本文介绍了一种移植方法，可将供体大鼠乳腺上皮细胞移植至受体动物的肩胛间白色脂肪垫中。该方法可用于研究宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，且无需预先清除内源细胞，从而扩展了该技术的应用范围。
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摘要
摘要
早在20世纪70年代，研究人员已成功将乳腺上皮细胞移植到大鼠肩胛间白色脂肪垫中。利用移植技术嫁接乳腺上皮可借助青春期啮齿类宿主所提供的激素环境。这类研究非常适合探索各种生物学操作对乳腺发育的影响，并解析乳腺生物学的多个方面。一个常见但具有局限性的特点是，移植的上皮细胞会受到周围间质的强烈影响，并被内源性上皮细胞所排挤；若要利用天然乳腺组织，必须在移植前清除腹股沟白色脂肪垫中的宿主乳腺上皮。使用大鼠作为模式生物时的一个主要障碍是，在断奶后的大鼠中清除正在发育的乳腺树结构效率较低。当移植到无腺体的脂肪垫时，供体上皮细胞能够重新定植于被清除的宿主脂肪垫中，并形成具有功能的乳腺。肩胛间脂肪垫是此类移植物的另一种可选位置。其主要优势在于，该部位缺乏导管结构，却提供了促进上皮向外生长所必需的正常间质环境，且在大鼠体内易于操作。该技术的另一大优势是创伤极小，因为它避免了烧灼和切除正在生长的内源性乳腺树的需要。此外，肩胛间脂肪垫包含一条中线血管，可用于分隔不同的移植位点。由于内源性腺体保持完整，该技术还可用于比较内源性乳腺与移植乳腺的研究。本文描述了将乳腺上皮细胞移植至大鼠肩胛间白色脂肪垫的方法。
引言
出生后乳腺发育及导管形态发生过程在很大程度上受青春期开始时激素信号传导的影响。在小鼠和大鼠这两种常用的乳腺生物学模型生物中，该过程始于约3周龄，此时快速的细胞增殖与分化导致成熟实质组织的形成。成熟的乳腺能够经历多轮扩张与退化，这一特性自20世纪初以来一直受到研究关注th 世纪。在细胞过度增殖和癌症发生的研究背景下，乳腺移植技术于20世纪50年代发展起来1，并由Gould等人于1977年提出的定量方法进一步完善2,3,4啮齿类动物移植技术的不断完善，极大地推动了对正常乳腺生物学的理解，该技术至今仍被广泛用于研究各种处理方法和遗传操作对正常乳腺发育及疾病状态的影响。
许多假说通过乳腺移植技术得到提出并随后验证，该技术最早由DeOme等人于1959年首次描述1。数十年来的实验表明，从供体乳腺中切除的导管组织具有完全重建整个脂肪垫的能力5,6,7，并提示乳腺发育的关键组分存在于这些上皮结构中。后续在....
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方案
所有动物均饲养并维持在经AAALAC认证的设施中，本方案中所述实验均已通过MUSC机构动物护理和使用委员会批准 & 使用委员会（IACUC）。用于相互移植实验的动物应为近交系或同基因型品系，优先选用同类系动物，或至少回交6代以上的品系。
1. 收集供体大鼠乳腺上皮组织
- 确定移植所需的供体大鼠数量。
注意：通常，1只供体大鼠（4周龄）可提供足够移植到4只受体动物的细胞。本方案的某些应用可能需要更多的细胞，且不同品系的总产量可能存在差异。 - 标记所有器械并确保外科医生可方便取用（表1）。
- 记录每只雌性供体大鼠的体重。根据机构指南对供体大鼠进行完全麻醉或安乐死。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
- 将动物转移至无菌手术区域。使其仰卧位，并用70%乙醇喷洒整个腹侧表面。
- 做矢状位X形切口，以暴露胸部、腹部和腹股沟乳腺组织。使用剪刀解剖取出供体大鼠的所有乳腺组织（图1）。去除所有可见的淋巴结。
- 用镊子取出乳腺组织，置于预先标记、盛有冰的60 mm培养皿中。向培养皿中加入500 µL无血清DMEM/F12培养基。调整乳腺组织的位置，确保其完全浸润在液体中。
- 用剪刀将乳腺组织精细剪碎。操作时将组织切成1–2 mm3大....
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结果
供体与受体乳腺组织
分离并制备用于移植的大鼠乳腺上皮细胞的步骤如图1A所示。在4周龄时，供体大鼠内源性乳腺组织已开始成熟，通过明矾卡红染色的整体装片可观察到上皮结构（图1B）。此年龄段的一只供体大鼠可提供约1 × 106个可用于移植的细胞。若采集的供体组织量不足或后续剪碎不充分，则胶原酶消化后所得细胞数量可能偏低。因此，应尽可能从供体中采集更多的乳腺组织。完全消化后的乳腺组织应呈现油状外观，悬液中无可见组织碎片（图1C）。单个供体乳腺组织完全消化后，应形成可见的沉淀物，其中含有乳腺类器官，如（图1D<.......
