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利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒SSHHPS

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DOI：

10.3791/60421

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2019年12月21日

 ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

本文内容

摘要

我们提出了一种通用方案，用于识别嵌入病毒多聚蛋白中的宿主-病原体蛋白短序列同源区（SSHHPS）。多种第四组病毒可利用病毒蛋白酶识别SSHHPS，并靶向降解特定的宿主蛋白。

摘要

甲病毒的酶以单一多肽形式合成。非结构多蛋白（nsP）通过其nsP2半胱氨酸蛋白酶进行加工，产生对病毒复制至关重要的活性酶。病毒蛋白酶具有高度特异性，可识别保守的切割位点基序序列（约6-8个氨基酸）。在多种IV组病毒中，nsP蛋白酶的切割位点基序序列可在参与先天免疫应答的特定宿主蛋白中找到，某些情况下，这些被靶向的蛋白似乎与病毒诱导的表型相关。这些病毒利用宿主与病原体蛋白之间短段同源序列（SSHHPS）实现对宿主蛋白的靶向降解。为鉴定SSHHPS，可将病毒蛋白酶切割位点基序序列输入BLAST程序，并对宿主基因组进行搜索。初步切割实验可使用纯化的nsP病毒蛋白酶及在E. coli中制备的荧光共振能量转移（FRET）底物进行。FRET底物包含青色和黄色荧光蛋白以及切割位点序列（CFP-序列-YFP）。该蛋白酶检测既可在酶标仪中连续进行，也可在SDS-PAGE凝胶中非连续进行。可通过计算机模拟生成肽底物结合模型，以指导底物筛选和定点突变研究。CFP/YFP底物还被用于筛选蛋白酶抑制剂。这些体外和计算机模拟方法可与基于细胞的检测相结合，以确定被靶向的宿主蛋白是否影响病毒复制。

引言

在多种基因组中均可发现病毒与宿主之间或宿主与病毒之间发生水平基因转移的证据1,2,3,4。病毒内源化的一个实例是细菌宿主基因组中发现的CRISPR间隔序列4。最近，我们发现了宿主蛋白序列嵌入于正链单股RNA第四组病毒（(+)ssRNA Group IV viruses）非结构多聚蛋白中的证据。这些位于病毒基因组编码区内的序列可代代传递。在病毒和宿主中均能发现较短的同源宿主-病原体蛋白序列片段（SSHHPS）5,6。SSHHPS是病毒蛋白酶识别的保守切割位点基序序列，其与特定宿主蛋白具有同源性，这些序列可指导特定宿主蛋白的降解。

在我们之前发表的研究6中，我们整理了所有被病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白，并发现这些靶点的分布并非随机（表1）。其中呈现出两个明显趋势。首先，切割宿主蛋白的病毒蛋白酶绝大多数属于IV组病毒（25个案例中有24个涉及IV组病毒蛋白酶），仅有一种属于(+)ssRNA的VI组逆转录病毒（HIV，人类免疫缺陷病毒）7。其次，被病毒蛋白酶切割的宿主蛋白靶点通常参与天然免疫反应的启动，表明这些切割作用旨在抑制宿主的免疫应答。被病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白中，有一半是已知参与诱导干扰素（IFN）和促炎性细胞因子产生的信号级联中的组分（表1）。其余蛋白则参与宿主细胞的转录8,9,10或翻译过程11。有趣的是，Shmakov 等人4发现，许多CRISPR前间隔序列对应于参与质粒接合或复制的基因4。

第四组包括但不限于 黄病毒科，小RNA病毒科，冠状病毒科，杯状病毒科 和 披膜病毒科属于第四组的多种新发和再发传染病病原体包括寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、严重急性呼吸综合征病毒（SARS）和中东呼吸综合征病毒（MERS）。正链单股RNA（(+)ssRNA）基因组本质上相当于一段mRNA。为了产生基因组复制所需的酶，该正链单股RNA基因组必须首先进行翻译。在甲病毒属及其他第四组病毒中，复制所需的酶以单一多聚蛋白的形式产生（例如，VEEV中的nsP1234）。非结构多聚蛋白（nsP）通过nsP2蛋白酶进行蛋白水解加工（nsP1234 → nsP1、nsP2、nsP3、nsP4），从而生成具有活性的酶。12 (图1）。nsP2蛋白酶对多聚蛋白的切割对于病毒复制至关重要；通过删除nsP2蛋白酶活性位点的半胱氨酸或对其进行定点诱变，已证实了这一点。13,14值得注意的是，病毒蛋白的翻译早于基因组复制事件。例如，nsP4含有复制（+）ssRNA基因组所需的依赖RNA的RNA聚合酶。基因组复制过程中可产生双链RNA（dsRNA）中间体；这些中间体可触发宿主的天然免疫反应。因此，这些病毒可能在感染早期切割宿主的天然免疫反应相关蛋白，以抑制其功能。15,16,17.

基因沉默可在DNA、RNA和蛋白质水平上发生。图中所示的各种沉默机制的共同之处是什么？ 图1 使用短的外源DNA、RNA或蛋白质序列来引导特异性靶标的降解，从而抑制其功能。这种沉默机制类似于 "搜索并删除" 用三种不同语言编写的程序。短的切割位点序列类似于一个 "关键词"每个程序都含有一种酶，能够识别短序列（即 "关键词"）以及一个词在 "文件" 将被删除的序列。一旦找到匹配位点，酶就会切断（"删除"）较大的目标序列。图中所示的三种机制 图1 用于保护宿主免受病毒感染，或保护病毒免于宿主免疫系统的攻击。

病毒蛋白酶识别长度约为2-11个氨基酸的短切割位点基序序列；以核苷酸计，这相当于6-33个碱基。作为对比，CRISPR间隔序列约为26-72个核苷酸，RNAi序列约为20-22个核苷酸18,19。尽管这些序列相对较短，但仍可被特异性识别。由于氨基酸的多样性更高，对于识别6-8个或更长氨基酸序列的病毒蛋白酶而言，发生随机切割事件的概率相对较低。宿主蛋白中SSHHPS的预测在很大程度上取决于所研究病毒蛋白酶的特异性。如果蛋白酶具有严格的序列特异性要求，则发现切割位点序列的概率为1/206 = 6400万分之一，或1/208 = 256亿分之一；然而，大多数蛋白酶在各个亚位点具有一定容忍性（例如，在S1位点可容忍R或K）。因此，并不要求宿主与病毒中发现的序列之间具有完全一致的序列同一性。对于序列要求较宽松的病毒蛋白酶（例如属于Picornaviridae科的蛋白酶），在宿主蛋白中发现切割位点的概率可能更高。表1中的许多条目均来自Picornaviridae科病毒。

Schechter & Berger 记号法20常用于描述蛋白酶底物中的残基及其结合的亚位点，本文全程采用此记号法。底物中位于可切割肽键N端的残基记为P3-P2-P1，位于C端的残基记为P1'-P2'-P3'。蛋白酶中相应结合这些氨基酸残基的亚位点分别为S3-S2-S1和S1'-S2'-S3'。

为了确定哪些宿主蛋白被靶向，我们可以通过鉴定病毒多聚蛋白切割位点中的SSHHP序列，并搜索含有这些序列的宿主蛋白。本文概述了利用已知病毒蛋白酶切割位点序列来鉴定SSHHP的方法。所描述的生物信息学方法、蛋白酶检测以及计算机模拟方法应与基于细胞的实验联合使用。

对病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白进行序列比对，揭示了这些短切割位点序列中存在物种特异性差异。例如，委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的nsP2蛋白酶被发现可切割人源TRIM14，一种三结构域（TRIM）蛋白6。某些TRIM蛋白是病毒限制因子（例如TRIM5α21），大多数被认为具有泛素E3连接酶活性。TRIM14缺乏RING（really interesting new gene）结构域，因此不被认为是一种E3连接酶22。已有研究提出TRIM14可能是线粒体抗病毒信号体（MAVS）中的接头蛋白22，但也可能具有其他抗病毒功能23。对来自不同物种的TRIM14序列进行比对显示，马缺乏该切割位点，并携带一种截短形式的TRIM14，缺失其C末端的PRY/SPRY结构域。该结构域包含一个多泛素化位点（图2）。在马中，这些病毒感染具有高度致死性（约20–80%死亡率），而在人类中，仅有约1%因VEEV感染死亡24。PRY/SPRY结构域的切割可能暂时中断MAVS信号级联反应。该级联反应可由双链RNA（dsRNA）触发，进而诱导干扰素和促炎性细胞因子的产生。因此，SSHHPS序列的存在可能有助于预测哪些物种对特定IV组病毒具有防御系统。

