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测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/60419

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2019年12月3日

 ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, Korea University of Science and Technology (UST)

本文内容

摘要

本方案描述了如何测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的肠道通透性。该方法有助于开展与肠道菌群和宿主相互作用相关的肠道健康基础生物学研究，也可用于筛选能够治疗肠漏综合征和炎症性肠病的益生菌及化学物质。

摘要

在生物体内，肠道高通透性是一种导致多种炎症性肠病（IBD）的严重症状。Caenorhabditis elegans 是一种非哺乳动物模型，因其寿命短、通体透明、成本低廉且不涉及动物伦理问题，被广泛用作检测系统。本研究建立了一种方法，结合高通量图像分析系统，用于研究不同细菌及3,3'-二吲哚基甲烷（DIM）对 C. elegans 肠道通透性的影响。线虫经不同肠道细菌感染或与DIM共处理48小时后，再饲喂荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖过夜。随后通过比较线虫体内荧光图像及荧光强度来评估其肠道通透性。该方法还可能用于鉴定影响动物模型肠道通透性的益生菌和致病菌，适用于检测有害或有益化学物质对肠道通透性及肠道健康的影响。然而，该方案在基因层面仍存在明显局限性，尤其是在确定哪些基因发生改变以调控疾病方面，因为该方法主要用于表型分析。此外，该方法难以精确判断在感染过程中是哪些致病性底物引发炎症或增加线虫肠道的通透性。因此，需进一步开展深入研究，包括利用突变型细菌和线虫探究分子遗传机制，以及对细菌化学成分进行分析，以全面评估细菌和化学物质在调控肠道通透性中的功能。

引言

肠通透性被认为是与肠道微生物群和黏膜免疫相关的主要屏障之一，可能受到多种因素的影响，例如肠道微生物群的改变、上皮损伤或黏液层的改变1。近期已有研究报道了通过分析荧光物质穿过培养的人肠道细胞层的通量速率来测定肠通透性的有效方案2，但关于利用FITC-葡聚糖染色法测定线虫（尤其是C. elegans）肠道通透性的合适实验流程，相关研究报道较少。

有两种用于测量肠道通透性的代表性实验方案 秀丽隐杆线虫 使用尼罗红3 和赤藓红二钠（或蓝精灵检测法）4,5在本实验方案中，我们使用了异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran，平均分子量为10,000），其分子量远高于尼罗红（分子量 = 318.37）和二钠荧光蓝（erioglaucine disodium，分子量 = 792.85）。与尼罗红或二钠荧光蓝染料相比，FITC-dextran 更接近于实际通过肠上皮层吸收的大分子营养物质（如碳水化合物）。肠道通透性 秀丽隐杆线虫 喂食含赤藓红二钠（蓝色Smurf染料）的样本可无需荧光显微镜即可轻松评估。然而，在Smurf实验中，由于缺乏标准化，肠道通透性的定量分析较为困难，需进行人工评估4,5在尼罗红检测中，尼罗红也会对细胞中的脂滴进行染色，这可能会干扰肠道通透性的精确定量 秀丽隐杆线虫6. 本实验方案可实现对肠道通透性的快速、精确的定量分析 秀丽隐杆线虫 经多种肠道细菌和化学物质处理，同时避免非特异性脂质染色。

秀丽隐杆线虫 由于价格低廉、操作简便、动物伦理问题较少且生命周期短，有利于快速开展实验，因此是生物学领域的典型模式生物。7。特别是，在整个 秀丽隐杆线虫 基因组发表后，近40%的基因在 秀丽隐杆线虫 基因组中发现与导致人类疾病的基因同源的基因8此外，其透明的身体便于观察生物体内部结构，这有利于细胞事件的研究以及细胞生物学中的荧光应用，例如使用DAPI对干细胞进行染色或免疫组织化学分析。9. 秀丽隐杆线虫 常被用作研究肠道微生物群与宿主相互作用的实验动物；此外， C. elegansns 用于筛选具有促进健康作用的益生菌10,11,12 以及促进肠道健康的膳食化学成分13,14.

