本文介绍了一种移植方法，可将供体大鼠乳腺上皮细胞移植至受体动物的肩胛间白色脂肪垫中。该方法可用于研究宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，且无需预先清除内源细胞，从而扩展了该技术的应用范围。
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摘要
摘要
早在20世纪70年代，研究人员已成功将乳腺上皮细胞移植到大鼠肩胛间白色脂肪垫中。利用移植技术嫁接乳腺上皮可借助青春期啮齿类宿主所提供的激素环境。这类研究非常适合探索各种生物学操作对乳腺发育的影响，并解析乳腺生物学的多个方面。一个常见但具有局限性的特点是，移植的上皮细胞会受到周围间质的强烈影响，并被内源性上皮细胞所排挤；若要利用天然乳腺组织，必须在移植前清除腹股沟白色脂肪垫中的宿主乳腺上皮。使用大鼠作为模式生物时的一个主要障碍是，在断奶后的大鼠中清除正在发育的乳腺树结构效率较低。当移植到无腺体的脂肪垫时，供体上皮细胞能够重新定植于被清除的宿主脂肪垫中，并形成具有功能的乳腺。肩胛间脂肪垫是此类移植物的另一种可选位置。其主要优势在于，该部位缺乏导管结构，却提供了促进上皮向外生长所必需的正常间质环境，且在大鼠体内易于操作。该技术的另一大优势是创伤极小，因为它避免了烧灼和切除正在生长的内源性乳腺树的需要。此外，肩胛间脂肪垫包含一条中线血管，可用于分隔不同的移植位点。由于内源性腺体保持完整，该技术还可用于比较内源性乳腺与移植乳腺的研究。本文描述了将乳腺上皮细胞移植至大鼠肩胛间白色脂肪垫的方法。
引言
出生后乳腺发育及导管形态发生过程在很大程度上受青春期开始时激素信号传导的影响。在小鼠和大鼠这两种常用的乳腺生物学模型生物中，该过程始于约3周龄，此时快速的细胞增殖与分化导致成熟实质组织的形成。成熟的乳腺能够经历多轮扩张与退化，这一特性自20世纪初以来一直受到研究关注th 世纪。在细胞过度增殖和癌症发生的研究背景下，乳腺移植技术于20世纪50年代发展起来1，并由Gould等人于1977年提出的定量方法进一步完善2,3,4啮齿类动物移植技术的不断完善，极大地推动了对正常乳腺生物学的理解，该技术至今仍被广泛用于研究各种处理方法和遗传操作对正常乳腺发育及疾病状态的影响。
许多假说通过乳腺移植技术得到提出并随后验证，该技术最早由DeOme等人于1959年首次描述1。数十年来的实验表明，从供体乳腺中切除的导管组织具有完全重建整个脂肪垫的能力5,6,7，并提示乳腺发育的关键组分存在于这些上皮结构中。后续在小鼠中进行的研究表明，单个乳腺干细胞即可重建去细胞化的脂肪垫，从而促成了基底细胞和腔面乳腺上皮细胞共同单一生殖前体细胞的发现8,9,10。与这些结论一致，有研究认为移植过程通过细胞可塑性增加了具有多谱系重建潜能的细胞群体，使移植细胞能够发育成功能性乳腺组织7,10,11,12,13。重要的是，在啮齿类动物中使用移植技术可克服细胞培养所诱导的异常局限性14，并且通常仅需数周即可获得实验结果。
尽管该操作最初是在小鼠的癌前病变背景下描述的，但很快被扩展应用于大鼠，并与致癌物处理结合使用，以建立作为癌症易感性指标的肿瘤多发性15。然而，移植技术的普及程度随着各物种遗传工具的发展而变化。虽然结合移植技术的小鼠研究已产生许多具有转化价值的发现，但大鼠乳腺实质在结构上更接近人类16,17，在研究雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌方面具有明显优势。在这两个物种中均可诱导乳腺肿瘤，但它们在激素敏感性和基因表达谱方面存在差异。一个主要区别在于，大鼠乳腺肿瘤表达并依赖卵巢和垂体激素受体的功能，即雌激素受体和孕激素受体（PR），这与人类乳腺癌的管腔A型（luminal-A subtype）相似。事实上，如本方案所述，乳腺上皮细胞移植已被用于研究与乳腺癌相关的遗传变异，并确定对乳腺上皮细胞作用的细胞自主性18。