在第四类病毒中，干扰素拮抗机制被认为具有多重冗余性25。宿主蛋白的切割在感染过程中可能是瞬时的，其浓度可能随时间恢复。我们发现在转染编码蛋白酶的质粒（巨细胞病毒启动子驱动）后6小时，即可在细胞中检测到TRIM14的切割产物。然而，在更长时间后，这些切割产物则无法被检测到。在病毒感染的细胞中，动力学过程有所不同，切割产物可在感染后6至48小时之间被检测到6。其他研究者也曾报道，在感染后3至6小时即可观察到宿主蛋白切割产物的出现9,11。

细胞内的蛋白水解活性通常难以捕捉；其切割产物在溶解度、浓度、稳定性和寿命方面可能存在差异。在基于细胞的检测中，不能假定切割产物会在细胞内累积，也不能认为切割与未切割蛋白的条带强度会呈现此消彼长的补偿性变化，因为被切割的蛋白可能迅速降解，在预期分子量（MW）处的Western印迹中无法被检测到（例如，含有表位的区域可能被宿主其他蛋白酶切割，或发生泛素化修饰）。如果病毒蛋白酶的底物是天然免疫应答蛋白，则其浓度在感染过程中可能发生改变。例如，某些天然免疫应答蛋白在病毒感染前即已存在，并在干扰素作用下进一步诱导表达26。因此，目标蛋白的浓度在感染期间可能波动，导致未感染与感染细胞裂解液之间的比较难以解释。此外，并非所有细胞都会被均一转染或感染。相比之下，使用从大肠杆菌（E. coli）中纯化的蛋白进行的体外蛋白酶检测所涉及的变量较少，且此类检测可采用SDS-PAGE而非免疫印迹进行。在CFP/YFP底物蛋白纯化的早期步骤中，可抑制污染性蛋白酶的活性，同时可纯化突变的病毒蛋白酶作为对照，以确定切割是否由病毒蛋白酶本身引起，还是由污染的细菌蛋白酶所致。

体外蛋白酶检测的一个局限性在于其缺乏哺乳动物细胞的复杂性。酶要切割其底物，二者必须共定位于同一区域。IV组病毒蛋白酶在结构和定位上各不相同。例如，寨卡病毒（ZIKV）蛋白酶嵌入内质网（ER）膜中并朝向细胞质，而委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）nsP2蛋白酶则是存在于细胞质和细胞核中的可溶性蛋白27。在ZIKV SSHHPS分析中发现的一些切割位点序列位于信号肽中，提示某些靶标的切割可能在翻译过程中同时发生。因此，在这些分析中还需考虑蛋白酶与底物在细胞内的具体定位。

基于细胞的检测方法可用于确定已鉴定的宿主蛋白在病毒感染中的作用。通过添加蛋白酶抑制剂6或对宿主靶蛋白引入突变16等手段阻断病毒蛋白酶对宿主蛋白的切割，可用于研究这些干预对病毒复制的影响。过表达靶向蛋白也可能影响病毒复制28。可通过空斑实验或其他方法对病毒复制进行定量分析。

方案

1. 生物信息学：利用BLAST在宿主基因组中鉴定SSHHPS

注意： 蛋白质BLAST可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi找到。

  1. 输入病毒多聚蛋白中切割位点周围的约20个氨基酸。选择非冗余的蛋白质序列，并输入要搜索的宿主基因组（例如 Homo sapiens）。
    1. 如有需要，选择PHI-BLAST。输入一个模式序列（例如，对于下方显示的V12的25个残基，输入模式“AG”，不带引号）。

      figure-protocol-1

      注意：在PHI-BLAST中，方括号[XY]表示该亚位点位置可以是氨基酸X或Y（例如，AG[AC][GAY]）。
    2. 检查BLAST结果，识别出与多聚蛋白切割位点中保守残基具有高序列一致性的匹配结果（例如，三联体基序蛋白14）（图3）。
      注意：对于丝氨酸蛋白酶，P1位点残基的保守性更高；而对于半胱氨酸蛋白酶，P2位点残基的保守性更高。
    3. 将与切割位点序列相同且连续排列（无间隔）的残基用一种颜色标注。将亚位点可容忍但在其他切割位点中出现的不同残基用第二种颜色标注。
      注意：可能存在代表保守性替换（例如Leu与Val）但未出现在病毒切割位点中的残基，这些残基可能被病毒蛋白酶识别，也可能不被识别。
    4. 根据与切割位点序列匹配的连续相同或可容忍残基的数量对BLAST匹配结果进行排序。从列表中选择包含≥6个相同或相似残基的蛋白质，用于蛋白酶活性检测分析。
    5. 对其他切割位点（nsP2/3、nsP3/4等）重复该流程，并通过向PHI-BLAST模式中逐步添加更多高度保守的残基来不断增强预测准确性。

