用于小规模细胞处理的自动逆流离心系统

摘要

自动化是细胞制造中扩大规模和成本管理的关键。本文描述了一种逆流离心细胞处理装置在小规模生物加工中用于自动完成缓冲液置换和细胞浓缩步骤的应用。

摘要

基因和细胞治疗产品的成功商业化需要具备成本效益且可放大的生产工艺。缓冲液置换和产物浓缩是大多数生产工艺中必不可少的环节。然而，在产品开发的早期阶段，这些步骤通常依赖手动操作。采用手动终端离心法进行缓冲液置换劳动强度大、成本高，且难以放大。封闭式自动化系统可有效消除这一繁琐步骤，但其实施往往面临挑战。本文介绍了一种新开发的细胞处理装置，适用于小到中等规模的细胞处理，旨在填补手动操作与大规模自动化之间的空白。通过调整流速和离心速度，该方案可轻松适用于多种细胞类型和工艺流程。与手动操作相比，本方案实现了更高的细胞回收率和更短的处理时间。经自动化处理回收的细胞仍保持其原有的增殖能力。该装置可作为封闭式生产工艺中的模块化组件，用于实现缓冲液置换、细胞制剂制备和冷冻保存等步骤。

引言

基因与细胞治疗（GCT）领域的最新进展正迅速改变现代医学的格局。作为转化研究中发展最快的领域之一，GCT 行业也面临着独特且前所未有的挑战。除了需要稳健的临床效果外，高效且具有成本效益的生产工艺对于 GCT 的商业化成功至关重要，而在小规模生产中实现这一点尤为困难¹。当每批细胞仅能为一名患者生产少数几剂，而非数百或数千剂时，时间、人力和质量保证的成本将显著增加。与生产工艺更类似于抗体和重组蛋白生产的同种异体细胞治疗不同，自体细胞治疗通常以小规模方式进行生产¹。作为生物制药生产中相对较新的现象²，目前可用于小规模细胞处理的方案仍然十分有限。

缓冲液置换对于细胞制造至关重要。这是下游工艺中的一个步骤，通过该步骤将细胞从培养基中分离并浓缩，用于冷冻保存或输注。目前，小规模细胞制造通常采用类似于学术研究环境中的工艺，并依赖专用的洁净室来维持无菌状态³。手动的下游工艺通常使用台式离心机对细胞进行沉淀和重悬，以实现体积缩减和缓冲液置换。这些开放式操作成本较高（例如人力和洁净室维护），且生产能力有限，不适合商业化生产^2,3。

已有研究提出，实施自动化是提高生产效率并实现商业化规模生产的解决方案²。基于细胞的产品无法通过生物制剂常用的传统方法（如γ射线辐照或终端过滤）实现无菌，因此需采用自动化封闭系统，以降低污染风险，并减少操作人员对洁净室维持无菌环境的依赖⁴。工艺自动化还可通过并行运行多个系统（横向扩展）或提升单个设备的处理能力（纵向扩展）来解决可扩展性问题，从而最大限度地减少操作人员之间的差异性。此外，对自体疗法的成本建模分析表明，自动化可能降低生产成本^5,6。然而，在一项使用自动化生产平台的自体干细胞临床试验中，并未发现成本优势⁷，这表明自动化的成本效益可能取决于具体的生产工艺。

在现有生产工艺中引入自动化的策略有多种。这可以通过实施完全集成的平台或基于模块的加工链来实现。目前市面上已有多种用于自体细胞生产的完全集成化平台，例如 CliniMACS Prodigy（Miltenyi Biotec）、Cocoon（Octane Biotech）和 Quantum（Terumo BCT）。这些集成化平台常被称为“"GMP-in-a-box"”，对基础设施要求较低，且操作简便。然而，完全集成系统的生产能力可能受限于其配套的培养箱。例如，Prodigy 的培养容量受限于其 400 mL 培养腔⁸，而 Quantum 培养盒的表面积上限为 2.1 m²（相当于 120 个 T175 培养瓶）⁷，对于需要更高细胞剂量的患者而言可能不足^9,10。此外，Prodigy 和 Quantum 均存在一个共同局限：在细胞扩增期间，操作单元被单一批次的细胞全程占用，从而限制了每个单元可生产的批次数量¹¹。自动化的模块化方法则是构建由多个模块化单元组成的生产链，以模拟商业化生产工艺^12,13。该方法将细胞培养装置与细胞清洗装置分离，从而可最大化生产效率。理想的加工设备应具备适应性和可扩展性，以满足不同的生产需求¹²。

