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方法文章

体外重建分离细胞的空间接触模式 秀丽隐杆线虫 胚胎卵裂球与粘附性聚苯乙烯微珠

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DOI：

10.3791/60422

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2019年11月26日

 ,  , 
1Department of Zoology, The University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, The University of British Columbia

本文内容

摘要

多细胞系统的组织复杂性使得识别细胞外信号与单个细胞行为之间的因果关系变得困难。本文介绍了一种利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎分裂球和粘附性聚苯乙烯微珠来研究接触依赖性信号与分裂轴之间直接关联的方法。

摘要

在多细胞系统中，单个细胞受到来自邻近细胞及周围环境的各种物理和化学信号的影响。这种组织复杂性使得识别外部信号与细胞动态之间的因果关系变得困难。通过人工重建的多细胞系统，研究人员能够在排除其他干扰因素的情况下，专门测试某一特定信号的作用，从而克服这一难题。本文介绍一种利用分离的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎细胞与黏附性聚苯乙烯微珠重建细胞接触模式的方法。该方法包括去除卵壳、通过破坏细胞间黏附来分离胚胎细胞、制备黏附性聚苯乙烯微珠，以及重建细胞-细胞或细胞-微珠之间的接触。最后，我们展示了该方法在研究细胞分裂轴方向中的应用，该方向在胚胎发育过程中对细胞空间排列和细胞命运决定具有调控作用。这一稳定、可重复且灵活的体外方法，能够用于研究细胞空间接触模式与细胞响应之间的直接关系。

引言

在多细胞发育过程中，单个细胞的细胞行为（例如分裂轴）由多种化学和物理信号所决定。理解单个细胞如何解读这些信息，以及它们如何作为一个涌现性状来调控多细胞结构的组装，是形态发生研究的最终目标之一。C. elegans 作为模式生物，在解析形态发生的细胞水平调控机制方面做出了重要贡献，例如细胞极性1、细胞分裂模式1、细胞命运决定2，以及组织尺度上的调控过程，如神经环路连接3和器官发生4,5。尽管已有多种遗传学工具可供使用，但组织工程方法仍然有限。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中，最成功的组织工程方法是经典的卵裂球分离法6；由于C. elegans胚胎被卵壳和通透性屏障所包围7，去除这些结构是该方法的主要步骤之一。尽管这种卵裂球分离方法能够以简化的方式重建细胞间的接触，但它无法消除不需要的信号；细胞接触仍然会带来机械性（例如黏附）和化学性信号，从而限制了我们全面分析信号与细胞行为之间因果关系的能力。

本文介绍的方法采用羧基修饰的聚苯乙烯微球，该微球可与包括蛋白质在内的任何胺反应性分子共价结合，作为配体。特别是，我们使用了一种胺反应性的罗丹明Red-X（Rhodamine Red-X）形式作为配体，使微球既可在视觉上追踪，又能黏附于细胞。微球表面的羧基与配体分子的伯胺基团通过水溶性碳二亚胺试剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDAC）进行偶联8,9。所获得的黏附性微球可用于研究机械信号对细胞动态的影响10。我们已利用该技术鉴定了细胞分裂方向所必需的机械信号10。