2. 体外实验：蛋白酶底物的设计与制备

  1. 构建一种质粒，编码青色荧光蛋白（CFP）、不超过25个氨基酸的切割位点序列，随后为黄色荧光蛋白（YFP，也称为Venus）29).
    注意： 可采用序列与连接酶非依赖型克隆（SLIC）方法构建质粒30 或商业基因合成。含有所示序列的 pet15b 质粒 图4 由商业途径合成并在此使用。
    1. 为优化底物长度，使用两片段SLIC反应构建额外的可变长度FRET底物，其中包含12-25个氨基酸的天然病毒多聚蛋白切割位点序列。采用SDS-PAGE凝胶分析法或通过以下方法测定稳态动力学参数来分析切割效果。
      注意： 在某些情况下，可通过与已知切割位点的同源性来确定切割位点31如果未观察到含有多聚蛋白连接序列的底物发生切割，可能需要额外的残基或结构基序（例如，α螺旋）。32）。或者，纯化的病毒蛋白酶可能无活性。在进行 SSHHPS 分析之前，应确认病毒多蛋白序列的切割情况。通过使用不同长度的底物（12 至 25 个氨基酸）并随后分析 V最大 和 Km32,33寨卡病毒 ns2B/ns3 蛋白酶在示例中所用的切割位点已有发表34,35.
  2. 通过新鲜转化8-20 µL BL-21(DE3) E. coli 根据制造商说明，将CFP-V12-YFP质粒转化至感受态细胞，并涂布于含Luria Bertani（LB）琼脂平板 50 µg/mL 氨苄青霉素（Ampicillin）37 °C).
    1. 高压灭菌四个装有LB培养基的4 L烧瓶（每瓶1.5 L培养基）以及一个装有100 mL LB培养基的250 mL烧瓶。用铝箔封住每个烧瓶口。
    2. 将一株新转化的细菌菌落接种至100 mL培养液中，于指定条件下培养 37 °C 在200 rpm条件下振荡培养过夜。
    3. 为制备CFP/YFP底物，将4个4 L的锥形瓶各接种25 mL过夜培养物，开始振荡培养 37 °C 并通过紫外-可见分光光度法每小时在600 nm处监测生长情况。
    4. 当细菌在 600 nm 处的吸光度达到约 1.0 时（约培养 3–4 小时），通过加入 0.5 mL 的 1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG）诱导蛋白表达β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至每瓶培养瓶中。加入 IPTG 后，将摇床培养箱的温度调低至 17 °C 并继续培养过夜，使表达持续17-20小时。
    5. 使用高速离心机在 7,000 x g 条件下离心收集细菌 g 10 分钟（4 °C）并保留沉淀物。移除并弃去液体培养基。将沉淀物于 -80 °C 或立即裂解。
    6. 配制 100 mL 裂解缓冲液，含 50 mM Tris（pH 7.6）、500 mM NaCl、35 mL 细菌蛋白提取试剂、30 mg 溶菌酶、25 U DNase 和 1 片蛋白酶抑制剂。用移液器将沉淀重悬于裂解缓冲液中，并将约 25–35 mL 转移至 50 mL 一次性锥形管中。
    7. 将试管置于盛有冰水的塑料烧杯中。将超声破碎仪的探头插入试管，使探头距离管底约1 cm，在5档功率下每次超声15秒，重复10-20次，直至裂解液变得流动且完全液化。
      注意： 超声处理过程中请使用听力保护装置。
    8. 将裂解液转移至高速离心管中，在20,500 x g条件下离心 g 30 分钟 4 °C离心后，保留上清液（约100 mL），转移至洁净的瓶子中。弃去沉淀物。
    9. 配制1 L缓冲液A（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl）。配制300 mL缓冲液B（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，300 mM Imidazole）。
    10. 使用缓冲液A以5 mL/min的流速平衡100 mL镍柱，体积为3个柱体积。
    11. 以2至5 mL/min的流速将裂解液上样至镍柱。用2个柱体积的缓冲液A洗涤柱子，随后用约5个柱体积的20%缓冲液B洗涤。在20%缓冲液B洗涤过程中，监测280 nm处的吸光度（A280）会随着污染物从柱子中洗脱而升高。继续洗涤柱子，直至A280 洗脱液已恢复至基线水平。
    12. 用100%缓冲液B以2-5 mL/min的流速洗脱蛋白，洗脱体积为2-3个柱体积，收集每管10 mL的组分。测定A280 各组分的
    13. 合并并浓缩含有 A 的组分280 > 0.1 使用15 mL离心超滤装置。在5,000 x g 15分钟，并持续添加馏分，直至体积减少至约50–75 mL。
    14. 剪取一段14英寸长、截留分子量（MWCO）为6-8 kDa的透析管。将透析管完全浸没于300 mL水中，煮沸10分钟以充分水化。在膜的一端打一个牢固的结。用透析缓冲液填充透析袋，检查是否存在裂纹或泄漏。将缓冲液从袋中排出，并保持透析袋浸没在透析缓冲液中。
    15. 将2.2.13中浓缩的蛋白用塑料移液管转移至透析袋中，去除袋中任何气泡，用第二个结或透析夹封闭透析袋。将蛋白在500 mL带刻度的量筒中，于50 mM Tris pH 7.6、5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）、250 mM NaCl缓冲液中透析过夜，温度为 4 °C.
    16. 用500 mL 50 mM Tris（pH 7.6）对蛋白质进行第二次透析 4 °C 2小时。
  3. 为阴离子交换柱配制500 mL缓冲液A（50 mM Tris，pH 7.6）和500 mL缓冲液B（50 mM Tris，pH 7.6，1.0 M NaCl）。用3倍柱体积的缓冲液A（2–5 mL/min）平衡30 mL阴离子交换柱。
    1. 将蛋白质从透析袋中取出并转移至瓶中，将瓶子置于冰上。以每分钟2-5 mL的流速将透析后的蛋白质上样到层析柱中。
      注意： CFP/YFP 蛋白将结合到柱子上，且外观呈黄色。
    2. 用缓冲液A洗涤层析柱，直至A280 恢复至初始水平（5 mL/min）。使用梯度洗脱（0–50% 缓冲液B，100 mL）洗脱蛋白，并收集10 mL组分。
    3. 使用 SDS-PAGE 检测柱层析组分，合并含有目标蛋白的组分 >95% 纯度。
    4. 将蛋白质浓缩至 A280 ~10–20，使用15 mL离心超滤装置。以4,500 x g 10 分钟 4 °C 继续添加蛋白质，直至所有含蛋白质的组分均已被合并。
  4. 用移液器小心地从浓缩器中取出蛋白质。将蛋白质分装至1.5 mL 微量离心管中，并在液氮中速冻，以用于长期保存于 -80 °C使用PD-10柱在室温下进行蛋白缓冲液置换，置换前用适当的测定缓冲液平衡PD-10柱。
  5. 利用比尔定律，根据 A 值计算蛋白质浓度280 以及计算得到的消光系数（例如，对于 V12 底物，ɛ = 47,790 M⁻¹·cm⁻¹）-1 cm-1).
    注意： 消光系数（ɛ）可根据蛋白质序列计算得出 图4 使用 Expasy ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/).

3. 准备甲病毒nsP2半胱氨酸蛋白酶

  1. 设计并构建编码蛋白酶的质粒。对于半胱氨酸蛋白酶，使用 pet32 质粒构建硫氧还蛋白（Trx）融合蛋白。
    注意： pet32 质粒编码凝血酶切割位点（LVPRGS），用于去除硫氧还蛋白和 His 标签（图 5）。硫氧还蛋白有助于在表达过程中维持活性位点半胱氨酸处于还原状态。对于丝氨酸蛋白酶，无需使用硫氧还蛋白，因此可省略通过凝血酶去除该标签的相关步骤。VEEV nsP2 蛋白酶序列被插入商业制备的 pet32b 质粒中，以避免操作管制性病原体。
    1. 根据制造商说明，将质粒 DNA 新鲜转化至 BL21(DE3)pLysS E. coli 中。将细菌涂布于含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上。
      注意： 氯霉素仅用于携带 pLysS 质粒的 E. coli 菌株；若使用 BL21(DE3) 细胞，则无需添加氯霉素。此步骤中，LB 琼脂平板上无需添加氯霉素。
    2. 高压灭菌四个装有 1.5 L LB 培养基的 4 L 锥形瓶（共 6 L 总体积），以及一个装有 100 mL LB 培养基的 250 mL 锥形瓶。用铝箔封口。
    3. 挑取平板上的单菌落接种至 100 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 摇床（200 rpm）中培养过夜。
    4. 将 25 mL 过夜培养物接种至 4 L 锥形瓶中，并加入相应的抗生素。
      注意： 携带 pet32 质粒的 BL21(DE3)pLysS 细胞所用培养基应含有终浓度为 25 µg/mL 氯霉素和 50 µg/mL 氨苄青霉素。
    5. 当培养物在 600 nm 处的吸光度达到 1.0 时，加入 0.5 mL IPTG 以诱导蛋白表达。将摇床温度降至 17 °C，继续诱导表达过夜（约 17 小时）。
    6. 通过离心（4 °C，7,000 x g，10 分钟）收集菌体沉淀，弃去上清液。
      注意： 沉淀可在 -80 °C 保存数月，或立即进行裂解。
    7. 配制 100 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.6，500 mL NaCl，2 mM 巯基乙醇（BME），30 mg 溶菌酶，5% 甘油，25 U DNase，35 mL 细菌蛋白提取试剂）。添加 BME 时应在通风橱中打开瓶盖。本步骤及后续所有步骤中，细菌裂解液均需置于冰上或 4 °C 保存。
      注意： 对于半胱氨酸蛋白酶，加入 2 mM BME 以维持亲核性半胱氨酸的还原状态。层析柱可在室温下运行，但缓冲液需预冷。缓冲液应使用冷却至 4 °C 的去离子水配制。
    8. 将细菌沉淀重悬于约 25 mL 裂解缓冲液中，并将约 25 mL 裂解液分装至 4 个 50 mL 一次性锥形管中。将管子置于盛有冰水的塑料烧杯中，于 5 档超声处理 10 次，每次 15 秒，间隔进行。
    9. 将裂解液转移至高速离心管中，于 4 °C、20,500 x g 离心 30 分钟，澄清裂解液。
    10. 配制 0.5 L 缓冲液 A（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，5% 甘油，2 mM BME），并冷却至 4 °C。
    11. 配制 250 mL 缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，500 mM NaCl，5% 甘油，2 mM BME，300 mM 咪唑），并冷却至 4 °C。
    12. 用 3 倍柱体积的缓冲液 A 平衡 50 mL 镍柱，以 2–5 mL/min 的流速上样澄清后的裂解液，并弃去沉淀。
    13. 以 2–5 mL/min 的流速用 2 倍柱体积的缓冲液 A 洗涤柱子，随后用含 20% 缓冲液 B（60 mM 咪唑）的缓冲液 A 洗涤 5 倍柱体积。以 100% 缓冲液 B 洗脱蛋白（5 mL/min），并收集 10 mL 流份。
    14. 合并含有蛋白酶且 A280 ≥ 0.1 的流份，使用 15 mL 离心超滤装置在 4 °C、5,000 x g 条件下离心 15 分钟进行浓缩。当体积浓缩至约 5 mL 后，在超滤装置中进行缓冲液置换：向蛋白样品中加入新鲜透析缓冲液（50 mM Tris pH 7.6，250 mM NaCl，5 mM 二硫苏糖醇（DTT），1 mM EDTA，5% 甘油），再次于 4 °C、5,000 x g 离心 15 分钟；重复缓冲液置换步骤 2–3 次。在透析前向蛋白样品中加入凝血酶（20 µL，1 单位/µL），以去除硫氧还蛋白和 His 标签。
    15. 将蛋白转移至透析袋中，于 4 °C 条件下在 500 mL 量筒内用 500 mL 透析缓冲液透析过夜。
      注意： 在进行阴离子交换层析前，应使用洗脱缓冲液（2 M NaCl，50 mM EDTA）彻底清洗 FPLC（快速蛋白液相层析）系统和镍柱。FPLC 管路中残留的镍离子会与含 DTT 的缓冲液反应，使溶液变为棕色。用 4 倍柱体积的水清洗镍柱和 FPLC 系统，并用水充分冲洗 FPLC 系统。后续纯化可通过在树脂上流过 2 倍柱体积的 0.2 M 硫酸镍溶液再生镍柱。
  2. 为阴离子交换柱配制 1 L 缓冲液 A（50 mM Tris pH 7.6，5 mM DTT，5% 甘油）。
    1. 配制 0.5 L 缓冲液 B（50 mM Tris pH 7.6，5 mM DTT，5% 甘油，1.25 M NaCl）。
    2. 用缓冲液 A（3 倍柱体积，2–5 mL/min）平衡 30 mL 阴离子交换柱。将收集管置于馏分收集器中，用于收集穿流液。
      注意： VEEV 蛋白酶的理论等电点（pI）为 8.7，可结合阳离子交换柱，但会穿流阴离子交换柱。可通过 Expasy ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）根据蛋白序列计算 pI 值。
    3. 用缓冲液 A 将透析后的蛋白稀释 1:3，然后以 5 mL/min 流速上样。以 10 mL 流份收集穿流液。
  3. 从 FPLC 系统上移除阴离子交换柱，连接阳离子交换柱至 FPLC 系统。用 3 倍柱体积的缓冲液 A（5 mL/min）平衡 30 mL 阳离子交换柱。
    1. 以 2–5 mL/min 流速将阴离子交换柱的穿流液上样至阳离子交换柱。用缓冲液 A 洗涤柱子，直至 A280 回到基线水平。使用 100 mL 梯度（0–50% 缓冲液 B）洗脱蛋白，并收集 10 mL 流份。
      注意： VEEV 蛋白酶在约 0.6 M NaCl 条件下洗脱。
    2. 通过 SDS-PAGE 检测各柱流份。合并纯度 >95% 的流份，使用 15 mL 离心超滤装置浓缩至 A280 ≈ 2。酶可于液氮中速冻后保存于 -80 °C。