逆流离心（CFC）技术始于20世纪70年代，在细胞处理领域已有悠久历史¹⁴。该技术通过平衡离心力与逆流力实现细胞的浓缩和分离。通常情况下，细胞悬液在恒定流速下从离心腔的狭窄端进入，同时受到离心力作用（图1A）。流体流动方向与离心力方向相反，这种力被称为逆流力，其在细胞腔内形成梯度。随着离心腔从锥形末端向宽端扩展，逆流力逐渐减小。密度较高、直径较大的细胞沉降速率更高，因此在靠近锥形细胞腔末端的位置达到受力平衡。较小的颗粒可能在腔体基部达到平衡，或因过小而无法在腔内滞留，最终被冲洗出去。CFC技术最广为人知的应用是血液分离产品的处理，例如用于树突状细胞治疗的单核细胞分离^15,16。在缓冲液置换方面，CFC技术目前仅应用于大规模生产¹⁷，尚未用于自体细胞治疗的小规模生产。

为满足小规模细胞生产对合适设备的需求，近期开发了一种自动化的逆流离心装置（参见材料表）¹⁸。该自动化细胞处理装置采用逆流离心技术，可去除细胞碎片并实现缓冲液置换。该装置通过一次性使用的套件进行缓冲液置换，并可无菌连接至细胞转移袋，从而在无菌、封闭的系统中完成细胞处理。本文研究了在自动化操作流程中使用逆流离心装置对哺乳动物细胞培养物进行缓冲液置换的方法。在本研究中，我们分别采用Jurkat细胞和间充质基质细胞（MSCs）作为非贴壁型和贴壁型细胞的模型，测试了缓冲液置换方案。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞，常用于急性T细胞白血病的研究^19,20。MSCs是成体干细胞，已在针对多种疾病的中国台湾人体临床试验中得到广泛研究⁹。

方案

1. 缓冲液置换所需试剂和细胞的准备

1. 在 II 级生物安全柜中配制缓冲液（参见材料表）。使用注射器和针头组件，从 500 mL 生理盐水袋中抽出 50 mL 生理盐水，然后加入 50 mL 20% 人血清白蛋白（HSA），配制成含 2% HSA 的生理盐水，作为洗涤缓冲液。
2. 从培养容器中收集细胞，并通过台盼蓝染色排除法进行细胞计数，以确定起始细胞数量和细胞活力。将细胞转移至转接袋中。
   注意：本实验中，Jurkat 细胞在 RPMI 培养基中培养，MSCs 在 DMEM:F12 培养基中培养。两种培养基均添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液。细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。对于 MSCs 或贴壁细胞，需向培养容器中加入消化酶（如胰蛋白酶）以使细胞脱落，待细胞脱落后用培养基终止消化。本实验使用转接袋是因为细胞在培养容器中进行了扩增。然而，若细胞直接在细胞培养袋中培养，则可通过无菌管路焊接将培养袋直接连接至一次性使用套件。本实验中，每次运行使用 3 × 10⁷ 个 Jurkat 细胞或 1 × 10⁷ 个 MSCs，细胞悬浮于 40 mL 培养基中。
   1. 若具备无菌管路焊接仪，可使用注射器和针头组件将细胞加载至转接袋（参见材料表），以便将转接袋与一次性使用处理套件连接。
   2. 或者，使用已灭菌的剪刀剪断连接管，保留约 10 cm 管路连接在转接袋上，并在管路末端安装一个雌性鲁尔接头。用注射器吸取细胞和培养基后，将注射器连接至鲁尔接头，并将细胞注入转接袋中。
3. 将含有细胞的袋子、步骤 1.1 中配制的含 500 mL 洗涤缓冲液的缓冲液袋、废液袋以及收集用注射器连接至一次性使用套件（图 1B）。
   注意：各袋子的连接位置取决于程序设置。本实验中，我们将废液袋连接至 A 位，洗涤缓冲液袋连接至 B 位，细胞袋连接至 D 和 F 位，收集注射器连接至 H 位（图 1C）。