除了肿瘤生物学特性外，正常大鼠乳腺导管上皮的分支程度更高，并且其周围被比小鼠更厚的间质层所包绕。在乳腺上皮移植研究中，间质的重要性已有充分记载。乳腺上皮必须与脂肪性间质相互作用，理想情况下还需与其自身的间充质相互作用，才能完成其特征性的形态发生过程19,20。将组织移植物植入受体乳腺可提供一个理想的微环境；然而，内源性上皮的存在可能干扰实验结果。清除受体乳腺中的内源性上皮是小鼠移植实验中常见的操作，通常需要通过手术切除内源性乳腺组织和/或乳头1,21,22。尽管在断奶后大鼠中进行乳腺上皮预清除在技术上可行，但该操作并不普遍，主要原因是难以彻底清除断奶后大鼠中持续生长的乳腺导管树。由于已有研究表明，体内其他部位的脂肪组织也能够支持移植乳腺上皮的生长21,23,24，因此在大鼠中可通过将组织移植至肩胛间白色脂肪垫来简便地避免预清除步骤。
本文所述的移植方法包括将酶解分离的乳腺类器官（乳腺导管上皮片段及其他具有形态发生能力的细胞类型）或单细胞悬液注射到近交系、同源系或 congenic 系实验室大鼠的肩胛间脂肪垫中2。由于肩胛间脂肪垫通常不含乳腺组织，因此可为多个移植位点提供适宜环境，无需预先清除内源性上皮组织。因此，宿主动物自身的腹股沟乳腺组织不受手术操作影响，能够正常发育，也不会干扰实验结果的解读。此外，完整的乳腺组织还可作为对照，用于比较宿主与供体对乳腺上皮发育及肿瘤发生的影响18,25。尽管已有利用单个干细胞重建小鼠乳腺组织的方法，但该技术尚未在大鼠中建立，主要原因是缺乏可用于筛选大鼠乳腺干细胞的抗体25,26,27。尽管如此，通过移植单细胞悬液以定量评估其重建能力仍可成功实施，且这些细胞在移植至合适微环境后能够正常发育2,3,4。虽然类器官适用于多种研究目的，但在需要定量分析的应用中必须使用单细胞悬液，例如确定经电离辐射处理后引发癌症所需的乳腺上皮细胞数量28，或比较经流式细胞术分选的不同乳腺上皮细胞群体的特性29。
迄今为止，本文所述方法是进行大鼠乳腺移植最为可靠的技术，其总体目标是研究乳腺发育以及乳腺癌发生背后的机制。通常，在上皮细胞移植前、移植过程中或移植后，供体和/或受体动物会暴露于不同的变量条件下。例如，涉及化学致癌作用的单基因研究30、辐射处理28,31,32、宿主或供体基因组的遗传操作18，以及激素调控12。本方案中所描述的酶解离方法的一个主要优势在于，能够分离出上皮类器官或单细胞悬液，从而可用于流式细胞术、三维培养、基因编辑等互补性实验。该技术未来的应用将包括对供体和/或宿主组织进一步实施基因工程操作。例如，可利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，在体外对供体细胞在任意选定的基因组位点进行遗传修饰。同样，也可对受体大鼠进行遗传改造，以研究供体与受体之间工程化遗传因子的相互作用。
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方案
所有动物均饲养并维持在经AAALAC认证的设施中，本方案中所述实验均已通过MUSC机构动物护理和使用委员会批准 & 使用委员会（IACUC）。用于相互移植实验的动物应为近交系或同基因型品系，优先选用同类系动物，或至少回交6代以上的品系。
1. 收集供体大鼠乳腺上皮组织
- 确定移植所需的供体大鼠数量。
注意：通常，1只供体大鼠（4周龄）可提供足够移植到4只受体动物的细胞。本方案的某些应用可能需要更多的细胞，且不同品系的总产量可能存在差异。 - 标记所有器械并确保外科医生可方便取用（表1）。