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方案

1. 黏附性聚苯乙烯微球的制备

注意：本实验方案无需无菌操作技术。

  1. 称取10 mg羧基修饰的聚苯乙烯微球，置于1.5 mL微量离心管中。
  2. 用1 mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液清洗微球。由于MES缓冲液不含磷酸盐和醋酸盐（这些成分会降低碳二亚胺的反应活性），因此适用于蛋白偶联反应。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
  3. 使用台式离心机在2,000 × g 条件下离心60秒。
  4. 小心用移液器吸出上清液。
  5. 按照步骤1.2–1.4，再用1 mL MES缓冲液清洗微球一次。
  6. 向管中加入含10 mg EDAC的1 mL MES缓冲液，以活化微球表面的羧基基团。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
  7. 将管子置于旋转混合器上，在室温下孵育15分钟。
  8. 在2,000 × g 条件下离心60秒，使微球沉淀。
  9. 小心用移液器吸出上清液。
  10. 向管中加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以清洗微球。涡旋振荡管子，使微球充分混匀。
  11. 在2,000 × g 条件下离心60秒。
  12. 小心用移液器吸出上清液。
  13. 按照步骤1.10–1.12，再用1 mL PBS清洗微球一次。
  14. 所用罗丹明的最终浓度取决于待成像的菌株。从0.65 mM罗丹明Red-X储备液中，分别制备1、10、100和1000倍稀释的系列溶液，每种1 mL。
  15. 向每个稀释梯度管中加入20 µL微球悬液。
  16. 将管子置于旋转混合器上，在室温下孵育5分钟。
  17. 重复步骤1.10–1.12，用1 mL PBS清洗微球两次。
  18. 向管中加入1 mL PBS，4 °C保存，可保存长达6周。在活细胞成像所用的显微镜下检测微球的荧光强度。罗丹明Red-X琥珀酰亚胺酯的合适浓度取决于成像条件（图1）。
    注意：未经罗丹明Red-X处理的微球不会黏附于细胞。罗丹明Red-X既作为荧光标记物，也作为黏附分子。带正电荷的罗丹明Red-X与带负电荷的细胞质膜之间的静电相互作用可能是其黏附的机制。

2. 口吸管的组装

  1. 将内径为 6.35 mm 的宽型和内径为 3.175 mm 的窄型 Tygon 管分别剪成约 25 cm 和 40 cm 长（图 2）。
  2. 用聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（孔径 0.2 µm）连接两段 Tygon 管（图 2）。
  3. 拆开一个市售的吸管管，将其毛细管夹持器和吹嘴分别连接到窄型和宽型 Tygon 管的末端（图 2）。
    注：使用 PTFE 滤膜可防止通过口吸取次氯酸盐溶液时吸入其挥发气体。

3. 胚胎卵裂球的分离

注意：佩戴手套和实验服，以避免割伤以及接触漂白溶液。

  1. 用左右手各握住一根微毛细管（容量：10 µL）的一端。
  2. 将微毛细管向两端拉伸以施加张力，然后将毛细管中部置于火焰上加热，制备两根手工拉制的毛细管。图3A).
  3. 用镊子在解剖显微镜下修剪手工拉制的毛细管尖端，并将拉制好的毛细管安装到口吸管装置上（图2）。准备两种类型的移液管，其尖端开口大小应分别约为短轴长度的2倍和1倍 秀丽隐杆线虫 胚胎（30 µm）用于胚胎移植和卵壳去除 图3B-D).
  4. 将45 μL卵盐溶液用移液器滴加到多孔载玻片的一个孔中（图4A；底部。
  5. 放置5-10只成虫 秀丽隐杆线虫 到含有卵盐溶液的孔中。
  6. 获得早期 秀丽隐杆线虫 胚胎，用两根针分别置于成虫右侧和左侧，将成虫切割成片段 秀丽隐杆线虫 身体并使针头相互滑动（图4A；上部示意图）。
  7. 将 45 μL 次氯酸盐溶液用移液器滴加到含有卵盐溶液的孔旁边的孔中（图4B).
  8. 将45 μL Shelton生长培养基移液至含次氯酸盐溶液的孔旁边的接下来三个孔中图4B).
  9. 用手工拉制的胚胎移植毛细管通过口吸法将1细胞期和早期2细胞期胚胎转移至次氯酸盐溶液中图4B).
  10. 等待 40–55 秒。
  11. 用手工拉制的胚胎转移毛细管通过口吸移液法，将胚胎从次氯酸盐溶液转移至谢尔顿生长培养基中，以洗涤胚胎。图4B).
  12. 用手工拉制的胚胎移植毛细管通过口吸移液法将胚胎转移至Shelton培养基的新孔中，再次清洗胚胎图4B).
  13. 将洗涤后的胚胎通过手工拉制的移植毛细管，用口吸法转移至Shelton培养基的新孔中。使用手工拉制的毛细管进行去壳操作时，需小心重复吹打图4C；中间为示意图）。如果卵壳被成功去除，胚胎细胞将变得更加圆润图4C；右侧。
  14. 通过手工拉制的毛细管轻轻并持续吹打，分离2细胞期胚胎的卵裂球以去除卵壳（图4D).

