在Vitro重建空间细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans胚胎冲击器和粘性聚苯乙烯珠

在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如，分轴）由各种化学和物理线索指定。理解单个细胞如何解释这些信息，以及它们如何将多细胞组装作为一个紧急属性进行调节，是形态发生研究的最终目标之一。模型有机体C.elegans对细胞级形态形成调节的理解有显著贡献，如细胞极^性1、细胞分裂^模式1、细胞命运^决定2、组织尺度调节，如神经元接^线3和器官^{发生4、5。}虽然有各种各样的遗传工具可用，组织工程方法是有限的。

在C.elegans研究中最成功的组织工程方法是经典的胚乳^分离6;由于C.elegans胚胎被蛋壳和渗透^屏障7包围，其去除是这种方法的主要程序之一。虽然这种爆破器隔离方法能够以简化的方式重组细胞-细胞接触，但它不允许消除不需要的线索;细胞接触仍然构成机械（例如，附着力）和化学线索，从而限制了我们完全分析线索和细胞行为之间的因果关系的能力。

本文介绍的方法使用Carboxylate改性聚苯乙烯珠子，该珠子可以共价地与包括蛋白质在内的任何胺反应分子结合为配体。特别是，我们使用一种抗胺反应形式的罗达明红-X作为配体，使珠子既可目视跟踪，又粘附在细胞上。配体分子的珠表面和原胺组的甲苯基组由水溶性甲酰胺1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）卡博迪米（EDAC）8、9结合。获得粘合珠子允许机械提示对细胞^动力学10的影响。我们已经使用这种技术来识别细胞分裂^方向10所需的机械线索。

1. 胶粘剂聚苯乙烯珠子的制备

注:此协议不需要无菌技术。

1. 在1.5 mL微离心管中称量10mg的Carboxylate改性聚苯乙烯珠子。
2. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的2-（N-变形）甲酸（MES）缓冲液。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐，可降低卡博迪米德的活性，适合用于蛋白质耦合反应。涡旋管混合珠子。
3. 通过台式离心机在 2，000 x g下旋转管子 60 s。
4. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
5. 按照步骤 1.2-1.4 再次用 1 mL 的 MES 缓冲液清洗珠子。
6. 将含有10毫克EDAC的MES缓冲液加入管中，以激活表面的Carboxyl基组。涡旋管混合珠子。
7. 在室温下旋转和孵育管15分钟。
8. 在 2，000 x g下旋转珠子 60 s。
9. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
10. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。涡旋管混合珠子。
11. 在 2，000 x g下旋转管 60 s。
12. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
13. 按照步骤 1.10-1.12 再次用 1 mL 的 PBS 清洗珠子。
14. 使用的罗达明的最终浓度将取决于被成像的菌株。从 0.65 mM 罗达明红X-X库存溶液中制备 1 mL 的 1、10、100 和 1000 倍稀释系列罗达明红-X。
15. 将20μL的珠子移入每个连续稀释管中。
16. 在室温下旋转和孵育管5分钟。
17. 通过重复步骤 1.10-1.12，用 1 mL 的 PBS 清洗珠子两次。
18. 将 1 mL 的 PBS 添加到管中，并将其储存在 4°C 下长达 6 周。在用于实时成像的显微镜下检查珠子的荧光强度。罗达明红-X琥珀基酯的适当浓度取决于成像条件（图1）。
    注:没有罗达明红X治疗的珠子不粘附在细胞上。罗丹胺红-X用作荧光标记和粘合剂分子。带正电荷的罗达明红-X和带负电荷的等离子膜之间的静电相互作用是粘附的一个假定原因。

2. 口腔移液器的组装

1. 切割宽（6.35毫米内径）和窄（3.175毫米内径）泰贡管，分别约25厘米和40厘米长（图2）。
2. 用聚四氟乙烯 （PTFE） 过滤器（0.2 μm 孔径）连接 Tygon 管（图 2）。
3. 拆解市售的吸气管，并将其毛细管支架和喉舌分别连接到窄管和宽的Tygon管的末端（图2）。
   注:PTFE过滤器用于防止通过口腔移液器吸入次氯酸盐溶液的烟雾。