- 记录每只雌性供体大鼠的体重。根据机构指南对供体大鼠进行完全麻醉或安乐死。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
- 将动物转移至无菌手术区域。使其仰卧位，并用70%乙醇喷洒整个腹侧表面。
- 做矢状位X形切口，以暴露胸部、腹部和腹股沟乳腺组织。使用剪刀解剖取出供体大鼠的所有乳腺组织（图1）。去除所有可见的淋巴结。
- 用镊子取出乳腺组织，置于预先标记、盛有冰的60 mm培养皿中。向培养皿中加入500 µL无血清DMEM/F12培养基。调整乳腺组织的位置，确保其完全浸润在液体中。
- 用剪刀将乳腺组织精细剪碎。操作时将组织切成1–2 mm3大小的碎块（图1C）。在所有供体组织采集完成前，始终保持组织置于冰上（不超过60分钟）。
注意：在手术人员进行组织提取的同时，其他人员可同时进行乳腺组织剪碎及胶原酶溶液的配制。
2. 从安乐死的供体中提取脑组织
- 小心将供体动物的躯体翻转，使其呈俯卧位，并用针固定。用70%乙醇喷洒头部和上背部。
- 定位颅底，在枕骨髁下方做一切口。将锐利的剪刀插入皮肤下方，沿颅骨剥离皮肤，包括头部两侧。
- 使用骨剪或坚固的剪刀沿中线从枕骨向额骨方向剪开颅骨。操作时尽量保持刀刃浅层，并向上倾斜角度，以避免损伤下方的脑组织。
- 使用咬骨钳或坚固的镊子将骨片剥离。将工具置于小脑外侧，折断两侧颅骨，暴露骨性耳道。切断脑膜的连接。
- 用弯头精细镊子轻轻提起脑组织。将脑组织置于一片铝箔上，称重并记录，随后立即转移至含有等量（重量:体积）预冷培养基的15 mL离心管中，置于冰上保存。
- 如有需要，可使用精细镊子取出位于脑下方的垂体，用于后续移植操作。
- 使用机械匀浆器破碎组织。以低速匀浆脑组织10–15秒。将混合物置于冰上静置至少1分钟，然后再次匀浆。当最终混合物中无明显大块组织时，视为匀浆充分。
- 将匀浆液通过100 µm滤膜过滤。滤液保存在冰上，待用（使用时间不超过4小时）。
3. 乳腺组织提取物的消化与处理
- 根据指示解冻或预热试剂（表1）。按照相应步骤回收类器官或单细胞悬液。
- 为每只供体动物准备10 mL无血清消化液（不含胶原酶）（补充文件1）。
注意：可根据组织量调整消化液体积（按比例放大或缩小，如适用）。- 如处理类器官，跳至步骤3.3。
- 如处理单细胞悬液，除无血清胶原酶消化液外，还需新鲜配制单细胞解离混合液和灭活液（补充文件2、补充文件3）。随后进行步骤3.3。
- 当所有供体动物的乳腺组织提取并切碎后，将胶原酶加入已预热（或室温）的消化液中（补充文件1）。通过轻柔颠倒混匀。
- 将含胶原酶的消化液经20 µm滤膜过滤。将过滤后的消化液每管10 mL分装至已标记的50 mL离心管中用于消化。
- 每个样本使用新的1,000 µL移液枪头，将每块60 mm培养皿中的切碎组织转移至含胶原酶的消化管中。使用前，将1,000 µL枪头末端剪去约1 cm，并手动安装至移液器上。通过上下吹打1–2次，轻柔混匀切碎的组织。
注意：若组织在转移过程中难以移取，可先用少量50 mL管中的胶原酶消化液润洗，再将组织转移回去。 - 将样本水平放置于摇床培养箱中，在37 °C、200–220 rpm条件下消化1.5–2小时。
- 如处理类器官，跳至步骤3.7。
- 如处理单细胞悬液，在消化最后10分钟加入DNase I（0.2 µg/mL），继续按前述条件孵育，并剧烈震荡。随后进行步骤3.7。
- 当组织完全消化后，于4 °C条件下以1,200 x g离心10分钟，收集细胞悬液沉淀（图1D）。
注意：每一步操作之间均需将离心管置于冰上，以提高细胞存活率。 - 确认沉淀形成后，小心倾去上清液及脂肪层。用10 mL新鲜DMEM/F12培养基轻柔重悬沉淀。