4. 使用酶标仪连续检测酶活性

  1. 配制50 mL检测缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.0）。
    1. 由于甲病毒蛋白酶的k值相对较低猫 数值，用测定缓冲液稀释酶至 4.7 µM （这大致对应于一个A280 = 0.2（对于不含Trx的VEEV蛋白酶）。
    2. 为了测定酶的活性，需在测定缓冲液中配制底物储备液，使其浓度达到 185 µM；这大致对应于一个A280 = 9. 在8个微量离心管中，配制如下所示的反应混合液 表2 通过混合适当体积的 185 µM 底物储备液和缓冲液。在黑色半区96孔板中，用移液器加入 45 µL 将反应混合物分别加入3个孔中（第1、2、3列）。A行应含有[S] = 5 µM 反应体系，且H行应包含[S] = 140 µM 反应体系
    3. 将酶标仪设置为在两个波长处同时检测荧光信号，并固定光电倍增管（PMT）参数（例如，低档）：
      波长1激发＝434 nm，发射＝527 nm
      波长2激发＝434 nm，发射＝470 nm
    4. 将读取时间设为 20 分钟（每分钟测量 1 次读数），并选择待读取的孔。将酶标板插入酶标仪，测量 20 分钟内自发水解速率。实时监测发射光比值（527 nm 发射光强度/470 nm 发射光强度）。
    5. 运行含有样品的孔板的终点读数 "未切割" 底物
      注意： 这些数值将用于后续的数据计算。3个孔的发射比平均值将作为该样本的数值。 "未切割" t = 0 时的底物 表3.
    6. 移除培养板并用移液器吸取 5 µL 向每孔中加入酶。再次读取酶标板，持续20分钟，每分钟读数一次。将酶标仪设置为输出绝对值。
      注意： 在此检测中，斜率将为负值。每个孔中的总体积为 50 µL.
    7. 在读取结果后，用封板膜密封以防止蒸发。将酶标板置于室温过夜，使酶能够完全切割底物。
    8. 约24小时后，移除封板膜，并使用与之前各孔板相同的光电倍增管（PMT）对孔板进行终点读数。取这些发射比值的平均值并输入 表3 在……下方 "CUT"使用下文所述的SDS-PAGE不连续电泳法（步骤5.1）确认底物的切割情况。
    9. 将数据导出至电子表格。输出两个波长在每个时间点的荧光单位表4).
    10. 使用公式（1）计算在时间 t 时被切割的底物的 nmol 数，其中 X 为在给定时间点的发射比值（527 nm/470 nm）， 阴性 发射比率的 "未切割" t = 0 时的底物 阳性 完全发射比率 "CUT" 切割后24小时测量的底物表3).

      figure-protocol-2

      注意： 代表性荧光数据展示了一个孔（孔 E7）的结果，该孔包含 80 µM 底物（每孔4 nmol S） 表 4对板中的每个孔分别进行计算。
    11. 对于每个孔，绘制 nmol 与时间（min）的关系图，并通过将数据拟合为 y = mx + b 来获得初始反应速率（斜率）。针对 4.1.5 中采集的数据，为每个孔绘制 nmol 与时间（min）的关系图。斜率即为每分钟生成的产物 nmol 数。从酶催化反应速率中减去在 4.1.5 中测得的自发水解速率表5).
      注意： 如果由于将酶标板放入酶标仪时的移动导致第一个读数异常偏高，可从数据中剔除该读数。
    12. 计算加入每个孔中的酶的量（以 mg 为单位）（例如，0.0009 mg）。一个单位定义为一种 µmol 每分钟生成的产物量（µmol/min将每分钟的纳米摩尔数（nmol/min）除以孔中酶的毫克数（mg），得到毫单位/毫克（mU/mg）；再除以1,000，得到单位/毫克（U/mg）。
    13. 绘图 [S] µM 横坐标为底物浓度，纵坐标为 U/mg，将数据拟合到米氏方程以获得 V最大 和 Km这可以在软件中完成（例如 GraFit）。

5. 使用 SDS-PAGE 分析非连续测定酶活性

  1. 准备一个50 µL的反应体系，其中包含10 µM底物和缓冲液，不加酶，并标记为“UNCUT”。
    注意： 底物和缓冲液的体积见表2。如果已进行连续检测，可直接从96孔板中取样使用。
    1. 准备一个50 µL的反应体系，其中包含10 µM底物和5 µL酶，并标记为“CUT”。在将酶加入底物时启动计时器。
      注意： 可将抑制剂加入含有酶和底物的其他反应管中。需调整所加缓冲液的体积以补偿抑制剂的加入体积。DMSO的终浓度不应超过2%。
    2. 在室温（22 ± 3 °C）下孵育反应体系约15–24小时。通过加入50 µL 2x Laemelli缓冲液终止反应。反应终止后，将每支管在沸水中加热3–10分钟。
    3. 按照制造商说明组装电泳槽。插入一块17孔预铸12%聚丙烯酰胺凝胶板，并在另一侧安装缓冲液坝。用1x SDS电泳缓冲液填充电泳槽内槽，直至液面达到凝胶板顶部。外槽则加入等量缓冲液至半满。
    4. 为通过非连续检测分析切割情况，从“UNCUT”反应开始，将每种反应混合物各5 µL加样至SDS-PAGE凝胶的各个泳道中。在第一或最后一个泳道中加入蛋白质分子量标记物。
    5. 将电泳槽电极连接至电源，以110 V恒压电泳60分钟。使用撬棒插入玻璃板之间，从凝胶板中取出凝胶。将凝胶置于塑料托盘中，加入5–10 mL凝胶染色液并完全浸没凝胶；30分钟内即可观察到条带。1–24小时后去除多余染色液，将凝胶浸入水中，并使用凝胶成像系统拍摄图像。

