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方法文章

无参考牵引力显微镜平台的构建与应用

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DOI：

10.3791/60383

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2019年10月6日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

本文内容

摘要

本方案提供了实施多光子光刻技术的详细步骤，用于在基于聚乙二醇的水凝胶中制备三维荧光基准标记阵列，作为无需参考物的牵引力显微镜检测平台。通过本方案，可简化三维材料应变的测量及细胞牵引力的计算，从而实现高通量牵引力测量。

摘要

量化细胞诱导的材料形变可提供有关细胞如何感知并响应其微环境物理特性的有用信息。尽管目前已有多种方法用于测量细胞诱导的材料应变，但本文介绍了一种无需参考点、具有亚微米分辨率的应变监测方法。通过双光子激活的光刻图案化工艺，我们展示了如何制备机械性能和生物活性均可调控的合成基底，该基底内嵌有荧光基准标记阵列，可方便地测量材料在表面牵引力作用下的三维（3D）形变分布。利用此类基底，仅需获取目标细胞的一组单次三维图像堆栈，即可绘制出细胞张力分布图谱。本方法旨在使牵引力显微镜技术对研究细胞力学转导过程的研究人员而言更加易于获取和实施，尤其适用于该领域的新手研究者。

引言

牵引力显微镜（TFM）是一种利用贴壁且具有收缩性的细胞所产生的标志物位移场插值，来估算细胞牵引力的方法。通过TFM，可以研究细胞外环境中力学信号对细胞增殖、分化和迁移等重要生物学过程的影响1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。然而，许多现有的方法实施起来较为困难，或需要掌握高度专业化的分析与计算工具，使得缺乏经验的研究人员难以应用TFM。本文介绍一种构建TFM平台的方法，可在降低分析难度的同时，实现高通量的数据采集。

在现有的牵引力显微镜（TFM）方法中，最常用于量化材料应变的方法是将微小的荧光标记物（通常是纳米或微米级的荧光微球）嵌入可变形水凝胶中，例如聚丙烯酰胺（PAA）或二丙烯酸聚乙二醇（PEGDA）13,14,15。基于微球的方法能够在目标细胞周围密集分布定位标记，以最大化位移采样密度。然而，微球在水凝胶中的分布无法直接控制，导致其空间排布具有随机性。这种随机分布会引发一系列问题，例如微球间距过近而难以准确分辨，或间距过远导致基质局部区域的数据质量低下。此外，由于在无细胞存在时无法预知定位标记的位置，因此对每组采集的细胞牵引力数据，都必须额外获取水凝胶在松弛状态下底层标记的参考图像。该参考图像用于通过计算受力图像与无应力图像之间的差异，来估算受力状态下的位移。为获得松弛状态，实验中通常需要对细胞进行化学松弛处理或完全去除。这一过程常常阻碍进一步的实验测量，限制了长期细胞研究的开展，并降低了实验通量。同时，参考图像的使用还需要借助图像配准技术来校正实验过程中可能发生的漂移，往往导致受力状态图像与参考图像之间繁琐的手动匹配操作。

其他被认为无需参考基准的牵引力显微镜（TFM）方法，通过高分辨率光刻、微接触印刷或微模塑等手段，对标志点（fiducial markers）的分布实施某种形式的控制16,17,18,19,20。无需参考基准的TFM基于如下假设：每个标志点的松弛状态可根据其在制备过程中被设定的位置进行预测。这些方法能够在单次图像采集过程中完整捕捉细胞的张力状态，通过将标志点位移与从标志点几何结构中可推断出的隐含参考状态进行比较，实现测量。尽管这些平台通常能够实现标志点位置的高度一致性，但与广泛使用的基于微球的方法相比，仍存在若干固有缺陷，包括：1）牵引力分辨率降低；2）对离焦平面位移的测量精度下降（在某些情况下完全无法测量）；以及3）平台基底和材料的可定制性降低（例如配体呈递方式、力学性能等）。