- 短暂离心（约10秒），速度为68 x g。若细胞未明显分离，可适当延长离心时间（但不可提高转速）。在继续操作前目视检查沉淀情况（图1D）。
- 小心移除上清液，保留少量液体。根据所需产物为类器官或单细胞悬液，进行后续操作。
注意：保留少量培养基非常重要，因为沉淀非常松散。残留液体将在洗涤步骤中被稀释。- 如处理类器官，加入另外10 mL DMEM/F12培养基，重复洗涤/离心步骤。第二次洗涤后，用较小体积（1–2 mL）DMEM/F12培养基重悬细胞，用于过滤。随后进行步骤3.11。
- 如处理单细胞悬液，用2 mL预热的含0.025%（w/v）胰蛋白酶和6.8 mM EDTA的HBSS溶解沉淀，在37 °C消化3–5分钟，立即灭活。
- 加入4 mL含10% FBS的DMEM/F12培养基以终止胰蛋白酶活性。
- 以270 x g离心5分钟，再次用含10% FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞。随后进行步骤3.11，对细胞进行过滤。
- 使用置于新50 mL离心管上的40 µm细胞筛网过滤细胞。先用移液枪吸取1 mL用于重悬细胞的相同基础培养基润湿筛网，再将细胞悬液通过移液吹打方式过滤，以收集导管片段/类器官。
注意：单只4周龄供体大鼠乳腺组织经过滤后所得上皮细胞的产量约为1 × 106个细胞。- 如处理类器官，弃去滤液。乳腺类器官将保留在细胞筛网篮内，较小的非目标细胞则被去除。将细胞筛网倒置于新的50 mL离心管上，用适量液体冲洗以回收细胞。随后进行步骤3.12。
- 如处理单细胞悬液，弃去细胞筛网，保留滤液，因为乳腺上皮细胞将与较小的基质细胞和免疫细胞一同通过滤膜。用另一份含10% FBS的DMEM/F12培养基冲洗原用于消化/离心的离心管，并将冲洗液通过同一细胞筛网过滤。以1,200 x g离心5分钟，收集单细胞悬液沉淀。随后进行步骤3.12。
注意：重悬后的细胞即可用于后续实验。
- 短暂离心，确保细胞沉淀形成后再进行下一步操作。如有必要，可再次短暂离心。
- 小心移除上清液。用小体积（1,000–2,000 µL）DMEM/F12培养基重悬沉淀，以浓缩细胞用于计数。
- 计数细胞，必要时进行稀释。根据每只动物所需数量，用20 µL DMEM/F12培养基重悬细胞用于移植。细胞始终置于冰上。
注意：根据实验终点不同，每个移植位点所需的供体细胞数量通常在1 × 105 – 1 × 106个之间。例如，致癌实验通常比其他应用需要更多的移植细胞。每种品系所需细胞数量需通过实验预先确定。本方案中，每个移植位点在与脑匀浆混合前，使用250,000个供体细胞溶于20 µL培养基中，如步骤3.16所述。 - 准备其他实验所需细胞分装样本（例如FACS分选3,26,27,30,33）。
- 如处理类器官，进行步骤3.16。
- 如处理单细胞悬液，使用台盼蓝或亚甲蓝染色法测定活细胞数量，然后继续操作。
- 为所有移植受体准备单一批次的供体材料。每个移植位点将等体积（20 µL）细胞悬液与50%脑匀浆液（20 µL）混合。
注意：每个位点将注射总共40 µL，但建议额外准备至少25%的体积以应对损耗。 - 立即进行移植，或将细胞冻存以备后续移植（潜在暂停点）。
注意：本方案未测试冻存细胞的效果，若需使用冻存细胞，应在开展动物移植实验前进行优化。强烈建议使用新鲜细胞进行移植。
4. 移植手术（受体大鼠 4-5 周龄）
- 称重每只受体大鼠，并计算手术过程中将使用的经批准镇痛剂的正确剂量。
注意：可在手术前最多24小时测量体重。根据机构指南，在剃毛期间对每只动物进行固定或短暂麻醉。 - 使用电动剪刀剃除每只动物的手术区域毛发。确定颅底和脊柱起始位置。沿脊柱向下约三分之一处，在背部上胸段剃出一个3 cm × 2 cm的区域。