Pseudomonas aeruginosa 和 Enterococcus faecalis 是众所周知的肠道细菌，对胃肠道系统具有负面影响，尤其是对肠道中的结肠上皮细胞15,16。因此，测量这些细菌引发的肠道通透性对于筛选和开发能够修复并减轻细菌性炎症与感染所造成损伤的新药至关重要。在本方案中，我们检测了这些肠道细菌对 C. elegans 肠道通透性的影响。

我们还报告了一种用于检测化学物质对C. elegans肠道通透性影响的优化方案。为此，我们选用3,3'-二吲哚基甲烷（DIM）作为模型化合物，因为DIM是一种源自吲哚-3-甲醇的生物活性代谢产物，而吲哚-3-甲醇存在于Brassica类食用植物中，已有研究报道其在小鼠中对炎症性肠病（IBD）具有治疗作用17,18。此外，我们最近发现DIM可在培养的人肠道细胞以及模式线虫C. elegans中改善肠道通透性功能障碍19。

在本研究中，我们采用了三种不同的实验条件。首先，我们测定了不同细菌P. aeruginosa和E. faecalis对肠道通透性的影响（图1）。其次，我们测定了活的和热灭活的P. aeruginosa对肠道通透性的影响（图2）。第三，我们测定了DIM（一种模型化学物质）对摄食P. aeruginosa的C. elegans肠道通透性的影响（图3）。

本研究的目的是建立优化的实验方案，用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）的肠道通透性，该通透性会因不同肠道细菌及化学物质处理而发生变化。

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方案

1. 准备 P. aeruginosa PAO1 和 大肠杆菌 OP50 培养物

  1. 制备 500 mL 无菌的 Luria-Bertani (LB) 培养基（表 1），并将一株铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）单菌落接种至该培养基中。在 37 °C、150 rpm 振荡条件下培养 14 至 15 小时。
  2. 将菌液均分至两个 500 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 3,220 x g 离心 30 分钟。
  3. 弃去上清液，直至剩余体积为 50 mL（初始体积的十分之一），然后重悬菌体沉淀。
  4. 将浓缩后的细菌培养物储存于 4 °C，待后续使用。P. aeruginosa 培养物的储存时间最长可达 1 个月，但用于诱导肠道损伤时，新鲜培养物效果更佳。
    注意：本实验步骤可在此处暂停。除使用完整的活菌外，还可利用细菌培养上清液来检测肠道细菌的作用19。
  5. 制备大肠杆菌（E. coli）OP50 时，将 E. coli OP50 培养于 DYT 培养基（表 1）中，随后执行与上述相似的操作步骤，但将体积减少至原始体积的六分之一。例如，若初始体积为 500 mL，则去除上清液后剩余体积约为 83 mL。
    注意：本实验步骤可在此处暂停。

2. Enterococcus faecalis KCTC 3206 菌种培养物的制备

  1. 制备 500 mL 无菌脑心浸液（BHI）肉汤（表 1）。
  2. 将一个菌落接种至 500 mL BHI 肉汤中，在 37 °C、150 rpm 条件下于摇床培养箱中培养 14–15 小时。
  3. 将细菌培养物等分至两个 500 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 3,220 x g 离心 30 分钟。
  4. 弃去上清液，直至剩余体积为 50 mL（初始体积的十分之一），然后重悬菌体沉淀。
  5. 将浓缩的细菌培养物储存于 4 °C，待用。新鲜培养物更适用于检测对肠道通透性的影响。
    注意： 此处可暂停本实验方案。

3. 热灭活的制备 E. coli OP50 和热灭活 P. aeruginosa PAO1 菌株培养物

  1. 按照上述方法（步骤 1.1–1.3）培养并收集细菌。
  2. 按照先前所述方法对 E. coli OP50 或 P. aeruginosa PAO1 菌液进行热灭活20,21,22。热灭活操作：将重悬的细菌在 65 °C 水浴中孵育 30 分钟。
  3. 将浓缩的细菌培养物冷却至室温，并于 4 °C 保存备用，保存时间最长可达 1 个月。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

4. 制备秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道通透性受不同细菌影响的测试用线虫生长培养基（NGM）平板