3. 胚胎胚芽的分离

注意:戴上手套和实验室外套，避免切割和接触漂白溶液。

1. 用右手和左手握住微毛细管的每一端（容量;10 μL）。
2. 将微毛细管拉向两端以施加张力，并将毛细管的中心位于燃烧器上，使两个手拉毛细血管（图3A）。
3. 在解剖显微镜下用钳子修剪手拉毛细血管的尖端，并将拉毛细管连接到口腔移液装置中（图2）。准备两种类型的移液器。移液器的尖端开口尺寸应约为胚胎移植和蛋壳切除的C.elegans胚胎（30μm）的短轴长度的2倍和1倍，分别图3B-D。
4. 将蛋盐溶液45μL移液到多井滑井上（图4A;底部）。
5. 将5-10只成年C.elegans放入含有蛋盐溶液的井中。
6. 为了获得早期的C.elegans胚胎，通过将两根针插在C.elegans身体的左右，并相互滑动针头，将成人切成碎片（图4A;上部示意图）。
7. 将45μL的次氯酸盐溶液移液到含有蛋盐溶液的井旁的井上（图4B）。
8. 雪尔顿生长介质的移液器45 μL，在含有次氯酸盐溶液的井旁的随后三口井上（图4B）。
9. 将1细胞阶段和早期2细胞阶段胚胎通过口移移进入次氯酸盐溶液中，用手绘毛细管进行胚胎移植（图4B）。
10. 等待 40-55 s。
11. 通过将次氯酸盐溶液中的胚胎从次氯酸盐溶液移植到谢尔顿的生长培养基，用手绘毛细管移液进行胚胎移植，洗净胚胎（图4B）。
12. 再次清洗胚胎，通过将胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用手绘毛细管移液进行胚胎移植（图4B）。
13. 通过用手绘毛细管进行口移，将洗涤的胚胎移植到谢尔顿生长培养基的新井中，用于胚胎移植。使用手绘毛细管去除蛋壳，仔细重复移液（图4C;中间示意图）。如果成功取出蛋壳，胚胎细胞将变得更球形（图4C;右图）。
14. 通过用手绘毛细管轻轻连续移液分离2细胞阶段胚胎胚泡（图4D）。

4. 用爆波米尔和珠子重新构成接触模式

注:在成像显微镜下工作，以避免细胞与珠子分离，并便于及时采集图像。

1. 要使用倒置显微镜进行观察，请准备如图5所示的成像室。
   1. 将盖玻片放在盖玻座上 （图 5A）。
   2. 用胶带盖住盖玻片的边缘以稳定它。带胶带的一侧是"背面"（图5A，B）。
   3. 将盖玻片支架翻转到"正面"侧，用疏水笔在盖玻上画一个圆圈（图5C）。
      注:任何玻璃底盘也有效，前提是胚胎可由口腔移液器操作。
2. 在疏水标记绘制的圆内添加谢尔顿的生长介质（图5D）。
3. 将隔离的爆破仪转移到成像室。
4. 使用手绘毛细管分配少量化学功能化珠子进行胚胎移植。
5. 通过吹入手绘毛细管来控制聚苯乙烯珠子的位置，直到珠子附着在隔离的胚泡上。
6. 安装盖玻片以避免介质蒸发 （图 5E）。执行实时成像。

5. 制备重要试剂

1. 蛋盐溶液（10 mL）:将235 μL的5M纳C和240 μL的2M KCl与9525 μL的dH₂O结合。
2. 次氯酸盐溶液（10 mL）:将7.5 mL Clorox（含约7.5%次氯酸钠）与2.5 mL的10 N NaOH（次氯酸钠的最终浓度约为5.625%）结合。
   注:虽然许多已发表的方法都使用齐齐酸酶来消化蛋壳，但我们采用了一种使用次氯酸盐^溶液11的方法。通过避免成批变化的齐平酶活动，我们相信这种方法是更具可重复性和成本效益的方法。
3. 0.81 mM Inulin 溶液 （40 mL）
   1. 将 0.2 克硫林添加到 40 mL 的 dH₂O。
   2. 高压灭菌溶解。
      注:在4°C下保持1个月。
4. 0.5 M MES 缓冲器 （500 mL）
   1. 将 48.81 克 MES 溶解在 400 mL 蒸馏水中（dH₂O）。
   2. 将 pH 调整到 6.0。
   3. 使用 dH₂O，使总体积达到 500 mL。
5. PBS 解决方案 （1 L）
   1. 要制造 10 倍 PBS 溶液，将 1 包 PBS 预混合粉末溶解在 1 L 的 dH₂O 中。
   2. 将 100 mL 的 10 倍 PBS 解决方案与 900 mL 的 dH₂O 相结合。
6. 5% 聚苯丙酮 （PVP） 溶液 （4 mL）
   1. 在无菌条件下，在4 mL的果蝇施耐德介质中溶解0.2克PVP。
      注:始终打开施耐德在组织培养 （TC） 罩中的中等库存。在4°C下保持1个月。
7. 0.65 mM 罗达明红X库存溶液 （2 mL）
   1. 重量 1 毫克罗达明红-X。
   2. 加入2 mL二甲基亚硫酸盐（DMSO）溶解。
   3. 在-20°C下，以-20°C的分量和储存。
8. 谢尔顿的生长介质 （SGM） （10.25 mL）
   1. 在无菌条件下，将8 mL的果蝇施耐德中度、1 mL的PVP溶液、1mL的Inul溶液、1mL的巴司中鹰（BME）维生素、50μL的青霉素-链霉素和100μL的脂蛋白浓缩物混合在一起。
   2. SGM 的等分 325 μL 放入 1.5 mL 微管中。
      注:在4°C下保持约1个月。
   3. 在胚膜分离当天，向SGM中加入175 μL的胎儿牛血清（FBS）（总体积为500μL）。
      注:将 FBS 储存在 -20°C，并在使用前解冻。FBS 不需要被热杀死。