注意：剃毛也可在移植当天于麻醉下进行，但必须在无菌区域外完成。操作后将大鼠放回其饲养笼，直至需要使用。 - 准备移植所需的所有物品（表1）。
- 使用前评估实验室动物麻醉系统。补充所有液体，更换所需储液罐或部件。确保通往麻醉室的气体管道处于开启状态，所有外周管道关闭，以便异氟烷麻醉剂和氧气在动物放入麻醉室后可自由流入。
- 预热加热垫，以维持受体动物的体温。
- 建立用于手术的无菌区域。按照表1所述布置所需物品。
- 根据机构批准的动物护理方案，向受体大鼠给予术前镇痛剂。
- 用无菌DMEM/F12培养基冲洗Hamilton注射器，以防止细胞损失。确保针头牢固连接在注射器上，将针头插入液体中，回拉活塞，吸至最大体积。推动活塞排出内容物至废液收集管中。重复3–5次。
- 将供体材料的全部体积（在步骤3.16中制备）分别装入不同条件（如对照组、处理组、野生型、基因敲除型等）对应的独立注射器中。将针头尖端插入液体，回拉活塞，并在管内液体减少过程中始终保持针头位于混合液面以下。
注意：每个注射器中应额外多装至少10%的体积。剩余混合液不要丢弃，应密封后置于冰上保存，以备后续需要。 - 注射器完全装液后将其倒置，轻推活塞以排除针尖处的气泡。待所有准备工作完成后，进入下一步。
注意：确保针尖切勿接触任何表面，即使在无菌区域内也不可触碰。将注射器本体放置在小冰容器上有助于维持细胞活性。 - 将受体动物放入麻醉室，并启动设备。
- 当动物完全放松（轻敲或轻微移动麻醉室无反应）时，将麻醉气体导向鼻罩，并将动物转移至无菌区域。
注意：大鼠对长时间麻醉耐受性较差。每只动物的操作应在10分钟或更短时间内完成。 - 将动物置于俯卧位（腹部朝下），以便接触头部后方和上段脊柱。
注意：始终确保动物有足够的保温支持，并通过用力捏脚趾定期评估麻醉深度。 - 可选：涂抹眼科兽用软膏，防止眼睛干燥。
- 清洁刚剃过的区域以去除多余毛发。采用环形擦拭方式，先用70%乙醇（或根据机构指南使用的其他试剂）擦拭皮肤，再使用消毒剂（如碘液），重复一次。用毛巾覆盖动物身体，仅暴露剃毛区域。
- 通过用力捏脚趾确认动物对深部刺激无反应后，继续下一步操作。
- 使用锋利的手术刀在肩胛间区域做一个小切口（2 cm）。
注意：切口应较浅，因为脂肪垫位于皮肤下方很近处。 - 根据中线血管定位（图2B）。
- 用镊子提起切口一侧的皮肤，并在移植过程中将其固定远离脂肪垫（图2B）。将针头插入移植物部位。
- 可选：在组织内移动针尖，通过小幅重复动作创建一个小腔隙以容纳细胞，但不要拔出针头。
注意：初次使用者建议执行此步骤。创建腔隙时需格外小心，因肩胛间脂肪垫组织非常脆弱。
- 可选：在组织内移动针尖，通过小幅重复动作创建一个小腔隙以容纳细胞，但不要拔出针头。
- 小心地将40 µL细胞混合物注射至肩胛间脂肪垫组织中。缓慢拔出针头。
- 固定组织位置，让移植的细胞静置3–5秒。必要时可使用另一把镊子辅助。
- 取出针头。在第二个移植部位重复注射操作（步骤4.18–4.21）。
注意：同一供体组的上皮组织可在每只动物的同一侧脂肪垫进行注射，也可交替左右侧，以避免因手术者手部优势导致的批次效应。 - 使用伤口夹或缝线关闭手术切口，随后停止麻醉。
- 根据机构批准的方案给予术后镇痛剂。
- 立即将动物转移至配备加热支持的恢复笼中。监测是否有出血或呼吸困难等应激迹象。
注意：动物通常在5–10分钟内完全恢复。有关术后动物返回饲养群体及存活手术后的监测要求，请参照机构指南。 - 可选：移植后3–4周，通过向受体大鼠施用致癌物，在移植物部位开展致癌研究。
注意：通常在大鼠50–57日龄时使用化学致癌物诱导乳腺癌发生。该时间安排决定了移植手术的年龄（必须在29–36日龄之间进行），以确保移植物细胞有足够时间启动乳腺组织的生长。
5. 上皮细胞迁移生长的评估