4. 利用卵裂球和微珠重建接触模式

注意：应在成像显微镜下操作，以避免细胞从微珠上解离，并便于及时进行图像采集。

  1. 使用倒置显微镜观察时，按照图5制备成像腔。
    1. 将盖玻片放置在盖玻片支架上（图5A）。
    2. 用胶带固定盖玻片边缘以稳定其位置。贴有胶带的一侧为“背面”（图5A,B）。
    3. 将盖玻片支架翻转至“正面”，并用疏水笔在盖玻片上画一个圆圈（图5C）。
      注意：任何玻璃底培养皿均可使用，前提是可通过口吸管操作胚胎。
  2. 在疏水笔所画的圆圈内加入谢尔顿培养基（Shelton's growth medium）（图5D）。
  3. 将分离的卵裂球转移至成像腔中。
  4. 使用手工拉制的毛细管吸取少量化学功能化微珠，用于胚胎转移。
  5. 通过向手工拉制的毛细管中吹气，控制聚苯乙烯微珠的位置，直至微珠附着于分离的卵裂球上。
  6. 加盖盖玻片以防止培养基蒸发（图5E），并进行活体成像。

5. 重要试剂的制备

  1. 卵盐溶液（10 mL）：将 235 µL 的 5 M NaCl 和 240 µL 的 2 M KCl 加入 9525 µL 的 dH2O 中混合。
  2. 次氯酸盐溶液（10 mL）：将 7.5 mL 的 Clorox（含约 7.5% 次氯酸钠）与 2.5 mL 的 10 N NaOH 混合（次氯酸钠终浓度约为 5.625%）。
    注意：尽管许多已发表的方法使用几丁质酶来消化几丁质卵壳，但我们采用了一种使用次氯酸盐溶液的方法11。通过避免几丁质酶活性在不同批次间的差异，我们认为该方法更具可重复性且成本更低。
  3. 0.81 mM 菊粉溶液（40 mL）
    1. 将 0.2 g 菊粉加入 40 mL 的 dH2O 中。
    2. 高压灭菌以溶解。
      注意：在 4 °C 下可保存 1 个月。
  4. 0.5 M MES 缓冲液（500 mL）
    1. 将 48.81 g MES 溶解于 400 mL 蒸馏水（dH2O）中。
    2. 调节 pH 至 6.0。
    3. 用 dH2O 定容至 500 mL。
  5. PBS 溶液（1 L）
    1. 配制 10 倍浓度 PBS 溶液时，将 1 包 PBS 预混粉末溶解于 1 L 的 dH2O 中。
    2. 取 100 mL 的 10 倍 PBS 溶液与 900 mL 的 dH2O 混合。
  6. 5% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液（4 mL）
    1. 在无菌条件下，将 0.2 g PVP 溶解于 4 mL 果蝇 Schneider 培养基中。
      注意：务必在组织培养（TC）超净台中开启 Schneider 培养基原液。在 4 °C 下可保存 1 个月。
  7. 0.65 mM 罗丹明 Red-X 储存液（2 mL）
    1. 称取 1 mg 罗丹明 Red-X。
    2. 加入 2 mL 二甲基亚砜（DMSO）溶解。
    3. 分装后于 -20 °C 保存。
  8. Shelton 生长培养基（SGM）（10.25 mL）
    1. 在无菌条件下，将 8 mL 果蝇 Schneider 培养基、1 mL PVP 溶液、1 mL 菊粉溶液、1 mL 基础伊格尔培养基（BME）维生素、50 µL 青霉素-链霉素和 100 µL 脂质浓缩液混合。
    2. 将 SGM 以每管 325 µL 分装至 1.5 mL 微量离心管中。
      注意：在 4 °C 下可保存约 1 个月。
    3. 在进行卵裂球分离当天，向每份 SGM 中加入 175 µL 胎牛血清（FBS）（终体积为 500 µL）。
      注意：FBS 应储存在 -20 °C，使用前需解冻。FBS 无需热灭活。

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结果

在珠子制备过程中，我们确定了用于表达GFP-肌球蛋白II和mCherry-组蛋白的转基因品系的罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯（Rhodamine Red-X succinimidyl ester）的最佳用量（图1A-D）。我们使用mCherry标记的组蛋白作为细胞周期进程的标记物。由于罗丹明红-X和mCherry均可被561 nm激光激发，因此罗丹明红-X信号的最佳强度应与组蛋白信号强度相当，以便同时对细胞和珠子进行成像。例如，用0.005 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯处理的珠子荧光信号过弱，无法清晰观察珠子（图1A）；而用5 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯处理的珠子荧光信号过强，干扰了mCherry-组蛋白的成像（图1D）。我们确定，对于该特定转基因品系，0.5 µg/mL罗丹明红-X琥珀酰亚胺酯为最佳浓度（图1...