6. 将底物肽对接至委内瑞拉马脑炎病毒 nsP2 半胱氨酸蛋白酶

  1. 从 PDB（https://www.rcsb.org/）下载 VEEV 半胱氨酸蛋白酶的坐标文件。PDB 编号为 2HWK。将文件保存为 2HWK.pdb。
    1. 使用 MOE（https://www.chemcomp.com/）准备蛋白结构。将蛋白 PDB 文件载入 MOE。在右侧边栏点击 选择 和 溶剂，并删除溶剂。
    2. 从顶部菜单栏的 蛋白 中打开 结构准备 面板。通过点击 校正 自动修正所有结构项，并通过点击 质子化3D 对结构进行质子化。打开 部分电荷 面板，选择 Amber 99 和 根据需要调整氢原子和孤对电子，为蛋白添加部分电荷。最后，将结构文件保存为“2HWK_dock.pdb”。
  2. 使用 MOE 构建底物肽（nsP12、nsP23、nsP34）和 TRIM14 的结构。打开蛋白构建器面板，输入底物序列，将几何构型设为延伸式，然后点击构建。结构将在 MOE 窗口中显示。
    1. 通过点击面板上的 最小化 对肽链结构进行能量最小化。将结构保存为 PDB 文件（图6）。
  3. 使用 PyRx/AutoDock 4.2（http://autodock.scripps.edu/）将底物肽对接至 VEEV-nsP2。打开 PyRx 工具，编辑首选项设置，在配体准备中使所有扭转角失活。载入底物分子，在导航器面板中右键点击分子名称，选择“生成配体”以准备配体对接文件。载入蛋白文件 2HWK_clean.pdb，并选择“生成大分子”以准备 pdbqt 对接文件（图7）。
    1. 在底部的对接面板中启动 AutoDock 向导。选择已准备好的配体和蛋白文件。通过手动调整以催化残基 Cys-477 为中心的网格尺寸来定义蛋白结合口袋。使用默认间距参数 0.375 Å。点击 运行 AutoGrid 生成网格图。
    2. 运行 AutoDock，并选择 拉马克遗传算法（LGA 方法）。点击 对接参数，将 GA 运行次数 设置为 50。其余参数使用默认值。点击 下一步 开始对接计算。
    3. 打开 分析结果 面板。检查所有预测的结合构象。选择具有最低预测结合能且在切割位点处 Cys-477 与底物之间存在合理结合相互作用的最佳模型。将该结合模型保存为 PDB 文件，用于后续的分子动力学模拟。

7. VEEV-底物复合物对接的分子动力学模拟

  1. 使用 Amber（http://ambermd.org/）准备输入文件。按照标准流程，采用 AMBER 软件包和 ff99SB 力场对预测的底物结合模型进行分子动力学（MD）模拟。
    注意：在进行 MD 模拟之前，对溶剂化体系进行彻底的能量最小化。采用周期性边界条件以模拟连续体系。使用粒子网格 Ewald（PME）方法计算长程静电相互作用。模拟体系首先在 100 ps 内从 0 K 逐渐升温至 300 K，随后在 300 K 下平衡 500 ps，最后进行总计 2 ns 的生产阶段模拟。
    1. 在高性能计算平台上运行模拟任务。我们的模拟在 Biowulf 集群（https://hpc.nih.gov/）上完成（图 8）。
    2. 使用 VMD 程序（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）可视化轨迹输出结果。分析底物与 TRIM14 在 nsP2 活性位点内的结合相互作用及构象变化（图 9）。

结果

对寨卡病毒（ZIKV）ns2B/3蛋白酶进行SSHHPS分析，鉴定出4种宿主蛋白靶点：FOXG1、SFRP1、来自视网膜cDNA文库的Gsα亚基，以及NT5M线粒体5',3'-核苷酸酶（图10）6。值得注意的是，其他方法均未预测到这些蛋白可能是ZIKV蛋白酶的靶点。FOXG1基因的突变与一种先天性综合征相关，其特征为发育障碍及小头畸形等脑结构异常。SFRP1是一种分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）；这类可溶性受体可通过竞争性结合Wnt配体，拮抗并抑制Wnt信号通路。Wnt信号通路参与调控黄病毒（Flavivirus）感染期间的干扰素（IFN）反应36。SFRP1的切割预计将增强黄病毒的复制。此外，SFRP1还参与Th17细胞的分化过程37。SSHHPS的序列比对显示，不同物种在切割位点序列上存在特异性差异（图10D）。SFRP1的切割位点序列在人类和鸡中完全相同；而寨卡病毒可在鸡胚中引起死亡和小头畸形38。在啮齿类动物中，高度保守的P1位点（K/R）R↓G被甘氨酸（RGG）取代。免疫功能健全的小鼠品系通常对寨卡病毒感染和疾病具有抗性39。

可以使用酶标仪中的连续检测方法测定病毒多蛋白序列和宿主蛋白序列的稳态动力学参数及抑制常数31,40,41（图11A）。对于定性切割信息，例如特定序列的切割或不同化合物对蛋白酶的抑制作用，可采用非连续检测方法（图11B）。

可能需要优化CFP与YFP之间的残基数。可使用计算机模拟方法构建底物结合模型。图9展示了nsP1/nsP2连接区的一个代表性对接模型。对于VEEV nsP2蛋白酶，已有报道表明其可切割一段12个氨基酸的Semliki Forest Virus（SFV）序列（Km = 0.58 mM）33。将底物序列延长至19、22和25个残基，并降低缓冲液的离子强度，可显著降低Km值。对VEEV nsP2晶体结构及其晶格堆积的分析还显示，其中一个连接区的部分结构以螺旋构象与蛋白酶结构域紧密堆积。因此，较长的VEEV底物可能由于能够识别二级结构模体而实现更有效的结合。

对于TRIM14，我们获得的Km值为21 µM6,33。该底物携带宿主蛋白序列的Km值与含有病毒多聚蛋白切割位点序列的底物Km值相近（Km(V12) = 12 µM，Km(V34) = 21 µM）。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3和nsP3/nsP4连接处的切割位点序列被切割的效率各不相同。在细胞内，这被认为有助于多聚蛋白的依次切割42。

解释阴性结果时应谨慎。若未发生切割，可能是切割位点过短，或纯化的蛋白酶无活性。对于被切割的底物，还需进一步实验以确认全长蛋白的切割情况或在病毒感染细胞中的切割现象。应选择适当的后续实验，也可检测靶蛋白过表达或沉默对病毒复制的影响。

