牵引显微镜与微流体集成，用于化学集体迁移

摘要

发育、伤口愈合和癌症转移中的集体细胞迁移通常受生长因子或信号分子梯度的引导。本文介绍了一个实验系统，将牵引显微镜与微流体系统相结合，并演示了如何在生物化学梯度下量化集体迁移的力学。

摘要

细胞改变迁移模式以响应化学刺激，包括刺激的梯度。细胞向化学梯度方向迁移，称为化学梯度，在发育、免疫反应、伤口愈合和癌症转移中起着重要作用。虽然化学疗法调节单个细胞的迁移以及体内细胞的集合，体外研究侧重于单细胞化疗，部分原因是缺乏适当的实验工具。为了填补这一空白，这里描述的是一个独特的实验系统，它结合了微流体和微模式，以展示化学梯度对集体细胞迁移的影响。此外，牵引显微镜和单层应力显微镜被纳入系统，以表征基基上以及相邻细胞之间的细胞力变化。作为概念证明，在肝细胞生长因子（HGF）的梯度下测试马丁-达比（MDCK）细胞微模式圆形岛屿的迁移。这是一种已知的散射因子。研究发现，位于HGF浓度较高的细胞比细胞岛内另一侧的细胞迁移得更快。在同一岛内，两侧的细胞牵引力相似，但高HGF浓度的一侧细胞间应力要低得多。这一新型实验系统为研究细胞群化学迁移机制提供了新的机会。

引言

细胞迁移在生物系统中是一个基本现象，涉及组织形成，免疫反应，伤口愈合1，2，3。细胞迁移也是癌症^等某些疾病的重要过程。细胞通常作为一个组而不是单个迁移，这称为集体细胞迁移 4^，5。对于细胞集体移动，对微环境的感知^{至关重要6。}例如，细胞感知物理化学刺激，并通过改变运动性、细胞-基质相互作用和细胞-细胞相互作用来做出反应，从而沿着化学^梯度7、8发生定向^{迁移。 9，10}.基于这种联系，在片上实验室技术方面取得了迅速的进步，这些技术可以创造出控制良好的化学微环境，如化学吸引^{剂11、12、13}的梯度。.虽然这些基于芯片的实验室微流体学以前曾用于研究细胞团或细胞球体的化学细胞14、15、16、17，但它们主要用于单细胞迁移18，19，20，21。细胞集体对化学梯度反应的机制仍然不太了解14，22，23，24，25，26.因此，开发一个能够对可溶性因子进行时空控制以及对细胞生物物理进行原地观察的平台将有助于解开集体细胞迁移背后的机制。

这里开发和描述的是一个多通道微流体系统，能够产生可溶性因子的浓度梯度，调节模式细胞簇的迁移。在这项研究中，选择肝细胞生长因子（HGF）来调节马丁-达比管肾（MDCK）细胞的迁移行为。HGF已知能衰减细胞完整性，增强细胞^{的活力27，28。}在微流体系统中，傅立叶转换牵引显微镜和单层应力显微镜也进行了整合，从而可以分析组成细胞在响应HGF时引起的运动力、收缩力和细胞间张力梯度。在同一岛内，位于HGF浓度较高的细胞迁移速度更快，细胞间应激水平低于HGF浓度较低的细胞侧。结果表明，这一新的实验系统适用于在各种可溶性因子化学梯度下，在涉及集体细胞迁移的研究领域的其他问题。

方案

注:SU-8模具的平版印刷模具（厚度 = 250 μm）和微通道零件（厚度 = 150 μm）、玻璃蚀刻（深度 = 100 μm）和铸件制造均通过使用计算机辅助设计软件向制造商发送设计进行外包。

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具和微通道的制造

1. 设计模具和微通道的微模式。
2. 在硅晶片（直径 4 英寸）上制造或外包 SU-8 模具（模具厚度为 ±250 μm，微通道为 ±150 μm）。
3. 将基弹性体和固化剂混合在10:1的比例，制备PDMS混合物。
   1. 将15 mL的基质弹性体放入 50 mL 锥形管中，并加入 1.5 mL 的固化剂。准备其中两个。
   2. 将 PDMS 混合物涡旋 5 分钟，将 PDMS 混合物在 196 x g下移 1 分钟以去除气泡。
4. 要制造 PDMS 模具，请将 ±1 mL 的 PDMS 混合物倒在晶圆上，同时避免 SU-8 图案区域，使 PDMS 接触 SU-8 柱的侧面，而不是 SU-8 型板的顶部。
   1. 在室温 （RT） 下，将晶圆放在平坦的表面上超过 30 分钟。在 80°C 的干燥烤箱中固化 PDMS 超过 2 小时。
   2. 小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，并使用 14 mm 空心冲孔修剪薄的 PDMS 膜。使用胶带清除 PDMS 片件表面的灰尘，并用吸尘器清除 PDMS 模具。
5. 要制造 PDMS 微通道，在 SU-8 模具上倒入 ±30 mL 的 PDMS 混合物。
   1. 在真空室中脱气30分钟，在80°C干燥烤箱中固化PDMS超过2小时。
   2. 小心地从 SU-8 模具中剥离 PDMS，并将 PDMS 切割到 24 mm x 24 mm 的尺寸。在每个 PDMS 块中，使用 1 mm 活检冲孔创建一个出口和三个入口。