  1. 在500 mL玻璃瓶中加入1.25 g蛋白胨、1.5 g NaCl、8.5 g琼脂、一个磁力搅拌子和487.5 mL蒸馏水（表1）。
  2. 充分混合，于121 °C条件下高压灭菌15分钟，然后在水浴中冷却至55 °C，持续30分钟。
  3. 将培养基从水浴中取出，向NGM中加入各组分（0.5 mL 1 M CaCl2、0.5 mL胆固醇、0.5 mL MgSO4、12.5 mL KPO4）（表1），并充分混匀。
    注意：除溶解于无水乙醇中的胆固醇外，所有组分均需进行高压灭菌，所有实验步骤均须在洁净台中进行。
  4. 将20 mL NGM分装至每个90 × 15 mm的培养皿中，在室温（约20 °C）下的洁净台中静置，使琼脂凝固。NGM平板可在4 °C下保存最多一个月。
    注意：此处可暂停实验流程。用于FITC-葡聚糖染色的NGM平板采用相同步骤（步骤4.1–4.3）制备。将10 mL NGM分装至每个60 × 15 mm培养皿中，在室温（约20 °C）下的洁净台中静置凝固。
  5. 从4 °C冰箱中取出细菌培养物，在接种至NGM平板前充分涡旋混匀。
  6. 向每块新鲜NGM平板中加入共800 µL细菌培养物，并在20 °C培养箱中过夜干燥。
    注意：在第一次实验（图1）中，准备了两块接种E. coli OP50的NGM平板、一块接种P. aeruginosa PAO1的NGM平板和一块接种E. faecalis KCTC3206的NGM平板。在第二次实验（图2）中，准备了两块接种活体E. coli OP50的NGM平板、一块接种活体P. aeruginosa PAO1的NGM平板和一块接种热灭活P. aeruginosa PAO1的NGM平板。

5. 化学物质（DIM）对肠道通透性影响测试用NGM平板的制备 秀丽隐杆线虫 喂食 P. aeruginosa

  1. 向500 mL玻璃瓶中加入0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl、195 mL蒸馏水、一个磁力搅拌子和6.8 g琼脂（NGM琼脂）。
  2. 向另一个500 mL玻璃瓶中加入0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl、195 mL蒸馏水和一个磁力搅拌子（不含琼脂），配制NGM肉汤。
  3. 将两个瓶子（来自步骤5.1–5.2）、一个空的100 mL玻璃瓶和一个空的500 mL玻璃瓶在121 °C下高压灭菌15分钟。然后，将含有培养基的瓶子置于水浴中冷却至55 °C，持续30分钟。保持琼脂培养基在水浴中，并取出含有肉汤的瓶子（来自步骤5.2）进行下一步操作。
  4. 向NGM肉汤中加入添加剂：0.4 mL的1 M CaCl₂2，0.4 mL 乙醇中的胆固醇（mL），0.4 mL 1 M MgSO₄4 和10 mL 1 M KPO4 （除乙醇中的胆固醇外，所有组分均需灭菌）。然后，在 55 °C 下使用磁力搅拌器将混合物充分搅拌。
  5. 用二甲基亚砜（DMSO）标记已灭菌的500 mL空玻璃瓶，用DIM标记已灭菌的100 mL空玻璃瓶。
  6. 将50 mL NGM肉汤转移至标有DIM的100 mL瓶中。向瓶中加入500 µL 20 mM DIM储备液，充分混匀。
    注意： DIM 溶于 DMSO 中（20 mM DIM 储存液）。
  7. 迅速将NGM琼脂培养基从水浴中取出，倒入50 mL至标有DIM的瓶子中，并充分混匀。
  8. 将20 mL含DIM的NGM培养基分装至每个90 mm × 15 mm的培养皿中。此步骤可制备约五个含DIM的NGM平板。
    注意： 每个NGM平板中DIM的终浓度为100 µM。
  9. 准备含DMSO的NGM平板时，将150 mL NGM培养基转移至标有DMSO的500 mL瓶中，加入1.5 mL DMSO，充分混匀。
  10. 向标记为DMSO的瓶子中加入150 mL NGM琼脂培养基，并充分混匀。
  11. 在每个90 mm × 15 mm的培养皿中加入20 mL含DMSO的NGM培养基。此步骤可制备约十五块含DMSO的NGM平板。
    注意： 每个NGM平板中DMSO的终浓度为0.5%。
  12. 在室温下凝固平板至少3小时，随后于4 °C保存直至使用。
    注意： 此处可以暂停实验方案。
  13. 移除 E. coli OP50 或 P. aeruginosa 从4 °C冰箱中取出PAO1菌液（步骤1.4），充分涡旋混匀后涂布于NGM平板上。
  14. 加入800 µL的 E. coli OP50 或 P. aeruginosa 将PAO1菌液接种至每块新鲜的NGM琼脂平板上，置于20 °C培养箱中过夜干燥。
    注意： 此处可以暂停实验方案。对于第三个实验（图3），两个含有DMSO并涂有活菌的NGM平板 E. coli OP50，一个含有DMSO的NGM平板，涂有活菌 P. aeruginosa PAO1，以及一个含有DIM的NGM平板，涂布有活菌 P. aeruginosa PAO1 菌株被制备。