对于珠子制备，我们确定了表达GFP-肌苷II和mCherry-组蛋白的转基因菌株的红-X琥珀酯的最佳量（图1A-D）。我们使用 mCherry 标记组蛋白作为细胞周期进展的标记。由于罗达明红X-X和mCherry将由561nm激光照明，因此罗达明红X-X信号的最佳强度与组蛋白相当，可以同时成像细胞和珠子。例如，使用 0.005 μg/mL Rhodamine 红-X 琥珀酯处理的珠子的荧光信号太弱，无法可视化珠（图 1A）。另一方面，用5μg/mL罗达明红-X琥珀酯处理的珠子发出的荧光信号太强，无法成像mCherry-组蛋白（图1D）。我们确定0.5 μg/mL罗达明红-X琥珀基酯是这种特殊转基因菌株的最佳选择（图1C）。

布拉斯托米尔隔离是按照图4所示的过程进行的。对于成功的实验，应解决以下几点。1） 井中的介质随着时间的推移蒸发并变得粘稠;这导致胚胎粘在玻璃毛细管和其他胚胎，所以需要使用新的孔与新的介质。2） 在次氯酸盐溶液中，胚胎浮到表面。因此，降低显微镜的放大倍率，并聚焦于水滴表面，以简化胚胎的转移。3） 次氯酸盐溶液的有效性可能有所不同。因此，应针对每批新批次氯酸盐溶液测试胚胎在次氯酸盐溶液中的持续时间。4） 将口腔移液器尽可能靠近胚胎，以尽量减少吹入移液器所用的强度，但也不会太近，以便胚胎也被吸起（连接珠子时也是如此）。5） 卵壳切除后，胚胎变得非常脆弱。因此，施加在口腔移液器上的力需要稍微降低，以防止胚胎破裂。6） 长时间使用口腔移液器可能会抑制PTFE过滤器，7）2细胞阶段胚胎只有在细胞核已清晰形成时才能分离（图4C，左原理图）。与完整胚胎中的细胞（图4A;右）相比，没有蛋壳的胚胎中的细胞看起来更圆（图4C;右图）。此外，在爆炸粒隔离后，爆粒的形状变成球形（图4D;右图）。

为了测试物理接触相关提示对细胞分裂方向的影响，我们将罗达明红X涂层珠子附在从2细胞阶段分离的AB胚膜上，并进行实时成像（图6，图7）。没有罗丹胺红X处理的珠子没有粘附在胚泡上，这表明罗丹胺红X作为荧光标记和粘合剂分子。在分析细胞分割方向时，利用ImageJ12的"3D项目"功能（图6A;围绕Y轴倾斜）对延时图像进行了3D重构。为了确定包含线轴（主轴平面）的平面，我们首先确定了两个中心体垂直对齐的平面（图 6B;110°）:此平面的 ±90° 角的平面为主轴平面（图 6B;-20°）。接下来，我们测量了细胞因子化后与细胞珠接触界面（接触方向）相对的主轴（主轴方向）的角度（图6C）。当两个子单元都连接到珠子时，一条经过两个接触点的线被用作接触方向。

