）	Corning，Corning，NY，USA	356231
H9 hESCs	WiCell，美国威斯康星州麦迪逊	WA09
肝素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	9041-08-1
iQ SYBR Green 超混合液	Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	1708880
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	1708891
L-谷氨酰胺	Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	25030-081
单硫甘油	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	M6145
mTESR 培养基	STEMCELL Technologies，加拿大温哥华	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products，美国加利福尼亚州西萨克拉门托	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	ND-2000
NEAA	Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	11140-050
正常驴血清 （NDS）	ImmunoResearch Laboratories Inc.， West Grove， PA， USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek， Torrance， CA， USA	25608-930
PFA	电子显微镜科学， 宾夕法尼亚州哈特菲尔德	RT15710
qPCR 机	Bio-Rad，CFX96，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	1855196
RNeasy 套件	Qiagen，德国希尔登	74104
Sox2	MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿	AB5603
TMS-F 显微镜	尼康，美国纽约州
Triton X-100	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T8787-100ML
超低附着度 T75 培养瓶	Corning， Corning， NY， USA	3814