figure-results-1
图1：基因沉默的三种机制。 基因沉默可在DNA、RNA或蛋白质水平上发生。这些“搜索并删除”机制各自利用一个“关键词”来引导对含有该词的文件进行切割。本图改编自Morazzani等人的研究32及其所引文献。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2：不同物种间切割位点序列的特异性差异。 图示为TRIM14同源蛋白C端的PRY/SPRY结构域比对结果。通过灰色高亮的保守基序可识别PRY/SPRY结构域。人源TRIM14被VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶在QEAGA↓G位点切割。SSHHP序列以颜色标示。绿色标记的残基为P1'位残基；蓝色为P4位残基；红色为切割位点基序序列中其他保守残基。马源TRIM14为截短形式，缺失PRY/SPRY结构域。青色高亮的赖氨酸可发生多聚泛素化，对MAVS信号体的组装具有重要作用。C端PRY/SPRY结构域可能在急性病毒感染期间被nsP2蛋白酶短暂切割，从而在细胞内抑制宿主的抗病毒反应。而在马源中，该结构域始终缺失。这提示TRIM14的PRY/SPRY结构域可能在抵抗VEEV感染中发挥保护作用。本图改编自Morazanni等6 请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-3
图3：利用BLAST鉴定SSHHPS序列。 VEEV nsP1/nsP2连接处的切割位点基序序列与宿主蛋白TRIM14中的SSHHP序列比对。绿色标注的残基为P1'残基；蓝色标注的是P4残基；红色标注的是切割位点基序中的其他保守残基。大多数比对结果仅显示在保守切割位点基序区域之外存在同源性，或未包含P1/P1'可切割键的残基。TRIM14显示出连续6个残基的匹配，其中包括P1和P1'残基。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：VEEV nsP2 半胱氨酸蛋白酶底物 CFP-V12-YFP 的蛋白质和DNA序列。 NdeI（CATATG）和 XhoI（CTCGAG）限制性酶切位点以大写字母显示。红色部分为病毒多聚蛋白中位于 nsP1 与 nsP2 之间的切割位点序列。绿色标记的残基为切割位点的 P1' 位残基，蓝色标记的为 P4 位残基。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：Trx-VEEV-nsP2 半胱氨酸蛋白酶构建体的蛋白序列。 硫氧还蛋白（Trx）以黄色显示。凝血酶切割位点和 His标签以青色显示。Cys-His 二联体以红色标注。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：MOE中的肽段结构。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图7：使用 PyRx/AutoDock 进行底物肽的分子对接。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：在Biowulf集群上运行的作业。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图9：含nsP1/nsP2连接处切割位点序列的VEEV P12底物模型。 Cys-477/His-546催化二联体以蓝色显示。该图使用Pymol软件（https://pymol.org）制作。请点击此处查看此图的放大版本。

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图10：寨卡病毒ns2B/ns3蛋白酶的SSHHPS分析。（A）ZIKV ns2B/ns3蛋白酶预测的宿主蛋白靶点。红色残基匹配单一切割位点序列。绿色残基在亚位点处可被耐受，并与其他切割位点的残基相匹配。SFRP1在连续顺序中含有相同残基的数量最多。（B）表达并纯化了含有来自各宿主蛋白（人源）预测SSHHPS序列的CFP-底物-YFP蛋白（约50–60 kDa）。ZIKV蛋白酶切割了人源FOXG1、SFRP1、NT5M以及从视网膜cDNA文库中分离的Gsα亚基。切割产物大小约为28–30 kDa。底物序列信息见Morazzani等6。（C）尽管ns2B/ns3蛋白酶可切割SFRP1，但不能切割其同源蛋白（SFRP2和SFRP4）。（D）不同动物物种间切割位点的比对可能有助于为第四类病毒选择合适的动物模型。请注意，在SFRP1中，人类与啮齿类之间的保守R↓G序列存在差异。图示转载自Morazzani等6 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-11
图11：使用连续和非连续检测方法进行稳态动力学分析。 （A）将表5中所示的动力学数据使用GraFit软件作图。插图为Lineweaver-Burk图。（B）SDS-PAGE凝胶显示CFP-V12-YFP底物的切割产物。泳道1为“未切割”底物（48 kDa）。泳道2为“已切割”底物（31 kDa和27 kDa）。在泳道3-9中加入了不同化合物以测试其抑制活性。泳道4包含共价抑制剂E64d。这些反应在室温下孵育过夜，约17小时。样品需经煮沸处理才能获得清晰的条带模式。在含有酶的反应中可见nsP2蛋白酶条带（56 kDa），而泳道1中未见。泳道1为“无酶”对照。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

由外源序列引导、针对特定序列的蛋白质或核酸的降解，在生物学中仅见于少数情况。图1所示的机制是防御性机制，可保护宿主免受病毒侵害，或保护病毒免受宿主攻击。

利用生物信息学方法，我们可以鉴定出这些系统所破坏的靶标。在对 SSHHP 序列的分析中，我们发现其中许多序列存在于参与启动固有免疫应答所需的关键蛋白中。某些靶标具有明确的功能，例如 MAVS 和 TRIF（含 TIR 结构域的干扰素-β 诱导接头蛋白），而另一些则通过更为复杂的机制与免疫相关（例如组蛋白 H3、SFRP1、FOXG1）8,9。储存在 SSHHP 序列中的靶标信息，有望帮助识别对这些病毒具有抗病毒作用的信号通路。体内的抗病毒应答通常具有病毒特异性26,43。例如，特定亚群的 TRIM 蛋白对不同病毒具有抗病毒效应43,44,45，其中一些是病毒限制因子（例如 HIV 与 TRIM5α）。目前已鉴定出约 70 种 TRIM 蛋白，其特异性仍在深入研究中44,45。SSHHPS 中的信息可能有助于我们理解这些病毒逃逸固有免疫应答的机制。随着更多 SSHHPS 被分析，可能还会发现其他模式和相关性。

在我们的分析中，物种特异性差异显而易见（图2，图10）。已知这些病毒对某些物种的影响大于其他物种。有关宿主范围、宿主易感性以及宿主防御机制的信息可能存在于SSHHPS中。例如，马是马脑炎病毒最易感的物种，但其缺乏人类TRIM14中被VEEV nsP2蛋白酶短暂切割的区域。人类极少因VEEV感染而死亡，但可被感染24。人类TRIM14蛋白携带一个nsP2蛋白酶切割序列6。切割位点的存在提示人类可能具有针对这些病毒的防御机制。鸟类被认为可能是这些病毒的潜在储存宿主46。鸡TRIM14蛋白中的相应SSHHPS序列与人类及其他物种中的序列不同。此类细微差异可能使靶标宿主蛋白无法被切割或更易被切割。Aguirre等人16研究表明，在登革病毒（Dengue virus）感染后，不能被切割的突变型STRING蛋白可诱导更高水平的干扰素（IFN），且小鼠天然携带一种不会被登革病毒ns2B3蛋白酶切割的STING蛋白变体。小鼠STING蛋白也不会被ZIKV蛋白酶切割47。在我们的SSHHPS分析中，当比较人类与啮齿类动物的蛋白时，也观察到ZIKV蛋白酶切割位点序列的差异6（图10D）。在用于研究第IV组病毒的动物模型中，重现宿主蛋白的物种特异性蛋白水解切割可能具有重要意义。抑制宿主蛋白的切割也对开发第IV组病毒蛋白酶抑制剂具有启示意义。在我们之前的研究中，已证明可使用CA074甲酯抑制VEEV nsP2蛋白酶对TRIM14的切割6。该结果提示，这些蛋白酶的小分子抑制剂可能能够调节先天免疫应答，从而有效抑制病毒感染6,31。

同一物种内的遗传变异也可能导致蛋白水解切割的差异。密码子使用的细微差异可能影响核糖体的暂停48。由于某些IV组病毒蛋白酶嵌在内质网膜中，如果切割过程是共翻译发生的，则这些暂停的差异可能影响对底物的切割。我们鉴定出的部分切割位点位于预测的信号肽序列中（例如 SFRP1），而其他位点则位于内部。

SSHHPS 分析可产生与其他宿主蛋白分析方法不同的信息。SSHHPS 分析成本低廉且易于实施。利用细菌表达系统，可在无需哺乳动物细胞培养的情况下测试哺乳动物序列的短片段（约 25 个氨基酸）。我们发现，CFP-YFP 底物能够耐受所有测试的人源蛋白序列；然而，表达产量存在差异。在类似实验中，包含长达 63 个氨基酸的人源蛋白序列的底物已成功表达、纯化，并用于动力学分析和抑制剂筛选49,50,51。由于非连续性检测仅需少量底物，因此可同时探索大量靶标。该系统的一个优势在于，CFP/YFP 底物既可用于 SDS-PAGE 分析，也可用于更复杂的动力学分析（如 IC50、Ki、Km、Vmax）。在药物发现中，抑制性化合物可能在荧光检测中产生假象。因此，结合非连续性检测与连续性检测可确认底物的切割或抑制切割效应。非连续性 SDS-PAGE 检测的样品可直接从 96 孔板中取出。CFP/YFP 底物已用于化合物文库筛选52。然而，仍需进一步分析以确定底物是否适用于高通量筛选，例如计算 Z 因子53。