为解决这些不足，我们设计了一种新型的无需参考图像的牵引力显微镜（TFM）平台。该平台利用多光子激活化学反应，将少量荧光分子交联到水凝胶内特定的三维位置，形成作为基准标记的 fiducial markers，用于测量材料应变。通过这种方式，我们所设计的平台在功能上类似于基于微球的方法，但具有显著优势：基准标记被有序排列成网格状阵列，从而实现无需参考图像的材料应变追踪。这种无需参考图像的特性带来了诸多优点。首先，它能够非侵入性地监测细胞牵引状态（即无需松弛或移除细胞即可获取位移后基准标记的参考位置）。这是我们设计该系统的主要目标，因为我们希望将其他下游分析方法与TFM联用，而这一点在依赖终点检测且具有破坏性的传统TFM方法中难以实现。其次，基于网格阵列所构建的隐含参考体系，使得位移分析几乎可以完全自动化。阵列的规则性形成了可预测的分析流程，使异常情况（例如样本细胞数据中出现意料之外的伪影，如基准标记间距不理想或图像配准不匹配）的发生率降至最低。第三，无需采集参考图像，使得在同一份样本上长时间连续监测多个细胞成为可能。这与传统的基于微球的方法形成对比：后者依赖显微镜自动载物台的精确定位，若定位精度不足，则可能导致位置误差累积，增加参考图像与细胞张力图像之间正确配准的难度。总体而言，该平台显著提高了细胞张力数据采集的通量。

通过本实验方案，我们希望使读者熟悉所采用的双光子激光扫描光刻技术，该技术用于构建无需参考标记的牵引力显微镜平台，以测量接种在表面的细胞所产生的面内和面外牵引力分量。本方案未涵盖某些单体组分的合成过程。总体而言，这些反应包括此前已描述过的几乎相同的“一锅法”合成反应路线21，此外，这些产品的替代品也可直接购买获得。我们还希望使读者熟悉我们开发的基于软件的工具，这些工具旨在推动将 commercially-available 激光扫描显微镜用作三维打印设备，并便于对基准标记位移进行分析。

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方案

1. 光聚合PEGDA基水凝胶

  1. 收集试剂
    1. 从各自的冰箱中取出苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸锂（LAP）、3.4 kDa 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、AlexaFluor 488 标记的 PEGDA（PEG-488）、AlexaFluor 633 标记的 PEGDA（PEG-633）以及聚乙二醇化 RGDS 肽（PEG-RGDS），并将其恢复至室温。
    2. 在不同的棕色微量离心管中，分别称取 3 mg LAP、10 mg PEGDA、5 mg PEG-488、20 mg PEG-633 和 6 mg RGDS 肽。
  2. 预聚物溶液的制备
    1. 将 LAP 溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中。取 200 μL 溶解后的 LAP 溶液用于溶解 PEGDA。然后，取 200 μL PEGDA 溶液用于溶解 PEG-RGDS。
      注意：若需控制细胞形态，可在基础水凝胶预聚物溶液中省略 PEG-RGDS 的溶解步骤，因其将在后续实验流程中通过双光子激光扫描光刻技术添加。
    2. 用 80 μL PBS 溶解 PEG-488。取 2.5 μL 该溶液加入预聚物溶液中。
      注意：PEG-488 可使最终形成的水凝胶产生荧光信号，便于图案化过程中的定位；可通过调整其浓度来改变荧光强度。
    3. 将完整的预聚物溶液通过 0.2 μm 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤，以去除溶液中可能存在的颗粒物。若试剂合成得当，滤膜不应发生堵塞。
  3. 基础水凝胶的光聚合
    1. 在全氟烷氧基烷烃（PFA）薄而平整的片材上放置 3 μL 预聚物溶液。在液滴周围放置厚度为 150 μm 的平直聚二甲基硅氧烷（PDMS）条，但不与预聚物液滴接触。将一块经丙烯酸硅烷化处理的盖玻片21,22,23,24置于 PDMS 上，使预聚物液滴位于盖玻片正下方，从而将液滴压平至与 PDMS 间隔层相同的厚度。
    2. 将夹层中的预聚物溶液暴露于紫外光下，直至完全形成水凝胶（约在 370–400 nm 波长、14 mW/cm2 光强下照射 1 分钟）。
    3. 小心地将盖玻片从 PDMS 间隔层上分离，并使用高性能双面丙烯酸胶粘剂将其固定于开口式培养皿底部。对粘合界面施加压力，确保盖玻片、胶粘剂与培养皿之间形成完全密封，注意避免玻璃破裂。
    4. 用经无菌过滤的 PBS 冲洗培养皿中的水凝胶，以尽量减少生物污染物和颗粒杂质。
    5. 根据需要重复步骤 1.3.1–1.3.4，以制备所需数量的水凝胶。
    6. 向剩余的 800 μL LAP 溶液中加入 8 μL NVP，并将此溶液及未溶解的 PEG-633 保存至准备进行图案化时使用。
      注意：含 NVP 的 LAP 溶液对光极为敏感，若未避光保存会发生聚合。用铝箔包裹离心管可延长其保存期限。