2. 用聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶制备底玻璃

1. 通过切割和蚀刻眼镜制造或外包矩形滑动眼镜（24 毫米 x 24 毫米 x 1 毫米），带矩形微孔（6 毫米 x 12 毫米，100 μm 深度^29）。
2. 硅化底玻璃^{的表面30。}
   1. 通过将 200 mL 的脱离子水 （DIW）、80 μL 的醋酸和 50 μL 的 3-（三聚氧基）丙酸丙烯酸酯 （TMSPMA） 混合 1 小时，制备结合硅烷溶液。
      注意:TMSPMA是一种可燃液体。按照材料安全数据表中的建议进行操作。只能在化学烟气罩中使用。
   2. 用胶带和高压灭菌器清除玻璃表面的灰尘。
   3. 用100 μL的粘结硅烷溶液覆盖底部玻璃的蚀刻表面，并将玻璃留在RT处1小时。
   4. 用 DIW 3x 冲洗玻璃，让玻璃在环境空气温度下干燥或吹空气。
3. 为PA^凝胶31准备凝胶溶液。
   1. 通过在 DIW 的 1 mL 中溶解 5 mg APS，制备 0.5 % （w/v） 百万铵 （APS） 的新溶液。
   2. 制备由138 μL（40%丙烯酰胺溶液）、101μL2%双丙烯酰胺溶液、5μL荧光颗粒溶液（0.2 μm）和655μLDIW组成的PA凝胶溶液。
      注意:丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液是有毒的。戴上防护手套、衣服和护眼。保护含有荧光颗粒的PA凝胶溶液免受光线照射。
      注:在移液前，涡旋荧光珠溶液可获得每批统一数量的荧光珠。
   3. 加入100μL的APS溶液和1μL的四甲基二甲二胺（TEMED）后，将10μL的混合凝胶溶液转移到矩形微孔上，并放置在顶部的圆形盖玻片（18毫米）。
      注:要用无气泡的 PA 凝胶填充底部玻璃，请将足够的凝胶溶液放在底部玻璃的凹槽上，小心地将盖玻片滑过凝胶溶液，并去除任何多余的凝胶溶液。
      注意:凝胶缓慢固化约40分钟。应尽快执行以下离心凝胶程序。
   4. 翻转定制玻璃、凝胶溶液和盖玻片的组装，然后在 96 x g下离心 10 分钟，将荧光颗粒带到 PA 凝胶的顶层。
   5. 从离心机中取出组件，并将其放在平面上，盖玻片朝下。
      注:从步骤 2.3.6 开始，在生物安全柜中处理样品。
   6. 30 分钟后，翻转组件并将其放入 35 mm 培养皿中，填充 2 mL 的 DIW，（使用钳子）通过滑动到一侧轻轻取下盖玻片。
      注:固化的PA凝胶可储存在DIW中1个月。然而，一旦胶原蛋白涂在PA凝胶上，它应该在1天内用于实验。
4. 在PA凝胶上涂上胶原蛋白。
   1. 将1mg/mL磺酸酰胺6-（4'-azido-2'-硝基苯甲酸酯）六溴二苯甲酸酯（sulfo-SANPAH）溶解在温暖的50 mM HEPES缓冲液中。将溶液的 200 μL 滴到凝胶表面，由紫外线（365 nm 波长）激活 10 分钟。
      注:保护磺酸-SANPAH免受光线照射。
   2. 用0.1M×4-（2-羟基）-1-烟碱硫酸冲洗凝胶;HEPES+ 缓冲器 2 倍，带 PBS 1x。
   3. 在4°C过夜4°C时用胶原蛋白溶液（PBS中100微克/mL，大鼠尾部胶原蛋白I型）涂上PA凝胶。第二天，用PBS 3x清洗。