- 通过每日阴道灌洗监测大鼠的动情周期，并在显微镜载玻片上检查细胞学特征。在研究终点前8-12天开始此步骤。所有大鼠应在相同的动情周期阶段处死。此步骤为可选操作。
注意：大鼠动情周期为4-5天。让动物经历1-2个完整的动情周期将有助于结果解读，因为可利用先前周期的灌洗涂片进行对比。 - 根据机构指南，在移植后6-8周处死移植受体大鼠。
注意：移植后通常3-6周可检测到上皮生长，但可能需要更长时间。 - 将动物置于俯卧位，用70%乙醇清洁体表。用镊子提起皮肤，沿脊柱方向做切口以暴露肩胛间脂肪垫。将皮肤从组织上剥离，使大部分脂肪垫暴露可见。
- 识别肩胛间脂肪垫中分隔移植物位点的中线血管。可将整个脂肪垫作为一块组织完整切除，或沿血管切开并分别移除两侧组织。
- 将组织置于带正电荷的显微镜载玻片上进行整体封片。使用两对钝头镊子，轻柔地展开组织，使其在载玻片上恢复原始形态。
注意：大鼠乳腺组织极为脆弱。组织边缘可能向内卷曲。操作时务必小心，并固定组织位置，直至其粘附于载玻片（数秒钟）。 - 至少对一个内源性腹股沟乳腺腺体（连同淋巴结以作定位参考）进行整体封片，用于对比分析。
- 将载玻片置于70%乙醇中7-10天以脱脂组织。根据需要频繁更换乙醇，确保组织不干燥。
- 配制明矾-洋红染液，并在组织充分不透明后处理载玻片（使用前使染液冷却）（补充文件4）。
注意：染液可在固定和复水步骤前一天配制。溶液可储存于4 °C，重复使用潜力有限。 - 将载玻片置于25%冰醋酸 : 75%乙醇中固定60分钟。
- 通过一系列递减浓度的乙醇进行复水：70%乙醇洗涤15分钟，50%乙醇洗涤5分钟，dH2O洗涤5分钟，共3次。
- 用明矾洋红染色4-8天。每天检查载玻片背面，判断染色是否完全渗透组织。染色完成后进入下一步。
注意：当腺体最厚部分呈现紫色且不再显白色时，表明染色已完成。 - 通过一系列递增浓度的乙醇进行脱色和脱水：70%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇30分钟。
- 将脱水后的载玻片置于二甲苯中3天以上以透明组织。随后转移至矿物油中长期保存。
- 载玻片透明后，使用低倍光学显微镜或高分辨率数码摄影获取图像用于分析。确保所有载玻片的图像采集参数保持一致。
注意：上皮生长必须清晰可辨。 - 将是否存在上皮生长视为二分类结果（有/无）。
- 利用所获图像，计算在50%移植物位点产生≥1个乳腺上皮生长的移植上皮细胞平均数量。根据需要量化其他物理特征。
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结果
供体与受体乳腺组织
分离并制备用于移植的大鼠乳腺上皮细胞的步骤如图1A所示。在4周龄时，供体大鼠内源性乳腺组织已开始成熟，通过明矾卡红染色的整体装片可观察到上皮结构（图1B）。此年龄段的一只供体大鼠可提供约1 × 106个可用于移植的细胞。若采集的供体组织量不足或后续剪碎不充分，则胶原酶消化后所得细胞数量可能偏低。因此，应尽可能从供体中采集更多的乳腺组织。完全消化后的乳腺组织应呈现油状外观，悬液中无可见组织碎片（图1C）。单个供体乳腺组织完全消化后，应形成可见的沉淀物，其中含有乳腺类器官，如（图1D<...
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讨论