2. 创建图案化指令

  1. 设计二值图像
    1. 为设计用于规定基准标记阵列的虚拟掩模，使用图像处理或绘图软件创建一幅长宽比为100:1的图像（例如，2000像素长 × 20像素宽）。
    2. 在图像的长轴中心位置，于黑色背景上创建一行由100个等间距白色像素组成的像素行。
    3. 将该图像保存为 *.tif 文件格式。
      注意：若需控制细胞形态21,25,26,27,28，需额外创建一个虚拟掩模。使用方形图像画布，在黑色背景上绘制白色的正相特征。为估算白色特征的合适尺寸（该特征最终将支持细胞黏附），可假设图像的总尺寸相当于激光扫描光刻所用显微镜视场的大小。
  2. 将二值图像转换为数字掩模
    1. 从软件仓库免费下载 LSM-ROI-Generator 函数29。
    2. 打开 Matlab，找到已下载的函数文件所在目录。进入该目录后，打开 run_script.m Matlab 脚本并运行该脚本。
    3. 选择要转换的二值 *.tif 文件，然后选择一个文件夹用于保存区域文件。
    4. 输入所选图像期望的最终尺寸（单位为微米）。输入的图像将按此参数进行缩放和定尺寸。为确保整个图像能容纳在显微镜视场内，图像的总尺寸必须小于或等于显微镜视场的尺寸。
    5. 若要创建单像素阵列，在 ROI-Generator 选项中，确保取消勾选 Small Regions/Single Pixels 下的 Remove 复选框，勾选标记为 Squares 的复选框，并取消勾选 Horizontal Break Lines 下的 Use。然后点击 OK。
      注意：若创建用于生成单细胞图案的区域文件，则默认选项已适用。
    6. 在先前指定的文件夹中找到生成的 *.ovl 文件。该文件需被传输至显微镜，以加载在双光子激光扫描光刻过程中控制激光快门的指定区域。

