无参考牵引力显微镜平台的制造和实施

Summary

该协议提供了用于实施多光子光刻的指令，以制造嵌入聚（乙二醇）水凝胶中的荧光基准标记的三维阵列，用作无参考、牵引力显微镜平台。使用这些说明，简化了 3D 材料应变的测量和蜂窝牵引力的计算，以促进高通量牵引力测量。

Abstract

量化细胞引起的材料变形提供了有关细胞如何感知和响应其微环境的物理特性的有用信息。虽然有许多方法可用于测量细胞引起的材料应变，但这里我们提供了一种以无参考方式以亚微米分辨率监测应变的方法。使用双光子激活光刻图案化过程，我们演示如何生成机械和生物主动可调合成基板，其中包含嵌入式荧光基准标记阵列，以轻松测量三维 （3D） 材料变形轮廓，以响应表面牵引力。使用这些基板，可以使用感兴趣的细胞的单个 3D 图像堆栈映射细胞张力曲线。我们采用这种方法的目标是使牵引力显微镜成为研究细胞干扰转导过程的研究人员，尤其是该领域新手更容易获得和更容易实施的工具。

Introduction

牵引力显微镜 （TFM） 是使用附着细胞和收缩细胞生成的基准标记的插值位移场近似细胞牵引力的过程。使用TFM，可以研究细胞外环境中的机械线索对重要的细胞过程的影响，如增殖、分化和^迁移。，5，6，7，8，9，10，11，12。 遗憾的是，许多现有方法可能难以实现，或者需要熟悉高度专业化的分析和计算工具，从而使没有经验的研究人员难以使用 TFM。我们描述了一种生成 TFM 平台的方法，该方法消除了分析中的一些困难，同时还提供高吞吐量数据采集。

在现有的TFM方法中，最常用的用于....

Protocol

1. PEGDA基水凝胶的光聚合

1. 收集试剂
   1. 收集锂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酸酯（LAP），3.4 kDa聚（乙酰）乙二醇二甘醇（PEGDA），n-乙烯基丙酮（NVP），AlexaFluor 488标签PEGDA（PEG-488），AlexaFluor 633标记PEGDA（PEG-633），和PEGylatedPEG-RGDS）从各自的冰柜中，使每个冰柜都室温。
   2. 在单独的琥珀微离心管中，测量3毫克LAP、10毫克PEGDA、5毫克PEG-488、20mgPEG-633和6mgRGDS肽。
2. 预聚合物溶液的制备
   1. 将 LAP 溶解在 1 mL 的磷酸盐缓冲盐水中（PBS，pH 7.4）。使用溶解的 LAP 溶液的 200 μL 溶解 PEGDA。然后，使用 PEGDA 溶液的 200 μL 溶解 PEG-RGDS。
      注:如果需要控制细胞形状，在基础水凝胶预聚合物溶液中省略PEG-RGDS，因为将在协议的后面通过双光子激光扫描光刻添加。
   2. 使用 80 μL 的 PBS 溶解 PEG-488。将2.5 μL的这种溶液添加到聚合物前溶液中。
      注:PEG-488将为最终水凝胶提供荧光信号，可用于在图案化期间导航，并可改变浓度以改变信号强度。
   3. 通过 0.2 μm 聚四氟乙烯 （PTFE） 过滤....

Results

在整个协议中，有许多检查点提供反馈，以评估模式化过程的质量。为了提供有关如何评估每个检查点的进度的见解，我们提供实际实验的代表性结果。研究结果强调了该协议在用于人类脐带内皮细胞（HUVECs）的TFM分析制备的光型水凝胶上的应用。结果包括原始图像数据以及每个关键步骤的处理数据输出。

第一个检查点发生在步骤 4，一旦基准标记阵列在水凝胶中进行了光图案。收集图像堆栈时，生成的图像应显示一个常规的图案特征数组（图1A-C），这些特征在强度上振荡，作为图像堆栈中的 z 位置的函数。如果图案表面不是完全水平，则每个图像切片的不同区域在这些振荡方面可能看起来不同相位;这是预料之中的，不应影响分析，除非在极端情况下。

其余检查点利用在分析给定 COI 期间运行的每个脚本的输出。track.m脚本提供了多个诊断图像，包括荧光基准标记的 z 投影 （图 2A）.......