本方案描述了一种针对大鼠优化的乳腺上皮细胞移植技术。将供体大鼠（3-5周龄）分离得到的乳腺上皮类器官移植至受体大鼠（同样为3-5周龄）的肩胛间白色脂肪垫中。移植后仅需4-6周即可通过光学显微镜观察移植物组织来解读结果；然而，在开展完整实验之前，必须确定移植与处死之间最佳的时间间隔。若时间过短或过长，结果将无法解读或失去意义。为优化该方案，可在移植后6-8周对少量动物的外生长情况进行分析。若移植的上皮组织存在但发育不足，应延长观察时间；若移植物发育良好，但上皮结构特征相互重叠而干扰分析，则可考虑缩短上皮外生长的周数。若实验不允许缩短时间（例如在致癌实验中），建议将相同类型的供体上皮组织分别注入两个移植位点（位于中线血管两侧各一个），因为无法百分之百确定单侧结果的独立性。若怀疑存在任何类型的相互作用（自分泌、旁分泌），强烈建议增设对照组动物，将相同类型的供体上皮组织同时注入两个移植位点。操作中的关键步骤包括：酶消化后对供体细胞进行准确的定量，以及与脑匀浆物充分混匀。在这些步骤中需格外小心，以确保各受体动物间移植细胞数量的一致性。此外，在注射过程中，应确保移植物混合物不会从肩胛间脂肪垫泄漏。3. 在实验终点切除肩胛间脂肪垫。整个脂肪垫可作为单...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助，资金来源为霍林斯癌症中心癌症中心支持基金P30 CA138313的试点研究资助https://www.nih.gov/，以及病理科提供的资金 & 南卡罗来纳医科大学实验室医学系。我们感谢Marijne Smiths对访谈内容的录音记录。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µM 注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-715G | 用于无菌过滤胶原酶消化液 |
| 1.5 - 2.0 mL 微量离心管（无菌） | Fisher Scientific | 05-408-129 | 盛装重悬细胞和/或脑组织匀浆混合物 |
| 100 µM 细胞筛 | Corning | 431752 | 过滤脑组织匀浆 |
| 100 µL 气密性注射器配25号针头 | Hamilton | 81001 & 90525 | 用于将移植混合物注入受体动物（每种供体基因型/条件使用1支） |
| 1000 µL 移液器吸头及移液器 | - | - | 转移细胞/混合物/组织 |
| 15 mL 聚丙烯管 | Falcon (Corning) | 352196 | 用于脑组织匀浆混合物储存，或细胞与匀浆混合物的移植前保存 |
| 40 µM 细胞筛 | Corning | 431750 | 洗涤细胞沉淀后过滤类器官 |
| 50 mL 聚丙烯管 | Fisher Scientific | 05-539-6 | 用于供体乳腺组织的胶原酶消化 |
| 60 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 130181 | 用于组织剪碎 |
| 硫酸铝钾 | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | 用于乳腺全组织铺片染色 |
| 兽用麻醉蒸发器 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 碘伏或碘液 | - | - | |
| 用于匀浆的硼硅酸盐玻璃培养管 | Fisher Scientific | 14-961-26 | 用于脑组织匀浆（根据匀浆仪选择合适规格的管） |
| 胭脂红 | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | 用于乳腺全组织铺片染色 |
| 细胞计数装置 | - | - | |
| 清洁的动物恢复笼 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 胶原酶III型 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | 用于供体大鼠乳腺组织的酶解消化 |