3. 细胞岛的微观图案

1. 在 PBS 中制备 F-127 （材料表） 溶液 [2% （w/v）]，并将高压灭菌的 PDMS 模具浸入 F-127 溶液中。将其保存在37°C的培养箱中1小时。
2. 在细胞培养基中制备细胞溶液（2 x 10⁶细胞/mL），包括:Dulbeco的改性Eagle的培养基（DMEM），具有10%的胎儿牛血清（FBS）和1%抗生素抗霉菌（AA）。
3. 用 PBS 3x 清洗 PDMS 模具，并从 PDMS 模具和 PA 凝胶中取出液体。将 PDMS 模具放在 PA 凝胶上，并将 PBS 添加到模具中。
4. 通过轻轻移液去除 PDMS 模具孔中的气泡。去除气泡后，从 PDMS 模具表面取出 PBS。
5. 在 PDMS 模具上加入 200 μL 的细胞溶液后，将 PA 凝胶保存在培养箱中 1 小时，以便细胞附着在 PA 凝胶上。
6. 用细胞培养基轻轻冲洗细胞溶液，取出PDMS模具，并添加更多细胞培养基。在显微镜下检查细胞岛的形成。

4. 使用PDMS微通道组装PA凝胶

1. 使用胶带清除 PDMS 微通道上的灰尘，然后清除高压灭菌器。
2. 使用氧等离子体（80 W、50 kHz）处理 PDMS 微通道表面 30 s。
3. 去除 PA 凝胶填充底部玻璃上的任何液体后，将 PDMS 微通道放在底部玻璃顶部，并将组件放在定制玻璃支架上。
4. 用细胞培养基填充微通道。
   注意:确保用移液器轻轻冲洗加热介质，清除通道中的所有气泡。此外，在移除气泡时，请确保不要分离微模式的细胞孤岛。

5. 集成微流体系统

1. 连接油管。
   1. 通过修剪针头（18 G）并弯曲 90°来准备接头。
   2. 为三个入口和一个出口准备管道管路。
      1. 对于进气管，连接修剪过的针头和 30 厘米的微型体积线，带三向止孔。准备其中三个。
      2. 对于出口管，连接修剪过的针头和 75 厘米的微型体积线，带三向止孔。准备其中一个。
      3. 用已预热 1 小时的介质填充管路。
         注意:确保用注射器轻轻冲洗加热介质，去除管道管管管管管管管管管管管管管管管管管管管管中的所有气泡。
   3. 通过从注射器中取出柱塞并连接进气管管管管管管管管管管管管管管管，准备储液罐。
   4. 将每个管线的针接头插入微流体装置的三个入口和一个出口。
2. 向储层中填充 3 mL 的新鲜介质或空调介质。
   1. 对于梯度测试，在细胞培养基中用20纳克/mL HGF填充左进气罐。
   2. 为了显示浓度梯度，在左进气罐中添加200μg/mL荧光染料（罗达明B-d-dextran，70 kDa）。
   3. 将出口管管管管管管连接到注射器泵。
      注:注射器泵的操作模式为"退出"。流量根据注射器的容量和注射器泵的运行速度而变化。
3. 将集成微流体系统放在常规表观显微镜的舞台上。
   注意:要在微流体通道中产生微流体通道中微微的HGF温和梯度，流速应慢至0.1 μL/min。这足够敏感，需要稳定2小时，必须小心避免实验期间的身体干扰。

6. 图像采集

1. 使用安装在孵化器中的自动显微镜，每 10 分钟拍摄一次图像，长达 24 小时。在每个时间点，在三个不同的通道中使用 4x 物镜拍摄一组图像，包括相位图像以可视化细胞迁移，绿色荧光图像可可视化嵌入 PA 凝胶中的荧光珠，以及用于可视化的红色荧光图像。化学品的浓度梯度。
2. 取时移图像后，将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液注入微通道，从PA凝胶分离细胞。完全去除凝胶中的细胞后，取一个绿色荧光图像，用作牵引显微镜的参考图像。

7. 数据分析

注:使用MATLAB开发了用于数据分析的自定义代码，详细信息已在其他地方描述32、33、34、35、36 。

1. 对于相位图像分析，使用粒子图像速度^测量36计算两个连续相图像的位移。
2. 对于傅立叶变换牵引显微镜，将每个绿色荧光图像与参考图像进行比较，并使用粒子图像速度^测量36计算每个图像的位移。从位移中，恢复由细胞在PA凝胶使用傅立叶转换牵引显微镜33，34，37的牵引。
3. 从牵引数据中，基于有限元方法32、34、38，使用单层应力显微镜计算细胞岛单层内的应力。

结果

为了探索化学梯度下的集体迁移，将微流体系统与牵引显微镜集成在一起（图1）。为了构建集成系统，聚丙烯酰胺 （PA） 凝胶被浇在定制切割的玻璃上，MDCK 细胞在由 PDMS 模具制成的微图案岛屿中播种。在本实验中，创建了12个MDCK细胞孤岛（四行乘三列，直径为+700μm）。在附着在PA凝胶上的细胞后，PDMS模具被移除以启动集体迁移。预制造的微流体通道被放置在PA凝胶的顶部，以在细胞岛上方建立微流体通道（图1A）。

然后，为了在微流体通道内建立浓度梯度，左入口连接到含有荧光染料溶液的供应储液。此外，中间和右侧入口连接到仅包含介质的电源储层。然后，出口连接到注射器泵，以去除微流体通道中的液体。定制切割玻璃的三明治和微流体通道入到定制的显微镜舞台上。样品和自动荧光显微镜一起保存在活细胞成像的培养箱内。在整个实验中，细胞保持在5%CO2和37°C。 荧光染料强度的梯度以0.125-2μL/min的流速快速建立（<...