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讨论

重建简化的细胞接触模式将使研究人员能够检验特定细胞接触模式在形态发生不同方面的作用。我们已利用该技术证明，细胞分裂轴受到与黏附微珠物理接触的调控10。由于分裂轴的确定通过影响形态发生14、干细胞分裂15,16以及组织稳态15,16，对多细胞发育至关重要，因此该方法有望揭示动物组织形成的新机制。

除了细胞分裂方向外，该方法还有望作为研究机械信号与细胞命运之间关系的平台。先前的研究报道，机械信号可调控细胞命运的决定。当在具有不同刚度的基质上培养时，人源间充质干细胞会分化为神经元、脂肪细胞、骨骼肌细胞和成骨细胞17。响应基质刚度，转录调控因子Yes相关蛋白（YAP）和TAZ（含PDZ结合基序的转录共激活因子）会转入...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 James Priess 和 Bruce Bowerman 提供建议并赠送 C. elegans 菌株，感谢 Don Moerman、Kota Mizumoto 以及生命科学研究所影像核心设施共享仪器和试剂，感谢 Aoi Hiroyasu、Lisa Fernando 和 Min Jee Kim 在 C. elegans 培养及论文手稿审阅方面的重要贡献。本研究工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助（项目号：RGPIN-2019-04442）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐Alfa AesarAAA1080703用于微珠制备
吸液管组件Drummond21-180-13用于卵裂球分离
秀丽隐杆线虫品系：N2，野生型秀丽隐杆线虫遗传中心N2本研究使用的品系
秀丽隐杆线虫品系：KSG5，基因型：zuIs45; itIs37本实验室KSG5本研究使用的品系
校准微量移液管，10 µLDrummond21-180-13用于卵裂球分离
羧基修饰聚苯乙烯微珠（30 µm 直径）KISKER BiotechPPS-30.0COOHP用于微珠制备
CD脂质浓缩液Life Technologies11905031用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
CloroxCloroxN. A.用于卵裂球分离。当次氯酸盐处理效果不佳时，应开启新瓶。
盖玻片架本实验室N.A.用于卵裂球分离。
解剖显微镜：配备M支架的Zeiss Stemi 508，光源为内置LED，目镜放大倍数为10XCarl ZeissStemi 508用于卵裂球分离。
胎牛血清，合格一次性装，加拿大来源GibcoA3160701用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
通用及精密滑动式皮下注射针头，25号BD14-826AA用于卵裂球分离
菊粉Alfa AesarAAA1842509用于卵裂球分离
MEM维生素溶液（100倍浓缩）Gibco11120052用于卵裂球分离。
MES（细白色晶体）Fisher BioReagentsBP300-100用于微珠制备
多孔玻片，10孔MP BiomedicalsICN6041805用于卵裂球分离
PBS，磷酸盐缓冲液，10倍浓缩粉末Fisher BioReagentsBP665-1用于微珠制备
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140148用于卵裂球分离。
聚乙烯吡咯烷酮Fisher BioReagentsBP431-100用于卵裂球分离
氯化钾BioshopPOC888用于卵裂球分离
罗丹明红-X 琥珀酰亚胺酯，5-异构体Molecular ProbesR6160用于微珠制备
Schneider’s 果蝇无菌培养基Gibco21720024用于卵裂球分离。在组织培养罩中操作。
氯化钠BioshopSOD001用于卵裂球分离
氢氧化钠溶液，10 NFisher ChemicalSS255-1用于卵裂球分离
转盘共聚焦显微镜：Yokogawa CSU-X1，Zeiss Axiovert 倒置显微镜，Quant EM 512 相机，63X NA 1.4 平场复消色差物镜。系统由Slidebook 6.0控制。Intelligent Imaging InnovationN.A.用于活体成像
注射器滤器，PTFE材质，非无菌Basix13100115用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径3.175 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-862用于卵裂球分离。
Tygon S3 实验室管路，配方E-3603，内径6.35 mmSaint Gobain Performance Plastics89403-854用于卵裂球分离。

参考文献

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624(2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

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