| 去离子水 | - | - | 配制化学溶液 |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | 用于组织剪碎、胶原酶消化液配制及上皮细胞混合物重悬 |
| EDTA | - | - | 单细胞分散混合液 |
| 无水乙醇（200 Proof） | Decon Labs | 2705/2701 | 用于乳腺全组织铺片固定、洗涤，以及手术切口部位清洁（稀释后使用） |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | - | 灭活溶液 |
| 纱布 | - | - | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38-212 | 用于乳腺全组织铺片固定液（1:4 冰醋酸与100%乙醇混合） |
| HBSS | GIBCO | - | 单细胞分散混合液 |
| 加热垫 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 冰桶（x2） | - | - | |
| 带轨道旋转功能的培养箱 | - | - | 必须能够维持37°C，并以220-225 RPM振荡（用于乳腺组织的胶原酶消化） |
| 异氟烷麻醉 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 光学显微镜或数码相机 | - | - | 观察乳腺上皮全组织铺片和/或采集图像 |
| 机械匀浆仪 | Fisher Scientific | - | TissueMiser 或其他型号 |
| 纯净矿物油 | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | 用于透明化后乳腺全组织铺片的长期保存 |
| 麻醉蒸发器用氧气瓶 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 纸巾或精细擦拭布 | - | - | |
| 带正电荷的显微镜载玻片 | Thermo Scientific | P4981-001 | 用于乳腺组织全铺片 |
| 术后镇痛药 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 电子天平 | 用于动物体重测量及止痛药物的准确给药 | ||
| 剃毛器 | - | - | 电动剪毛器或其他工具 |
| 染色缸 | - | - | 每种化学洗涤至少1个，容量应适合载玻片数量，推荐使用玻璃材质 |
| 无菌手术巾 | IMCO | 4410-IMC | 移植手术过程中使用 |
| 无菌剪刀和镊子 x3（已高压灭菌） | - | - | 对供体和受体使用的手术器械进行高压灭菌 |
| 注射器：5 mL（或更大） | - | - | 用于胶原酶消化液的无菌过滤 |
| 胰蛋白酶 | Worthington | 单细胞分散混合液 | |
| 液体废弃物收集容器（倾倒或抽吸） | - | - | |
| 伤口缝合夹施加器、缝合夹及拆除工具 | Fine Science Tools | 12020-00 | 闭合肩胛间白色脂肪垫区域的皮肤切口 |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | X3S-4 | 染色后用于乳腺全组织铺片的透明处理 |
参考文献
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