3. 制作基准标记阵列

  1. 浸泡基础水凝胶
    1. 在低光照条件下，向步骤1中制备的AF633中加入200 μL LAP/NVP溶液。避光条件下充分混匀。
    2. 从步骤1中含PEGDA水凝胶的培养皿中移除所有PBS溶液。
    3. 将溶解的PEG-633加入水凝胶中，形成完全包裹基础水凝胶的液滴。
      注意：如果培养皿中的孔略大于水凝胶，则该孔可作为容纳图案化溶液的小室。否则，在加入图案化溶液前必须确保盖玻片完全干燥，否则溶液可能从水凝胶表面流走，导致水凝胶在图案化过程中脱水。
    4. 将培养皿装载到显微镜载物台的样品架上，并盖上培养皿盖。在避光条件下让图案化溶液至少浸泡水凝胶30分钟。
      注意：在浸泡期间可开启并配置显微镜。使用488 nm激光在浸泡过程中对水凝胶成像无影响。
  2. 配置显微镜
    1. 使用488 nm激光线及适用于成像AlexaFluor 488的滤光片，通过PEG-488信号定位水凝胶。屏蔽探测器对更长发射波长的信号采集，以避免来自PEG-633的信号饱和。
    2. 通过垂直和水平拼接扫描，在XY平面上找到水凝胶的中心，并将载物台位置归零。
    3. 使用线扫描和z轴堆栈功能找到水凝胶的表面，并将焦平面位置归零。通过在远离XY中心的位置重复线扫描以确定表面位置，并调节显微镜载物台的调平螺丝来实现水凝胶的调平。
    4. 在显微镜软件工作区中，创建一个独立的光图案化实验文件。将多光子功率设置为1.8%（在物镜后孔径处测得740 nm波长下为15.5 mW），扫描速度设置为6（0.1 µm/µs）。调整图像帧的像素尺寸，使每个像素对应0.1 µm，并设置宽高比为100:1。
    5. 将步骤2.2中创建的区域文件（*.ovl）加载至区域标签页。使用宏命令将所有区域设置为采集状态。
    6. 开启z轴堆栈功能，设置层间距为3.5 μm，总深度为28 μm，共9层z切片。
    7. 使用位置功能设定水凝胶上将要光图案化标记阵列的具体位置。
      注意：这些位置的z坐标将决定每个z堆栈的中心位置；在设定位置时，需确保每个位置都能保证图案化体积在所有表面位置均与水凝胶重叠。
    8. 使用拼接功能在每个位置指定额外的行和列。注意避免图案化区域之间的重叠。理想情况下，应使图案化区域足够接近，以消除位置之间空置且无法使用的区域。
  3. 光图案化标记阵列
    1. 当浸泡时间接近30分钟时，每隔5分钟连续进行z堆栈线扫描，检测水凝胶表面相对于归零焦平面位置的变化，以判断是否发生溶胀。
    2. 若在5分钟间隔内表面位置无变化，则加载并运行步骤3.2.4中创建的图案化设置。
    3. 图案化实验完成后，使用488 nm激光验证水凝胶表面在图案化过程中是否发生位移。
      注意：若水凝胶表面位置与图案化前不一致，可能存在以下几种情况：水凝胶在图案化前未达到溶胀平衡、图案化过程中开始脱水，或显微镜发生z轴漂移。应在后续图案化运行中识别并纠正该表面位移的来源。
    4. 将水凝胶从显微镜上取下，并吸除培养皿中的PEG-633溶液。
      注意：水凝胶仍对光极为敏感。在完成所有清洗之前，必须始终保持水凝胶处于避光环境中。
    5. 用无菌过滤的PBS清洗水凝胶3次，确保每次清洗后完全移除清洗液。每15分钟重复一次三重清洗，持续1小时。
    6. 让水凝胶在PBS中过夜清洗。
      注意：本方案可在此处暂停。
    7. 用PBS对水凝胶进行三次清洗。然后迅速用200度乙醇溶液进行三次快速清洗，再用PBS再进行三次清洗。切勿让水凝胶长时间浸泡在200度乙醇中。
      注意：图案化溶液中的某些组分可能析出并沉积在水凝胶表面，在633 nm激发下呈现为一层固体荧光层（约1–5微米厚）。用200度乙醇清洗可去除这些不需要的组分。
  4. 通过连续光图案化生成单细胞图案（可选）
    注意：若需控制细胞铺展面积和形状，可进行多轮图案化。基础凝胶的初始配方中必须省略PEG-RGDS。建议最后进行标记阵列的图案化，以避免荧光标记物被漂白。
    1. 将20 mg PEG-RGDS溶解于步骤1中制备的LAP/NVP溶液中。
    2. 使用PEG-RGDS溶液代替PEG-633溶液，重复步骤3.1–3.3。使用定义单细胞图案的相应区域文件（参见步骤2中的说明）。
      注意：为可视化PEG-RGDS图案阵列，有多种选择。可使用荧光标记的PEG-RGDS变体21,30，或在PEG-RGDS中掺杂荧光PEG。推荐方法：也可将488 nm激光线与多光子图案化激光同步运行，使基础水凝胶中的PEG-488信号发生漂白，从而形成与RGDS整合区域相对应的非荧光区域。