6. 制备年龄同步的 C. elegans

  1. 在固体 NGM 平板上培养线虫，并用 E. coli OP50 喂养，直至达到所需种群数量。
  2. 采用定时产卵法或漂白液处理法对卵进行同步化，具体操作如先前所述20,23,24。

7. 细菌或DIM和FITC-葡聚糖喂养处理

  1. 在添加了活菌的 NGM 平板上，将年龄同步的卵于 20 °C 培养 64 小时 E. coli 以OP50作为食物
  2. 用S缓冲液清洗同步化至L4幼虫期的线虫，并将其（超过约500条）转移至含有不同细菌和化学物质的处理用NGM平板（见步骤4.6和5.14后的注释）。在20 °C条件下培养48小时。
    注意： 处理时间可根据所用细菌和化学物质的不同，介于24至72小时之间。DIM的治疗或预防效果也可通过以下方式评估：先用病原体预处理线虫，再用DIM处理线虫（评估治疗效果）；或先用DIM预处理线虫，再用病原体处理（评估预防效果）。19.
  3. 为制备含FITC-葡聚糖的培养板，将2 mL热灭活的 E. coli OP50 加入 4 mg FITC-葡聚糖。然后，将 100 µL FITC-葡聚糖分装 E. coli 将OP50混合物加入二十个新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）中，并在洁净台中静置干燥1小时。
    注意： 每个NGM平板中FITC-葡聚糖的终浓度为20 μg/mL。
  4. 准备五个 E. coli 不含FITC-葡聚糖的含OP50的NGM平板用于溶剂对照处理。为此，取100 µL热灭活的 E. coli 在洁净工作台上，将OP50涂布于每块新的NGM琼脂平板（60 mm × 15 mm）上，静置干燥1小时。
    注意： 每次独立实验需要十五个添加了FITC-葡聚糖的NGM平板和五个未添加FITC-葡聚糖的NGM平板。
  5. 在处理48小时后（自步骤7.2起），用S缓冲液清洗线虫，将线虫转移至添加FITC-葡聚糖的培养板以及不含FITC-葡聚糖的NGM培养板中，于培养板中过夜孵育（14–15小时）。
    注意： 每个处理组需要进行5次FITC-葡聚糖染色（或溶剂对照喂养）重复实验。
  6. 用S缓冲液清洗线虫，然后将其转移至新鲜的NGM琼脂平板上爬行1小时。
    注意： 每次独立实验共需要 20 个新鲜的 NGM 平板。在此步骤中，可使用未添加或添加了 E. coli OP50
  7. 向黑色96孔平底板的每个孔中加入50 µL 4%甲醛溶液。从每块NGM平板转移约50条线虫至各孔，用于荧光检测。1至2分钟后，彻底吸除各孔中的甲醛溶液，并加入100 µL封片介质以覆盖孔底。
    注意： 4% 甲醛溶液用于固定和 immobilize 线虫。每个处理组使用 5 个孔（5 个重复）进行图像分析。

8. 使用 Operetta 成像系统对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行成像，并通过检测荧光素异硫氰酸-葡聚糖（FITC-dextran）荧光吸收测定肠道通透性

注意：可使用荧光体视显微镜进行图像分析，以替代 Operetta 系统。

  1. 使用 Operetta 高内涵成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并通过 Harmony 软件分析图像。
  2. 在 Harmony 软件中，点击 Open lid 图标以打开盖子，将培养板放入仪器中。
  3. 设置参数。
  4. 点击 Set up，选择培养板类型（96 孔 Corning 平底板），并添加通道（明场和 EGFP 通道）。
  5. 调整布局。进入 Layout selection，选择 Track 并调整参数（第一张图像在 1 µm，共 10 个层面，间距为 1 µm）。
  6. 选择一个处理孔和一个成像视野，在 Run experiment 部分点击 Test，检查图像是否满意。
  7. 若图像满意，返回 Set up 部分，点击屏幕末尾的 Reset 图标，然后选择所有目标孔及适当数量的成像视野。
  8. 再次进入 Run experiment，输入培养板名称，点击 Start 开始运行。
  9. 为测量荧光强度，进入图像分析部分并导入图像。通过选择 EGFP 通道和方法 B 来识别细胞。将公共阈值调整为 0.5，面积设为 >200 µm2，分离因子设为 3.0，个体阈值设为 0.18，对比度设为大于 0.18。然后计算强度属性，并选择“平均值”作为输出。点击 Apply 图标以保存设置。
  10. 进入 Evaluation 部分，通过生成热图和数据表来测量强度。将 Readout parameter 设置为 Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well，然后开始评估。
    注意： 此处可暂停实验流程。
  11. 要从 Operetta 中导出数据，请点击 Setting 按钮并选择 Data management。
  12. 选择 Write archive，然后点击浏览并选择文件。
  13. 为选择文件，点击左上角的小 + 符号，然后点击 Measurement 并选择 Plate name。
  14. 选择文件后点击 OK。
  15. 点击活动路径中的 Browse 按钮，选择保存文件的路径。
  16. 点击 Start 以保存数据文件。
    注意： 此处可暂停实验流程。