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讨论
本方案描述了一种针对大鼠优化的乳腺上皮细胞移植技术。将供体大鼠（3-5周龄）分离得到的乳腺上皮类器官移植至受体大鼠（同样为3-5周龄）的肩胛间白色脂肪垫中。移植后仅需4-6周即可通过光学显微镜观察移植物组织来解读结果；然而，在开展完整实验之前，必须确定移植与处死之间最佳的时间间隔。若时间过短或过长，结果将无法解读或失去意义。为优化该方案，可在移植后6-8周对少量动物的外生长情况进行分析。若移植的上皮组织存在但发育不足，应延长观察时间；若移植物发育良好，但上皮结构特征相互重叠而干扰分析，则可考虑缩短上皮外生长的周数。若实验不允许缩短时间（例如在致癌实验中），建议将相同类型的供体上皮组织分别注入两个移植位点（位于中线血管两侧各一个），因为无法百分之百确定单侧结果的独立性。若怀疑存在任何类型的相互作用（自分泌、旁分泌），强烈建议增设对照组动物，将相同类型的供体上皮组织同时注入两个移植位点。操作中的关键步骤包括：酶消化后对供体细胞进行准确的定量，以及与脑匀浆物充分混匀。在这些步骤中需格外小心，以确保各受体动物间移植细胞数量的一致性。此外，在注射过程中，应确保移植物混合物不会从肩胛间脂肪垫泄漏。3. 在实验终点切除肩胛间脂肪垫。整个脂肪垫可作为单.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助，资金来源为霍林斯癌症中心癌症中心支持基金P30 CA138313的试点研究资助https://www.nih.gov/，以及病理科提供的资金 & 南卡罗来纳医科大学实验室医学系。我们感谢Marijne Smiths对访谈内容的录音记录。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 µM 注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-715G | 用于无菌过滤胶原酶消化液 |
| 1.5 - 2.0 mL 微量离心管（无菌） | Fisher Scientific | 05-408-129 | 盛装重悬细胞和/或脑组织匀浆混合物 |
| 100 µM 细胞筛 | Corning | 431752 | 过滤脑组织匀浆 |
| 100 µL 气密性注射器配25号针头 | Hamilton | 81001 & 90525 | 用于将移植混合物注入受体动物（每种供体基因型/条件使用1支） |
| 1000 µL 移液器吸头及移液器 | - | - | 转移细胞/混合物/组织 |
| 15 mL 聚丙烯管 | Falcon (Corning) | 352196 | 用于脑组织匀浆混合物储存，或细胞与匀浆混合物的移植前保存 |
| 40 µM 细胞筛 | Corning | 431750 | 洗涤细胞沉淀后过滤类器官 |
| 50 mL 聚丙烯管 | Fisher Scientific | 05-539-6 | 用于供体乳腺组织的胶原酶消化 |
| 60 mm 培养皿 | Thermo Scientific | 130181 | 用于组织剪碎 |
| 硫酸铝钾 | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | 用于乳腺全组织铺片染色 |
| 兽用麻醉蒸发器 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 碘伏或碘液 | - | - | |
| 用于匀浆的硼硅酸盐玻璃培养管 | Fisher Scientific | 14-961-26 | 用于脑组织匀浆（根据匀浆仪选择合适规格的管） |
| 胭脂红 | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | 用于乳腺全组织铺片染色 |
| 细胞计数装置 | - | - | |
| 清洁的动物恢复笼 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 胶原酶III型 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | 用于供体大鼠乳腺组织的酶解消化 |
| 去离子水 | - | - | 配制化学溶液 |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | 用于组织剪碎、胶原酶消化液配制及上皮细胞混合物重悬 |
| EDTA | - | - | 单细胞分散混合液 |
| 无水乙醇（200 Proof） | Decon Labs | 2705/2701 | 用于乳腺全组织铺片固定、洗涤，以及手术切口部位清洁（稀释后使用） |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | - | 灭活溶液 |
| 纱布 | - | - | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38-212 | 用于乳腺全组织铺片固定液（1:4 冰醋酸与100%乙醇混合） |
| HBSS | GIBCO | - | 单细胞分散混合液 |
| 加热垫 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 冰桶（x2） | - | - | |
| 带轨道旋转功能的培养箱 | - | - | 必须能够维持37°C，并以220-225 RPM振荡（用于乳腺组织的胶原酶消化） |
| 异氟烷麻醉 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 光学显微镜或数码相机 | - | - | 观察乳腺上皮全组织铺片和/或采集图像 |
| 机械匀浆仪 | Fisher Scientific | - | TissueMiser 或其他型号 |
| 纯净矿物油 | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | 用于透明化后乳腺全组织铺片的长期保存 |
| 麻醉蒸发器用氧气瓶 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 纸巾或精细擦拭布 | - | - | |
| 带正电荷的显微镜载玻片 | Thermo Scientific | P4981-001 | 用于乳腺组织全铺片 |
| 术后镇痛药 | - | - | 遵循机构操作规程 |
| 电子天平 | 用于动物体重测量及止痛药物的准确给药 | ||
| 剃毛器 | - | - | 电动剪毛器或其他工具 |
| 染色缸 | - | - | 每种化学洗涤至少1个，容量应适合载玻片数量，推荐使用玻璃材质 |
| 无菌手术巾 | IMCO | 4410-IMC | 移植手术过程中使用 |
| 无菌剪刀和镊子 x3（已高压灭菌） | - | - | 对供体和受体使用的手术器械进行高压灭菌 |
| 注射器：5 mL（或更大） | - | - | 用于胶原酶消化液的无菌过滤 |
| 胰蛋白酶 | Worthington | 单细胞分散混合液 | |
| 液体废弃物收集容器（倾倒或抽吸） | - | - | |
| 伤口缝合夹施加器、缝合夹及拆除工具 | Fine Science Tools | 12020-00 | 闭合肩胛间白色脂肪垫区域的皮肤切口 |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | X3S-4 | 染色后用于乳腺全组织铺片的透明处理 |
参考文献
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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重印与许可