设计底物时的一个挑战是确定蛋白酶结合并识别的剪切键周围区域。在本示例中，我们从以剪切键为中心的12个残基序列开始。通过分析切割位点的序列比对发现，VEEV蛋白酶对剪切键N端的残基具有同源性，而ZIKV蛋白酶则对若干C端残基具有同源性。可通过底物对接的计算机模拟模型来设计定点突变实验，以探究底物的结合位点。由于底物和酶的序列均位于质粒上，因此可对其中任意一个进行突变，以验证计算机模拟模型或各个亚位点的耐受性。当无法获得结合态底物的晶体结构时，该方法具有明显优势。

SSHHPS 分析还可能提供有关病毒酶产生病毒诱导表型机制的新信息。寨卡病毒（ZIKV）的一个靶点 SFRP1 是 Wnt 信号通路的一部分，在大脑和眼睛发育以及免疫应答中均发挥作用36,37,54,55,56,57。我们发现，其他可被 ZIKV ns2B/ns3 蛋白酶切割的蛋白质序列也存在于参与大脑和眼睛发育的蛋白质中；这两种器官的异常在先天性寨卡综合征中已被观察到，并被认为是病毒诱导表型的一部分58。

宿主与病原体相互作用的可预测性可被用于多种应用：靶向特异性的溶瘤病毒疗法；降低减毒活病毒疫苗的风险；优化、预测或筛选动物模型；预测宿主范围或易感性；预测人畜共患病事件；以及预测宿主防御机制。由于所描述的方法基于序列分析，未来可能具有整合到软件中的价值。

披露

此处表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国海军、美国陆军、美国国防部或美国政府的立场。

致谢

本工作由美国国防威胁降低局（DTRA）项目编号 CB-SEED-SEED09-2-0061 和 CBCall4-CBM-05-2-0019 资助，部分由美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（NCATS, NIH）的院内/院外研究计划（XH）以及美国海军研究实验室基本经费资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
250 mL 锥形瓶VWR89000-362
2-巯基乙醇Acros Organics (Fisher)125472500危险：急性毒性。请在通风橱中打开瓶盖，避免吸入蒸气。
4 L Pyrex 广口带螺口盖量筒式锥形瓶Millipore SigmaCLS49954L-1EA
AKTA Prime PlusGE Healthcare17-0729-01
AKTA XK 16/20 层析柱GE Healthcare28988937
Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元Millipore SigmaUFC501096
Amicon Ultra-15 离心过滤单元Millipore SigmaUFC901096
Amicon Ultra-4 离心过滤单元Millipore SigmaUFC801024
氨苄青霉素SigmaA0166危险：可能引起过敏反应（皮肤或呼吸系统）。
Chelating Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0575-02树脂经 0.2 M 硫酸镍平衡后，文中称为镍柱。用水洗涤后柱子呈绿色，用缓冲液平衡后呈蓝色。
氯霉素RPIC61000危险：可能致癌。
Corning 50 mL 离心管Corning430828建议：聚丙烯管在超声处理时比聚乙烯管更不易破裂
Corning 96 孔半面积微孔板，非结合表面Corning3993
透析袋夹Fisher ScientificPI68011
一次性 PD-10 脱盐柱GE Healthcare17-0851-01
DNaseSigmaDN25-1G
DTT（DL-二硫苏糖醇）RPID11000-50.0警告：急性经口毒性；对皮肤和眼睛有刺激性
EDTAFisher ScientificS311-500
Fisherbrand 带透明盖培养皿Fisher ScientificFB0875712
甘油Acros Organics (Fisher)15892-0010
HEPESMillipore SigmaH4034-1KG
咪唑Acros Organics301870010危险：有毒，具刺激性
IPTG（异丙基 β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）Calbiochem (Millipore Sigma)420291避免吸入粉尘。避免接触眼睛和皮肤。
Laemmli 上样缓冲液BIO-RAD1610737
LB 琼脂Fluka (Millipore Sigma)L3027-1KG建议：液体中放入磁力搅拌子一同高压灭菌，并在冷却过程中持续搅拌。待瓶壁温度降至手可无痛握住30秒时，再加入抗生素。
LB 培养基Fisher BioreagentsBP1426-2
溶菌酶SigmaL4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽BIO-RAD
Nalgene Oak Ridge 高速聚丙烯离心管Nalgene (Thermo Scientific)3119-0050
NanodropThermo Fisher
New Brunswick Innova 42R 摇床培养箱EppendorfM1335
六水合硫酸镍（晶体/ACS认证），Fisher ChemicalFisher ScientificN73-500危险：吞咽或吸入有害，对皮肤和眼睛有刺激性
One Shot BL21(DE3) 化学感受态 E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C600003吸入或吞咽可能有害。对敏感人群可能引起皮肤和眼睛刺激。
One Shot BL21(DE3) pLysS 化学感受态 E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C606003吸入或吞咽可能有害。对敏感人群可能引起皮肤和眼睛刺激。
pet15b 质粒 DNANovagen (Millipore Sigma)69661商业DNA合成由 GenScript Inc. 完成。pet15b 质粒用于 CFP/YFP 底物的构建。
pet32bNovagen (Millipore Sigma)69016-3pet32b 质粒用于半胱氨酸蛋白酶的构建。
Pierce 蛋白酶抑制剂小片剂，不含EDTAThermo FisherA32955警告：皮肤腐蚀/刺激；眼睛损伤
酶标仪Molecular DevicesModel M5
Precision Plus Protein All Blue 预染蛋白标准品BIO-RAD161-0373
蛋白提取试剂Novagen (Millipore Sigma)70584-4可使用 BugBuster 或 Bper（目录号 #78248，ThermoFisher）
Q-Sepharose Fast FlowG.E. Healthcare17-0510-01阴离子交换树脂
RunBlue（12%）17孔预制聚丙烯酰胺凝胶ExpedeonBCG01227可使用任何12%的预制聚丙烯酰胺凝胶
RunBlue 20x SDS 电泳缓冲液ExpedeonNXB50500取50 mL加去离子水稀释至1000 mL，得到1x工作液
RunBlue 即用型蓝色凝胶染色液ExpedeonISB1L无需稀释，按说明使用
氯化钠Fisher ChemicalS271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 超声破碎仪Branson Ultrasonics (VWR)Model No. 101-063-346R超声仪使用档位为5
Spectra/Por 6-8 kD 截留分子量透析袋Spectrum Labs132645T透析袋
SP-Sepharose Fast FlowG.E. Healthcare17-0729-01阳离子交换树脂
牛血浆凝血酶SigmaT6634-500UN
Tris 碱Fisher ScientificBP152-500注意：对眼睛/皮肤有刺激性