在以前的研究中，我们已经确定了在珠诱导AB细胞分裂方向10期间各向异性细胞表面肌苷流动。然而，当细胞在定向分裂期间移动时，很难测量细胞内肌苷流。为此，我们首先选择了主轴与成像平面（xy 平面）对齐的样本（图 7）。其次，使用最大投影方法（图7）投影Z堆栈。第三，使用子像素配准算法Stack reg插件13的 ImageJ 和刚体选项（图 7B） 纠正了细胞运动。通过图像的配准，细胞的位置是稳定的（图7B）。最后，通过使用ImageJ的手动跟踪插件，跟踪肌苷病（图7C）。根据坐标信息，在细胞因子发生后50秒内计算了沿分割轴和垂直于它的轴的肌苷的速度。

图1:确定红-X浓度。（A-D）表达GFP-肌苷（绿色）和mCherry-组蛋白（品红色）的胚胎被放置在与不同浓度的罗丹红X-X（洋红色）结合的珠子附近。mCherry 和 Rhodamine Red-X 的信号强度沿白色虚线（下图）绘制。使用 0.5 μg/mL 罗达明红-X治疗的珠子和组蛋白信号被清楚地检测到。比例尺显示10μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:口腔移液器的组装。嘴移液器通过连接窄 （1） 和宽 （2） Tygon 管与 PTFE 过滤器 （3） 进行组装。在窄宽的Tygon管的末端，分别连接毛细管支架（4）和嘴片（5）。手绘玻璃毛细管 （6） 可插入毛细管支架中。刻度条是50毫米。请点击这里查看这个数字的较大版本。

图3:布拉斯托米尔隔离。（A） 手拉玻璃毛细管.（B） 用于胚胎移植的手绘玻璃毛细管。（C） 用于去除蛋壳的手工绘制的玻璃毛细管。（D） 显示适当尺寸的毛细管开口的示意图，用于去除蛋壳。箭头表示胚胎。比例尺显示100μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:布拉斯托米尔隔离工作流。（A） 在蛋盐缓冲液中解剖成年的C. elegan获得胚胎。照片显示2细胞和4细胞阶段胚胎在卵壳切除之前。（B） 次氯酸盐治疗和洗涤。（C） 架构描绘了切蛋壳去除的适当时机.照片显示蛋壳切除后有一个4细胞阶段胚胎。（D） 布拉斯托米尔分离.照片显示一个分离的2细胞阶段胚胎。C 和 D 中箭头的大小表示移液过程中所需的相对力。比例尺显示50μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:成像室的装配。（A） 将盖玻片连接到盖玻座。（B） 盖玻片支架的图像。装配前后的盖玻座分别指示在左侧和右侧。（C） 用疏水笔绘制的圆圈.（D） 在圈内添加谢尔顿的生长介质和样本。（E） 安装盖玻片以避免蒸发。比例尺显示50毫米。请点击这里查看此图的较大版本。

图6:细胞分割方向分析。（A） 细胞分裂方向分析图.（B） 主轴平面的确定。左侧图像显示示例示例。3D 重建的 4D 影片围绕 Y 轴旋转，以确定两个中心体垂直对齐的平面（右图;右上图图）。在此示例中，主轴平面为 110° 的 ± 90°（中间图像;右下原理图）。（C） 相对于细胞珠接触的主轴方向的测量。使用主轴平面的图像，根据连接两个中心体（右侧原理图中的橙色虚线）和细胞接触（蓝色虚线）的线之间的角度确定细胞因子后的主轴方向。当两个子细胞都连接到珠子时，细胞珠接触方向是穿过两个接触点的线。绿色是肌苷和中心体，品红色是组蛋白和珠子。刻度条为 10 μm，时间是分钟和秒。请点击此处查看此图的较大版本。

图7:肌苷流分析。（A） 肌苷流分析图.（B） 单元格分裂方向的校正。为了量化细胞内肌苷流动动力学，使用ImageJ插件堆栈reg（刚体选项）修正了分细胞的旋转。上部和底部图像是堆栈 reg 处理前后的。右侧大多数图像显示时间序列的时间颜色代码。（C） 肌苷病灶的跟踪.使用 Stack reg 处理的图像，ImageJ手动跟踪插件跟踪了单个肌苷活动。分割轴和垂直于它的轴分别定义为 x 和 y（右原理图）。根据坐标信息测量了x轴和y轴（Vx和Vy）中的肌苷流速。刻度条为 10 μm，时间是分钟和秒。请点击此处查看此图的较大版本。

提交人声明没有利益冲突。