4. 可视化定位标记阵列

  1. 获取所制备阵列的z轴层扫图像
    1. 将培养皿中的PBS替换为细胞培养所用的培养基。
      注意：建议在图像采集期间使用不含酚红的培养基，以避免光毒性。
    2. 浸泡1小时后，使用配备结构照明显微模块和高倍水浸物镜的宽场荧光显微镜，并选用适用于荧光定位标记的滤光片组，对水凝胶进行成像观察。
    3. 采集高分辨率的z轴层扫图像序列（z轴步距为0.4 μm），成像深度至少覆盖图案化区域水凝胶表面以下20 μm的范围，确保z轴层扫的上限包含至少1–2张物理位置位于图案化区域上方的图像（即荧光定位标记已不可见，仅存在背景噪声的位置）。
      注意：采集该图像序列对于验证所有图案化参数的正确性至关重要，并可在第5.3步中与细胞数据一同进行分析。

5. 使用光图案化水凝胶进行牵引力显微镜检测

  1. 接种细胞
    注意：为保持无菌状态，需遵循所有标准的组织培养操作规范。
    1. 在接种细胞之前，按照相应细胞系的标准操作流程进行细胞培养与维护。
    2. （可选）若对水凝胶的无菌性存在顾虑，可将水凝胶在含抗生素的培养基中孵育24小时，随后用正常培养基清洗。
    3. 接种细胞时，首先将经胰酶消化的细胞重悬于最终用于水凝胶培养皿中的培养基体积中。
    4. 移除水凝胶培养皿中的全部溶液，并替换为含细胞的培养基。
    5. 让水凝胶在含细胞的培养基中静置10分钟，避免扰动。
    6. 小心将培养皿转移至培养箱中，在培养箱中维持4小时，或直至细胞明显贴壁。
    7. 将含细胞的培养基更换为无细胞的培养基，以去除未贴壁的细胞。
  2. 获取细胞与定位标记物的图像
    1. 将显微镜的培养腔温度设定为37 °C，CO2浓度设定为5%，并等待腔体达到设定值。
    2. 将培养皿放置在样品支架上，定位至图案化区域。
    3. 找到目标细胞（COI），并获取该细胞的透射光或荧光图像。
      注意：该图像将用于后续分析中分割细胞边界，因此应能清晰显示细胞轮廓。
    4. 在目标细胞下方的图案化阵列上采集z轴层扫图像，操作同步骤4.1.4。
    5. 获取第二组目标细胞的透射光或荧光图像。
      注意：将第二组图像与第一组进行比较，以判断是否出现由光毒性导致的细胞损伤，并确定图像采集参数是否需要调整。若细胞在光照后发生收缩，则很可能已受到显著的光毒效应，可能影响实验结果。
    6. 对每个目标细胞重复步骤5.2.3–5.2.5。