Discussion

该协议的目标是提供一个工作流，以缓解与生成和分析 TFM 数据相关的许多困难。一旦制备，光图案水凝胶易于使用，只需要了解标准组织培养实践和荧光显微镜。无参考方面允许在充满细胞的氢凝胶上无忧无虑地导航，并消除繁琐的图像处理步骤，如参考图像和变形图像之间的图像配准。生成的分析几乎完全自动化，从各个 COA 的数据可以从头到尾分析不到 10 分钟。

该协议的主要挑战来自光型水凝胶的制造。由于该协议中使用的大多数试剂都是内部合成的，我们预计使用合成水凝胶材料经验不足的用户可能会有些不敢尝试该协议。也就是说，该协议中使用的所有 PEGylated 组件都是使用一锅反应从几乎相同的协议中合成的，许多组件可以从商业供应商处购买。

该协议还需要掌握激光扫描显微镜的使用。激光扫描参数需要针对每台不同的显微镜进行优化，因为激光强度、物镜和其他显微镜组件会有所不同，即使在同一型号的显微镜之间也是如此。确定照片图案的最佳显微镜设置的一种简单方法是执行具有不同设置的扫描面板。任何影响样品接收到的总激光曝光的设置都会影响图案标记的大小和质量。这包括:扫描.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 注射器过滤器，0.2 &μ;m Supor 膜，低蛋白结合	Pall	PN 4602	允许在基础凝胶合成和后续光刻步骤之前过滤大分子单体溶液。
丙烯酸酯-硅烷官能化 #1.5 Coverslips	in-house	in-house	丙烯酸酯允许基础水凝胶结合到玻璃表面以固定水凝胶。参见参考资料：21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome	Zeiss		宽场显微镜，带有结构照明模块，用于捕获全聚焦方式 （TFM） 图像。
Chameleon Vision ii	相干公司		配备用于多光子光刻的激光扫描显微镜。
双面胶带， 9500PC， 6.0 mil	3M		将丙烯酸酯-硅烷官能化盖玻片粘合到培养皿上。
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	允许内衬双面胶带，以便将胶带送入绘图仪。
LSM-880	蔡司		激光扫描显微镜，用于多光子光刻。
MATLAB	Mathworks	R2018a	运行自定义脚本，为显微镜和TFM数据分析生成光刻指令。
型号 SC 绘图仪	USCutter	SC631E	将双面胶带切割成环，以将盖玻片绑定到培养皿上。
物镜 C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27	Zeiss		配备在宽场显微镜和激光扫描显微镜上，可用于光刻和TFM。
PEG-AF633	in-house	in-house	荧光团标记的丙烯酸酯 PEG 变体，用于创建基准标记物。请参阅参考资料：21
PEG-DA	em>in-house	in-house	水凝胶基材。参见参考文献：21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS 肽标记的单丙烯酸酯 PEG 变体，用于促进细胞粘附。参见参考资料：21
培养皿	CELLTREAT	229638	使用取芯钻头在每个培养皿的中心切出 8 毫米的孔，以适合基础水凝胶。
Sylgard 184 硅胶弹性体套件	道康宁	3097358-1004	用于创建垫片以控制基础水凝胶厚度（又名 PDMS）。
注射器，Leur-Lok，1 mL	BD	309628	允许在基础凝胶合成和后续光刻步骤之前过滤大分子单体溶液。
UV 灯	UVP	Blak-Ray®B-100AP	聚合基础水凝胶。
1-乙烯基-2-吡咯烷酮 （NVP）	Sigma-Aldrich	V3409-5G	自由基促进剂和共聚单体。改善光刻过程中聚乙二醇化荧光团的掺入。