9. 线虫（C. elegans）中FITC-葡聚糖荧光的统计学分析

  1. 使用统计软件导入数据，并计算均值和标准差（SD）。
  2. 采用单因素方差分析（ANOVA）进行显著性差异分析，随后进行Tukey多重比较检验。

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结果

孵育后 P. aeruginosa PAO1 秀丽隐杆线虫 与另外两种细菌菌株孵育后所显示的荧光相比，线虫体内FITC-葡聚糖荧光显著增强图1）。以喂食不同食物的线虫的荧光强度 E. coli OP50 P. aeruginosa PAO1，和 E. faecalis KCTC3206 为 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9 和 105.6 ± 10.6%， respectively。这些数据强调了 P. aeruginosa 对肠道上皮屏障造成了更严重的损伤，因此线虫的肠道通透性显著增加。根据这一结果，荧光素异硫氰酸标记的葡聚糖（FITC-dextran）可轻易穿过肠壁层，因此 P. aeruginosa 被选为用于筛选DIM作用效果的潜在候选病原体。尽管 E. faecalis 是一种肠道病原体，可产生细胞外超氧化物和过氧化氢，从而损伤结肠上皮细胞的DNA

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讨论

通过利用这种结合自动化荧光显微镜与定量图像分析的新方法来测定 C. elegans 的肠道通透性，可以在体内特异性地检测肠道微生物或化学物质在 C. elegans 肠道中所引起的变化。该实验方案操作简便，适用于多种研究任务，可用于肠道通透性研究，例如在应激条件下检测活性氧（ROS）以及进行形态学分析。此外，该方法还可用于评估治疗和预防措施对 C. elegans 多种病原体的干预效果。特别是，该方法可能是一种高效的研究不同细菌菌株（包括有害菌和有益菌）作用机制的实验流程。某些结构相似的病原菌和益生菌对宿主产生不同的效应33,34。本方法有助于评估细菌所利用的具体机制，并确定其靶向底物是在胞外还是胞内分泌。此外，该方法还有助于强化“热处理在病原体失活过程中发挥关键作用”这一假说。

然而，该实验过程中也存在一些困难。首先，每个孔板中的线虫数量对于获得具有统计学意义的结果和可靠的线虫检测至关重要，因此建议线虫密度达到...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国科学技术院院内研究基金（2E29563）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3,3’-二吲哚基甲烷 SigmaD9568
90×15 mm 培养皿SPL Life Sciences, South Korea10090
60×15 mm 培养皿SPL Life Sciences, South Korea10060
Bactor 琼脂Beckton DickinsonREF. 214010
甲醛溶液 SigmaF1635
脑心浸出液（BHI） Becton DickinsonREF. 237500
秀丽隐杆线虫 N2秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）野生型 
胆固醇SigmaC3045
Costa 检测板，96 孔黑色带透明平底未处理聚苯乙烯板，无盖Corning IncorporatedREF. 3631
二甲基亚砜SigmaD2650
粪肠球菌 KCTC 3206韩国典型培养物保藏中心KCTC NO. 3206兼性厌氧
大肠杆菌 OP50秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
异硫氰酸荧光素-葡聚糖SigmaFD10S
Harmony 软件 PerkinElmer版本 3.5
LB 培养基（Luria-Bertani）MerckVM743185 626  1.10285.5000
七水合硫酸镁 Fisher BioreagentsBP2213-1
Fluoromount 水性封片介质SigmaF4680
Operetta CLS 高内涵分析系统PerkinElmer HH16000000
蛋白胨MerckEMD 1.07213.1000
铜绿假单胞菌 PA01韩国典型培养物保藏中心KCTC NO. 1637
氯化钠Fisher BioreagentsBP358-1
体视显微镜Nikon, JapanSMZ800N
酵母提取物Becton DickinsonREF. 212750

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