在Vitro重建空间细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans胚胎冲击器和粘性聚苯乙烯珠

摘要

多细胞系统的组织复杂性混淆了细胞外线索与单个细胞行为之间的因果关系的识别。在这里，我们提出了一种方法，研究接触依赖线索和分裂轴之间的直接联系使用C.elegans胚胎胚芽和粘合聚苯乙烯珠子。

摘要

在多细胞系统中，单个细胞被来自邻近细胞和环境的各种物理和化学线索所包围。这种组织的复杂性混淆了外在线索和细胞动力学之间的因果关系的识别。合成重组的多细胞系统克服了这个问题，使研究人员能够测试特定的线索，同时消除其他线索。在这里，我们提出了一种方法，以重组细胞接触模式与孤立的Caenorhabditis elegans爆炸和粘胶聚苯乙烯珠。这些程序包括蛋壳去除、通过破坏细胞粘附性进行胚分裂、制备粘胶聚苯乙烯珠子以及重组细胞-细胞或细胞珠接触。最后，本文介绍了该方法在胚胎发育中研究细胞分裂轴的定位，有助于调节发育胚胎中的空间细胞模式和细胞命运规范。这种健壮、可重复和多功能的体外方法有助于研究空间细胞接触模式与细胞反应之间的直接关系。

引言

在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如，分轴）由各种化学和物理线索指定。理解单个细胞如何解释这些信息，以及它们如何将多细胞组装作为一个紧急属性进行调节，是形态发生研究的最终目标之一。模型有机体C.elegans对细胞级形态形成调节的理解有显著贡献，如细胞极^性1、细胞分裂^模式1、细胞命运^决定2、组织尺度调节，如神经元接^线3和器官^{发生4、5。}虽然有各种各样的遗传工具可用，组织工程方法是有限的。

在C.elegans研究中最成功的组织工程方法是经典的胚乳^分离6;由于C.elegans胚胎被蛋壳和渗透^屏障7包围，其去除是这种方法的主要程序之一。虽然这种爆破器隔离方法能够以简化的方式重组细胞-细胞接触，但它不允许消除不需要的线索;细胞接触仍然构成机械（例如，附着力）和化学线索，从而限制了我们完全分析线索和细胞行为之间的因果关系的能力。

本文介绍的方法使用Carboxylat....

方案

1. 胶粘剂聚苯乙烯珠子的制备

注:此协议不需要无菌技术。

1. 在1.5 mL微离心管中称量10mg的Carboxylate改性聚苯乙烯珠子。
2. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的2-（N-变形）甲酸（MES）缓冲液。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐，可降低卡博迪米德的活性，适合用于蛋白质耦合反应。涡旋管混合珠子。
3. 通过台式离心机在 2，000 x g下旋转管子 60 s。
4. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
5. 按照步骤 1.2-1.4 再次用 1 mL 的 MES 缓冲液清洗珠子。
6. 将含有10毫克EDAC的MES缓冲液加入管中，以激活表面的Carboxyl基组。涡旋管混合珠子。
7. 在室温下旋转和孵育管15分钟。
8. 在 2，000 x g下旋转珠子 60 s。
9. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
10. 要清洗珠子，在管中加入1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。涡旋管混合珠子。
11. 在 2，000 x g下旋转管 60 s。
12. 通过仔细移液缓冲液丢弃上清液。
13. 按照步骤 1.10-1.12 再次用 1 mL 的 PBS 清洗珠子。
14. 使用的罗达明的最终浓度将取决于被成像的菌株。从 0.....

结果

对于珠子制备，我们确定了表达GFP-肌苷II和mCherry-组蛋白的转基因菌株的红-X琥珀酯的最佳量（图1A-D）。我们使用 mCherry 标记组蛋白作为细胞周期进展的标记。由于罗达明红X-X和mCherry将由561nm激光照明，因此罗达明红X-X信号的最佳强度与组蛋白相当，可以同时成像细胞和珠子。例如，使用 0.005 μg/mL Rhodamine 红-X 琥珀酯处理的珠子的荧光信号太弱，无法可视化珠（图 1A）。另一方面，用5μg/mL罗达明红-X琥珀酯处理的珠子发出的荧光信号太强，无法成像mCherry-组蛋白（图1D）。我们确定0.5 μg/mL罗达明红-X琥珀基酯是这种特殊转基因菌株的最佳选择（图1C）。

