一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

摘要

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。

摘要

由胚胎干细胞分化而来的人脑类器官为研究三维系统中多种细胞类型之间复杂的相互作用提供了独特的机会。本文介绍一种相对简单且成本较低的类器官制备方法。在本方案中，人多能干细胞被解离为小细胞团簇而非单细胞，并在不含异源基底膜基质或外源生长因子的基础培养基中培养，从而允许内在发育信号指导类器官的形成。该简易系统可产生多种脑细胞类型，包括胶质细胞和小胶质细胞、干细胞以及前脑、中脑和后脑的神经元。本方案生成的类器官还表现出适当的时间和空间结构特征，可通过明场成像、组织学、免疫荧光以及实时定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）加以验证。由于这些类器官包含来自大脑不同区域的细胞类型，因此可用于研究多种疾病。例如，在最近发表的一篇论文中，我们展示了利用本方案生成的类器官研究缺氧对人脑影响的应用。该方法可用于探究一系列以往难以研究的病理状态，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经系统疾病。

引言

由于存在诸多实际和伦理限制，研究人类大脑一直面临巨大困难。尽管利用啮齿类动物开展的研究对于理解人类大脑至关重要，但小鼠大脑与人类大脑存在许多差异^1,2。有趣的是，小鼠的神经元密度至少比灵长类动物大脑低7倍以上^3,4。虽然从进化角度来看，灵长类动物比啮齿类动物更接近人类，但对大多数研究人员而言，使用灵长类动物并不现实。本实验方案的目的是在维持脑细胞多样性和细胞组织结构的前提下，采用一种更简化且成本较低的方法，重现人类大脑的许多重要特征，而无需使用异源基底膜基质或外源性生长因子。

Sasai 实验室的开创性工作采用拟胚体无血清培养（SFEBq）方法，从经信号诱导的胚胎干细胞（ESCs）中生成二维和三维的神经细胞类型^5,6。许多人类脑类器官方法也大致遵循了从经信号诱导的 ESCs 出发的技术路径^7,8。相比之下，本实验方案起始于脱离培养的人类胚胎干细胞（hESCs）聚集体，类似于 Thomson 实验室和 Zhang ....

方案

1. 干细胞维持

1. 根据制造商说明，将 H9 hESC 在一层生长因子减少的基底膜基质（参见材料表，下文简称为基质）上进行培养。
   1. 为包被一个 6 孔板或一个 10 cm 培养皿，将 100 µL 基质与 5.9 mL 冰冷的 DMEM/F12 培养基混合。用封口膜包裹培养板，于 4 °C 过夜保存。次日吸除多余基质/培养基后用于细胞传代。
2. 每周以约 1:12 的分裂比例每 7 天传代一次。使用 mTESR-1 培养基，在 37 °C、低氧培养箱（5% O₂、5% CO₂）中培养细胞。每天更换培养基。在传代期间使用玻璃工具剔除正在分化的细胞。
3. 在用于类器官生成前 4 至 6 天应对 H9 细胞进行传代。细胞应以约 1:8 的细胞簇比例进行传代。具体操作如下：首先用 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，然后用中性蛋白酶（例如 dispase，下文简称为蛋白酶）消化细胞，再用 DMEM/F-12 冲洗，并将 30–60 个细胞簇以约 20% 汇合度接种至 4 个培养板（6 孔板或 10 cm 培养皿）中。收获前两天，将细胞转移至常规培养箱（21% O₂、5% CO₂）。开始类器官形成时，培养板细胞汇合度应达到约 80%。

2. 类器官培养中 ....

结果

图1展示了多个时间点的代表性明场图像，用以说明细胞/类器官在整个实验方案不同阶段的形态特征。人胚胎干细胞（hESCs）从组织培养板中被取出，分割成小块后，置于T75超低吸附培养瓶中，形成球状结构。需要注意的是，这些细胞明亮且大小均一，细胞团中心无发暗或死亡细胞。细胞逐渐撤除bFGF。在第5天，细胞被转入神经诱导培养基，并在整个培养期间持续使用该培养基。尽管类器官随时间推移逐渐增大而变暗，但需注意在整个脑类器官发育过程中出现并不断扩增的神经玫瑰花环样结构（黑色箭头）。这些玫瑰花环结构标志着神经分化的启动，具有胚胎神经管的特征，表现出上皮特性，并围绕一个顶端腔隙¹⁵。

培养5个月后，类器官经苏木精和伊红染色显示，即使在中心区域也未出现大量坏死，而这一点在最初使用静态培养系统时曾令人担忧（图2A）。经经验丰富的神经病理学家进.......

讨论

与其他类器官模型类似，这是一种存在若干局限性的人工系统。尽管在整体表达水平上批次间的差异较小，但各个类器官之间仍表现出个体差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每个类器官中并不完全相同（图3）。虽然qPCR适用于检测细胞批次的整体变化，但未来的研究将采用单细胞RNA测序等其他技术，以获取单个细胞水平上的更详细信息。该系统的另一个局限性在于，类器官内部尚未整合血管系统，而这一点已在一些较新的研究中实现^17,18,19。然而，将hESCs从低氧环境过渡到高氧环境，可能更接近于胚胎发育过程中从无氧到有氧的转变过程。

本方案中的关键步骤包括神经球的形成，以及适当的维持培养，包括使用合适的培养基进行换液，以确保类器官在生长过程中细胞健康且获得充足的营养，同时避免过度拥挤。若出现细胞增殖不足或分化不充分的问题，我们建议使用新批次的低代次胚胎干细胞（ESCs）以及 fresh.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 山羊抗兔	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 补充剂	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 显微镜	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI 染色剂	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP 抗体	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
生长因子减少型 Matrigel（Matrix）	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESC	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
肝素	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-谷氨酰胺	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
巯基甘油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR 培养基	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
正常驴血清（NDS）	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR 仪	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy 试剂盒	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F 显微镜	Nikon, Melville, NY, USA
吐温 X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
超低吸附 T75 培养瓶	Corning, Corning, NY, USA	3814