参考文献

  1. Liu, H., et al. Widespread Horizontal Gene Transfer from Double-Stranded RNA Viruses to Eukaryotic Nuclear Genomes. Journal of Virology. 84 (22), 11876-11887 (2010).
  2. Hagai, T., Azia, A., Babu, M. M., Andino, R. Use of host-like peptide motifs in viral proteins is a prevalent strategy in host-virus interactions. Cell Reports. 7 (5), 1729-1739 (2014).
  3. Gorbalenya, A. E. Host-related sequences in RNA viral genomes. Seminars in Virology. 3, 359-371 (1992).
  4. Shmakov, S. A., et al. The CRISPR Spacer Space Is Dominated by Sequences from Species-Specific Mobilomes. MBio. 8 (5), 1-18 (2017).
  5. Legler, P. M., Morazzani, E., Glass, P. J., Compton, J. R. Proteome Editing System and A Biomarker of Veev Infection. United States patent application. , (2018).
  6. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  7. Alvarez, E., Castello, A., Menendez-Arias, L., Carrasco, L. HIV protease cleaves poly(A)-binding protein. Biochemical Journal. 396 (2), 219-226 (2006).
  8. Falk, M. M., et al. Foot-and-mouth disease virus protease 3C induces specific proteolytic cleavage of host cell histone H3. Journal of Virology. 64 (2), 748-756 (1990).
  9. Grigera, P. R., Tisminetzky, S. G. Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus. Virology. 136 (1), 10-19 (1984).
  10. Li, W., Ross-Smith, N., Proud, C. G., Belsham, G. J. Cleavage of translation initiation factor 4AI (eIF4AI) but not eIF4AII by foot-and-mouth disease virus 3C protease: identification of the eIF4AI cleavage site. FEBS Letters. 507 (1), 1-5 (2001).
  11. Kuyumcu-Martinez, M., et al. Calicivirus 3C-like proteinase inhibits cellular translation by cleavage of poly(A)-binding protein. Journal of Virology. 78 (15), 8172-8182 (2004).
  12. Pietila, M. K., Hellstrom, K., Ahola, T. Alphavirus polymerase and RNA replication. Virus Research. 234, 44-57 (2017).
  13. Hardy, W. R., Strauss, J. H. Processing the nonstructural polyproteins of sindbis virus: nonstructural proteinase is in the C-terminal half of nsP2 and functions both in cis and in trans. Journal of Virology. 63 (11), 4653-4664 (1989).
  14. Strauss, E. G., De Groot, R. J., Levinson, R., Strauss, J. H. Identification of the active site residues in the nsP2 proteinase of Sindbis virus. Virology. 191 (2), 932-940 (1992).
  15. Wang, D., et al. Foot-and-mouth disease virus 3C protease cleaves NEMO to impair innate immune signaling. Journal of Virology. 86 (17), 9311-9322 (2012).
  16. Aguirre, S., et al. DENV inhibits type I IFN production in infected cells by cleaving human STING. PLoS Pathogens. 8 (10), e1002934(2012).
  17. Barral, P. M., Sarkar, D., Fisher, P. B., Racaniello, V. R. RIG-I is cleaved during picornavirus infection. Virology. 391 (2), 171-176 (2009).
  18. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & Development. 15 (2), 188-200 (2001).
  19. Deveau, H., Garneau, J. E., Moineau, S. CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions. Annual Review of Microbiology. 64, 475-493 (2010).
  20. Schechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases I. Papain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 27 (2), 157-162 (1967).
  21. Bieniasz, P. D. Intrinsic immunity: a front-line defense against viral attack. Nature Immunology. 5 (11), 1109-1115 (2004).
  22. Zhou, Z., et al. TRIM14 is a mitochondrial adaptor that facilitates retinoic acid-inducible gene-I-like receptor-mediated innate immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 111 (2), E245-E254 (2014).
  23. Wang, S., et al. TRIM14 inhibits hepatitis C virus infection by SPRY domain-dependent targeted degradation of the viral NS5A protein. Scientific Reports. 6, 32336(2016).
  24. Zacks, M. A., Paessler, S. Encephalitic alphaviruses. Veterinary Microbiology. 140 (3-4), 281-286 (2010).
  25. Hollidge, B. S., Weiss, S. R., Soldan, S. S. The role of interferon antagonist, non-structural proteins in the pathogenesis and emergence of arboviruses. Viruses. 3 (6), 629-658 (2011).
  26. Carthagena, L., et al. Human TRIM gene expression in response to interferons. PLoS One. 4 (3), e4894(2009).
  27. Montgomery, S. A., Johnston, R. E. Nuclear import and export of Venezuelan equine encephalitis virus nonstructural protein 2. Journal of Virology. 81 (19), 10268-10279 (2007).
  28. Nenasheva, V. V., et al. Enhanced expression of trim14 gene suppressed Sindbis virus reproduction and modulated the transcription of a large number of genes of innate immunity. Immunologic Research. 62 (3), 255-262 (2015).
  29. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  30. Li, M. Z., Elledge, S. J. SLIC: a method for sequence- and ligation-independent cloning. Methods in Molecular Biology. 852, 51-59 (2012).
  31. Hu, X., et al. Kinetic, Mutational, and Structural Studies of the Venezuelan Equine Encephalitis Virus Nonstructural Protein 2 Cysteine Protease. Biochemistry. 55 (21), 3007-3019 (2016).
  32. Morazzani, E. M., et al. Proteolytic cleavage of host proteins by the Group IV viral proteases of Venezuelan equine encephalitis virus and Zika virus. Antiviral Research. 164, 106-122 (2019).
  33. Zhang, D., Tozser, J., Waugh, D. S. Molecular cloning, overproduction, purification and biochemical characterization of the p39 nsp2 protease domains encoded by three alphaviruses. Protein Expression and Purification. 64 (1), 89-97 (2009).
  34. Lei, J., et al. Crystal structure of Zika virus NS2B-NS3 protease in complex with a boronate inhibitor. Science. 353 (6298), 503-505 (2016).
  35. Shiryaev, S. A., et al. Characterization of the Zika virus two-component NS2B-NS3 protease and structure-assisted identification of allosteric small-molecule antagonists. Antiviral Research. 143, 218-229 (2017).
  36. Smith, J. L., Jeng, S., McWeeney, S. K., Hirsch, A. J. A MicroRNA Screen Identifies the Wnt Signaling Pathway as a Regulator of the Interferon Response during Flavivirus Infection. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  37. Lee, Y. S., et al. The Wnt inhibitor secreted Frizzled-Related Protein 1 (sFRP1) promotes human Th17 differentiation. European Journal of Immunology. 42 (10), 2564-2573 (2012).
  38. Goodfellow, F. T., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells and Development. 25 (22), 1691-1697 (2016).
  39. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), (2017).
  40. Morazzani, E. M., et al. Books of Abstracts, 254th American Chemical Society National Meeting. , Washington, D.C. (2017).
  41. Compton, J. R., Mickey, M. J., Hu, X., Marugan, J. J., Legler, P. M. Mutation of Asn-475 in the Venezuelan Equine Encephalitis Virus nsP2 Cysteine Protease Leads to a Self-Inhibited State. Biochemistry. 56 (47), 6221-6230 (2017).
  42. Vasiljeva, L., et al. Regulation of the sequential processing of Semliki Forest virus replicase polyprotein. Journal of Biological Chemistry. 278 (43), 41636-41645 (2003).
  43. Uchil, P. D., Quinlan, B. D., Chan, W. T., Luna, J. M., Mothes, W. TRIM E3 ligases interfere with early and late stages of the retroviral life cycle. PLoS Pathogens. 4 (2), e16(2008).
  44. Ozato, K., Shin, D. M., Chang, T. H., Morse, H. C. 3rd TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity. Nature Reviews Immunology. 8 (11), 849-860 (2008).
  45. van Tol, S., Hage, A., Giraldo, M. I., Bharaj, P., Rajsbaum, R. The TRIMendous Role of TRIMs in Virus-Host Interactions. Vaccines (Basel). 5 (3), (2017).
  46. Molaei, G., et al. Dynamics of Vector-Host Interactions in Avian Communities in Four Eastern Equine Encephalitis Virus Foci in the Northeastern U.S. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (1), e0004347(2016).
  47. Ding, Q., et al. Species-specific disruption of STING-dependent antiviral cellular defenses by the Zika virus NS2B3 protease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 115 (27), E6310-E6318 (2018).
  48. Angov, E., Legler, P. M., Mease, R. M. Adjustment of codon usage frequencies by codon harmonization improves protein expression and folding. Methods in Molecular Biology. 705, 1-13 (2011).
  49. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Analytical Biochemistry. 411 (2), 200-209 (2011).
  50. Hu, X., et al. Structural insight into exosite binding and discovery of novel exosite inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A through in silico screening. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (7), 765-778 (2014).
  51. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (21), 7687-7697 (2012).
  52. Nguyen, T. G., et al. Development of fluorescent substrates and assays for the key autophagy-related cysteine protease enzyme ATG4B. Assay and Drug Development Technologies. 12 (3), 176-189 (2014).
  53. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  54. Bovolenta, P., Esteve, P., Ruiz, J. M., Cisneros, E., Lopez-Rios, J. Beyond Wnt inhibition: new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease. Journal of Cell Science. 121 (Pt 6), 737-746 (2008).
  55. Esteve, P., et al. SFRPs act as negative modulators of ADAM10 to regulate retinal neurogenesis. Nature Neuroscience. 14 (5), 562-569 (2011).
  56. Garcia-Hoyos, M., et al. Evaluation of SFRP1 as a candidate for human retinal dystrophies. Molecular Vision. 10, 426-431 (2004).
  57. Marcos, S., et al. Secreted frizzled related proteins modulate pathfinding and fasciculation of mouse retina ganglion cell axons by direct and indirect mechanisms. Journal of Neuroscience. 35 (11), 4729-4740 (2015).
  58. Moore, C. A., et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatrics. 171 (3), 288-295 (2017).

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