讨论

重建简化的细胞接触模式将使研究人员测试特定细胞接触模式在形态形成不同方面的作用。我们用这种技术来表明细胞分裂轴是由粘接珠体接触^控制的。由于分轴规范对多细胞发育至关重要，有助于形成形态^生成14、干细胞^{分裂15、16}和组织^{平衡15、16，}这种方法应该能够阐明动物组织形成的新机制。

除了细胞分裂方向外，这种方法还有可能成为测试机械线索和细胞命运之间关系的平台。以前的研究报告说，机械提示控制细胞命运规范。人类等位干细胞分化成神经元、脂肪细胞、骨骼肌细胞和骨细胞，在基质中培养时具有不同刚^度17。为了应对基质刚度，转录调节器是相关蛋白（YAP）和TAZ（转录共激活剂与PDZ结合图案）将转移到细胞核，以调节细胞命运

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐	Alfa Aesar	AAA1080703	用于磁珠制备
抽吸管组件	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离。
秀丽隐杆线虫菌株：N2，野生型	遗传学中心	N2	本研究中使用的菌株
秀丽隐杆线虫菌株：KSG5，基因型：zuIs45;itIs37	内部	KSG5	本研究中使用的菌株
校准的 Mircopipets，10 µL	Drummond	21-180-13	用于卵裂球分离
羧酸盐改性的聚苯乙烯珠子 （30 µm 直径）	KISKER Biotech	PPS-30.0COOHP	用于微珠制备
CD 脂质浓缩	Life Technologies	11905031	用于卵裂球分离。在组织培养罩中工作。
Clorox	Clorox	N. A.	用于卵裂球分离。当次氯酸盐处理效果不佳时，请打开新瓶子。
盖玻片架	内部	N.A.	用于卵裂球分离。
解剖显微镜：Zeiss Stemi 508 带 M 支架。光源是内置 LED。目镜的放大倍数为 10 倍。	Carl Zeiss	Stemi 508	用于卵裂球分离。
牛血清，合格的 One Shot，加拿大原产	Gibco	A3160701	用于卵裂球分离。在组织培养罩中工作。
通用和精确滑动皮下注射针头，25 号	BD	14-826AA	用于卵裂球分离
菊粉	Alfa Aesar	AAA1842509	用于卵裂球分离
MEM 维生素溶液 （100x）	Gibco	11120052	用于卵裂球分离。
MES（细白晶体）	Fisher BioReagents	BP300-100	用于微珠制备
Multitest 载玻片 10 孔	MP Biomedicals ICN6041805		用于卵裂球分离
PBS、磷酸盐缓冲盐水、10 x 粉末	Fisher BioReagents	BP665-1	用于微珠制备
青霉素-链霉素 （10,000 U/mL）	Gibco	15140148	用于卵裂球分离。
聚乙烯吡咯烷酮	Fisher BioReagents	BP431-100	用于卵裂球分离
氯化钾	Bioshop	POC888	用于卵裂球分离
罗丹明 Red-X、琥珀酰亚胺酯、5-异构体	分子探针	R6160	用于微珠制备
Schneider's 果蝇无菌培养基	Gibco	21720024	用于卵裂球分离。在组织培养罩中工作。
氯化钠	Bioshop	SOD001	用于卵裂球分离
氢氧化钠溶液，10 N	Fisher Chemical	SS255-1	用于卵裂球分离
转盘式共聚焦显微镜：Yokogawa CSU-X1、Zeiss Axiovert 倒置瞄准镜、Quant EM 512 相机、63X NA 1.4 平场复消色差物镜。系统由 Slidebook 6.0 控制。	Intelligent Imaging Innovation	N.A.	用于实时成像
针头式过滤器，PTFE，非无菌	Basix	13100115	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管，配方 E-3603，内径 3.175 毫米	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管，配方 E-3603，内径 6.35 毫米	圣戈班高性能塑料	89403-854	用于卵裂球分离。