讨论

组成细胞的集体迁移是发育和再生过程中的一个重要过程，迁移方向往往受生长^因子4、23的化学梯度的引导。在集体迁移期间，细胞与相邻细胞和底层基质继续相互作用。这种机械相互作用产生一些紧急现象，如杜罗塔^{克42、plithot轴33}和基^轴43。然而，这项研究是使用单一浓度的生长因子进行的，如胎儿牛血清中的那些。为了填补这一空白，该协议描述了一个新的实验平台，它可以在化学梯度下测量集体细胞迁移过程中的机械相互作用。

新平台结合了三个已广泛使用的实验系统:微模式、牵引显微镜和微流体。首先，对用于集体移徙的细胞岛进行了微观模式设计。其次，牵引显微镜和单层应力显微镜都用于迁移细胞的机械测量。最后，利用微流体平台对迁移细胞建立化学梯度。通过这个实验系统，证明单个岛屿内的细胞在响应不同的化学梯度时会以不同的方式迁移。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA （1X）	Gibco	25200-056
1 M HEPES 缓冲溶液	Gibco	15630-056
1 mm 活检穿刺	Integra Miltex	33-31AA-P/25
100 mm 培养皿	SPL	10100	直径 100 mm，高度 15
mm 14 mm 空心穿刺	ILJIN	124-0571
18 mm Ø盖玻片	Marienfeld-Superior	111580	圆形 18 mm，厚度 1 号（0.13 至 0.16 mm）
2% 双丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610142	戴防护手套、穿衣服和护目镜。
3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯 （TMSPMA）	Sigma-Aldrich	440159-500ML
三通旋塞阀	Hyupsung	HS-T-61N	注意：如果之前打开过，请勿使用。不要重新消毒或重复使用
30 cm 最小体积线（儿科）	Hyupsung	HS-MV-30	注意：如果之前打开过，请勿使用。不要重新消毒或重复使用
35 mm 细胞培养皿	康宁
40% 丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610140	戴防护手套、穿衣服和护目镜。
75 cm 最小体积线（儿科）	Hyupsung	HS-MV-75	注意：如果之前打开过，请勿使用。请勿再甾化或再使用
乙酸	J.T. Baker	JT9508-03
过硫酸铵 （APS）	Bio-Rad	1610700
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240-062
底部玻璃芯片	MicroFIT		24 x 24 x 1 mm，定制，矩形槽（6 x 12 mm，深度：100 μm）
I 型胶原蛋白，大鼠尾	康宁	354236
定制玻璃支架	Han-Gug Mechatronics	定制
Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）	Welgene	LM 001-11
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Biowest	L0615-500	不含镁、钙
胎牛血清 （FBS）	Gibco	26140-179
FluoSpheres 胺修饰的微球	Invitrogen	F8764	0.2 µm，黄绿色荧光 （505/515）
肝细胞生长因子 （HGF）	Sigma-Aldrich	H1404-5UG	重组，人
JuLI 阶段活细胞成像系统	NanoEnTek 在		自动化 X-Y-Z 阶段和氟化成像 培养箱兼容（37 °C 和 5% CO2）
Madin-Darby 犬肾 （MDCK） 细胞			II 型
氧等离子系统	Femto Science	CUTE-MPR
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
罗丹明 B 异硫氰酸盐–右旋糖酐	Sigma-Aldrich	R9379-100MG	70 kDa，用于估计微流体通道中 HGF 的时空分布
无菌皮下注射针 18 G	KOVAX		修剪针尖并将其弯曲 90 度，以便与体积线连接进/出端口
胶带	3M/Scotch	810D	33 m x 19 mm
SU-8 母模	MicroFIT		4 英寸直径，定制的
磺基琥珀酰亚胺基 6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯氨基）己酸酯 （Sulfo-SANPAH）	Thermo Scientific	22589	储存在 -20 摄氏度。避湿避光储存。
Sylgard 184 弹性体套件	Dow Corning		PDMS
注射泵	Chemyx Inc.	型号 fusion 720	抽出液体
	使用入口储液罐或出口注射泵的 KOVAX 1、3、5、10 或 50 cc 注射器泵
紫外线 （UV） 灯	UVP LLC	95-0248-02	365 nm 波长