6. 分析图像

  1. 图像文件的分析前准备
    1. 使用步骤 5.2 中收集的数据，制备围绕 COI 区域的裁剪图像堆栈，使该堆栈的底部图像（第一幅图像）代表满足以下条件的第一帧：（1） >80%的图案化标记柱可见，（2）图像堆栈中最上方的图像（最后一幅）不再包含任何可见的定位标记（即位于水凝胶表面以上），且（3）在关注区域周围至少有20 μm范围的无应力定位标记。
      注意：裁剪图像可显著缩短分析过程中的计算时间。后续步骤中的分析代码可在不裁剪图像的情况下运行，但不建议如此操作。
    2. 创建透射光和/或荧光图像的裁剪图像，使其XY方向的裁剪范围与前一步骤中图像栈的XY裁剪范围一致。
    3. 使用裁剪后的透射光图像或荧光图像中更能代表细胞形态的图像，通过手动（描记细胞边界）或图像处理工具进行图像分割。
    4. 将该图像转换为二值图像，使细胞内部为黑色（即强度值 = 0），细胞周围区域为白色（即强度值 ≠ 0）。将此图像保存为 二值掩膜.tif.
    5. 为每个COI，将图像堆栈文件、透射图像文件和二值掩膜文件收集到同一个文件夹中。
  2. 在图像上运行分析脚本
    1. 从软件仓库免费克隆或下载 TFM 分析函数29应下载整个代码库，因为子文件夹中包含大量依赖项。
    2. 打开 Matlab，将代码仓库本地克隆目录及其所有子文件夹添加到路径中。
    3. 将 Matlab 工作区中的目录设置为步骤 6.1 中已准备好的图像所存储的文件夹位置。
    4. 打开并运行 tracking.m 脚本。当系统提示时，按照指示加载相应的图像，执行初步的预处理步骤，并对目标追踪算法进行错误检查。
    5. 脚本完成后，打开并运行 dispShear.m 功能。该脚本无需用户输入。
    6. 一旦 dispShear.m 脚本已执行完毕，请打开并运行 disp3D.m如果提示打开任何图像，请按照说明操作。
      注意：运行过程中，脚本可能会要求用户在图案化阵列的图像上绘制一条线。该线应代表图案化过程中扫描激光的主要运动轴，并与一排图案化的基准标记对齐。此过程用于指示代码哪一方向（即基准标记的行或列）更可能产生对齐度最高的基准标记行。
    7. 一旦 dispShear.m 代码已运行完毕，执行 dispSurface.m 代码 随后 interpFinal3D_2.m 代码。这些脚本不应需要用户输入。
      注意： interpFinal3D_2.m 该脚本利用外部获取的软件将位移数据转换为表面牵引力，该软件此前已有描述31. 应用这些外部函数时， interpFinal3D_2.m 将位移数据插值到均匀网格中，以作为转换函数的输入。如果使用不同的转换方法，或不需要计算牵引力，则可跳过此步骤。
    8. 所有脚本运行完毕后，确保所有数据和输出文件均位于初始目录中。
    9. 对每个COI重复步骤6.2.3至6.2.8。
      注意：在代码仓库中有一个文件夹，包含可在一系列目录上自动批量运行各脚本的脚本程序。有关如何使用这些自动化脚本的说明，请参阅脚本本身（即代码中的注释）。

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结果

在整个实验流程中，设有多个检查点，用于提供反馈以评估图案化过程的质量。为了帮助理解如何在各个检查点评估实验进展，我们提供了实际实验的代表性结果。这些结果展示了本方案在为进行人脐静脉内皮细胞（HUVECs）牵引力显微镜分析（TFM）而制备的光图案化水凝胶上的应用。结果包括每个关键步骤的原始图像数据以及经过处理后的数据输出。

第一个检查点出现在第4步，即在水凝胶中完成基准标记阵列的光刻图案化之后。在采集图像堆栈时，所得图像应显示规则排列的图案化特征（图1A-C），这些特征在图像堆栈中的不同z位置处呈现强度振荡。如果图案化表面未完全水平，每个图像切片的不同区域在这些振荡中可能表现出相互之间的相位差异；这种情况是正常的，在极端情况下除外，通常不会影响分析结果。

其余检查点利用了在分析特定 COI 过程中运行的各个脚本的输出结果。tracking.m 脚本提供了若干诊断图像，包括荧光定位标记的 z 投影图像（<...

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讨论

本实验方案的目标是提供一种工作流程，以显著降低生成和分析TFM数据过程中的诸多困难。制备完成的光图案化水凝胶使用简便，仅需掌握标准的组织培养技术和荧光显微镜操作知识即可。无参考图像的设计使得在负载细胞的水凝胶上可自由导航，避免了在参考图像与形变图像之间进行图像配准等繁琐的图像处理步骤。最终的分析过程几乎完全自动化，单个感兴趣区域（COI）的数据从开始到结束可在10分钟内完成分析。

本方案的主要挑战源于光图案化水凝胶的制备。由于方案中使用的大多数试剂均为实验室自制，因此我们预计缺乏合成水凝胶材料经验的用户可能会对尝试本方案有所顾虑。尽管如此，本方案中使用的所有聚乙二醇化（PEGylated）组分均可通过几乎相同的单锅反应方案合成，且许多组分也可从商业供应商处直接购买。

本方案还要求操作者熟练掌握激光扫描显微镜的使用。由于不同显微镜之间的激光强度、物镜及其他组件参数存在差异，即使同一型号的显微镜也各不相同，因此激光扫描参数需针对每台显微镜进行优化。确定光刻图案最佳显微镜设置的一种简便方法是采用不同参数组合进行一系列扫描测试。任何影...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

O. A. Banda 获得了美国国家科学基金会 IGERT SBE2 奖学金（1144726）、特拉华大学提供的启动资金以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 IMAT 项目（R21CA214299）的资助。JHS 获得了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 IMAT 项目（R21CA214299）和美国国家科学基金会 CAREER 奖项计划（1751797）的资助。显微镜使用权限得到了美国国立卫生研究院-国家普通医学科学研究所（P20 GM103446）、美国国家科学基金会（IIA-1301765）以及特拉华州政府资助项目的资助。结构照明显微镜由特拉华州联邦研发资助计划（16A00471）资助购置。用于双光子激光扫描光刻的 LSM880 共聚焦显微镜通过共享仪器资助（S10 OD016361）购置。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Acrodisc 注射器滤器，0.2 μm Supor 膜，低蛋白结合PallPN 4602用于在基础凝胶合成及后续光刻步骤之前过滤大分子溶液。
丙烯酸酯-硅烷功能化 #1.5 盖玻片in-housein-house丙烯酸酯可促进基础水凝胶与玻璃表面结合，从而固定水凝胶。参见参考文献：21-24
Axio-Observer Z1 配备 ApotomeZeiss配备结构化照明模块的宽场显微镜，用于获取牵引力显微镜（TFM）图像。
Chameleon Vision iiCoherent Inc.装配于激光扫描显微镜，用于双光子光刻。
双面胶带，9500PC，6.0 mil3M用于将丙烯酸酯-硅烷功能化盖玻片粘附至培养皿。
Flexmark90 PFW 衬垫FLEXconFLX000620用于双面胶带的衬里，便于将胶带送入绘图仪。
LSM-880Zeiss激光扫描显微镜，用于双光子光刻。
MATLABMathworksR2018a运行自定义脚本，生成显微镜光刻指令并分析牵引力显微镜（TFM）数据。
Model SC 绘图仪USCutterSC631E将双面胶带切割成环形，用于将盖玻片固定至培养皿。
物镜 C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27Zeiss安装于宽场显微镜和激光扫描显微镜，用于光刻和牵引力显微镜（TFM）。
PEG-AF633in-housein-house荧光标记的丙烯酸酯 PEG 变体，用于创建定位标记。参见参考文献：21
PEG-DAin-housein-house水凝胶的基础材料。参见参考文献：21
PEG-RGDSin-housein-houseRGDS 肽标记的单丙烯酸酯 PEG 变体，用于促进细胞黏附。参见参考文献：21
培养皿CELLTREAT229638使用打孔钻头在每个培养皿中心切割出 8 mm 的孔，以适配基础水凝胶。
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒Dow Corning3097358-1004用于制作间隔层，以控制基础水凝胶的厚度（即 PDMS）。
注射器，鲁尔锁型，1 mLBD309628用于在基础凝胶合成及后续光刻步骤之前过滤大分子溶液。
紫外灯UVPBlak-Ray® B-100AP用于聚合基础水凝胶。
1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）Sigma-AldrichV3409-5G自由基促进剂和共聚单体。在光刻过程中提高聚乙二醇化荧光染料的掺入效率。

参考文献

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