2. 自动化缓冲液置换程序

1. 打开设备的图形用户界面（GUI），在笔记本电脑或平板电脑上点击 "START" 按钮。然后 "Open" 现有协议，或点击 "New" 创建新协议。
2. 使用 "Forward" 和 "Backward" 按钮浏览每一步操作，选择需要打开/关闭的阀门、离心速度、泵速、泵的方向以及动作触发条件。各步骤的设置详见 Table 1。然后保存该协议。

3. 设置仪器

1. 将一次性使用处理套件放置在机器上，并相应悬挂连接的袋子。按下红色的"停止/重置"按钮，将所有阀门重置为默认关闭状态。
   注意：当关闭机门时，机器将执行检测，以确保套件已正确安装且所有阀门正常工作。
2. 将图形用户界面（GUI）连接至处理设备，并按下"连接"按钮。然后下载已保存的程序。当绿色的"运行"按钮亮起时，表示该程序已准备就绪，可以开始运行。
3. 打开转移袋管路的手动夹具。
   注意：如果操作人员忘记打开夹具，设备将停止运行并出现压力传感器警告。请按下"停止"按钮以重置设备，打开夹具后重新开始操作。

4. 自动化缓冲液置换

1. 按下"开始"以启动缓冲液置换程序。
   注意：如需手动调整自动化流程，可在到达"触发"之前按下"下一步"按钮进入下一步，或按下"暂停"以暂停流程。此时细胞将在装置内循环，仅保持阀门 J 和 K 开放（图 1C）。
2. 在自动化步骤 6（表 1）结束时，当已排空的袋中进入空气并触发气泡传感器时，流程将暂停。若袋子确实已空，请按下"下一步"继续进入下一阶段；若传感器是因管路中的气泡而触发，则可按下"暂停"以恢复处理。

5. 细胞的收集与取样

1. 自动化流程结束后，关闭所有管路夹。打开设备门，取出一次性套件。断开注射器以收集细胞，用于后续操作。取少量收集的细胞进行细胞计数和活力检测（见步骤6.2）。

6. 工艺验证

1. 使用手动缓冲液置换方案进行对照实验。
   1. 将细胞悬液在200 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并用30 mL细胞洗涤缓冲液重悬细胞。再次在200 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并用10 mL细胞洗涤缓冲液重悬细胞。
2. 通过台盼蓝排斥法进行细胞计数，使用自动细胞计数仪评估细胞活力。
3. 进行MTS实验，以在2、24和48小时定量细胞增殖。
   注意：MTS实验按照制造商说明书在96孔组织培养板上进行。缓冲液置换后，每孔接种100 µL细胞培养基（含10,000个Jurkat细胞或1,500个细胞）。在每个时间点，向每孔加入20 µL MTS试剂，在37 °C孵育2小时。使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。
4. 进行功能实验，比较自动化流程与手动流程对Jurkat细胞和MSC功能的影响。
   1. 将Jurkat细胞以1 × 10⁶ 个细胞/mL的密度接种于96孔板中，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM:F12培养基中，加入50 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和1 µg/mL离子霉素（细胞刺激混合物）刺激，培养24小时。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   2. 根据制造商说明书，使用基于微球的ELISA法检测培养上清液中白细胞介素-2的产生（参见材料表）。
   3. 将MSC以10,000个细胞/cm²的密度接种于12孔板中，在含10% FBS并补充50单位/mL干扰素-γ的1 mL DMEM:F12培养基中培养48小时。收集上清液进行犬尿氨酸浓度检测，以测定MSC的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）酶活性，方法如前所述²¹。

结果

在本实验方案中，我们以Jurkat细胞和MSCs作为代表性示例，演示自动化的缓冲液置换过程。在此过程中，Jurkat细胞和MSCs的处理步骤相同，仅在离心力和控制流速的泵速上有所差异（表1）。图2展示了在缓冲液置换过程中，相机拍摄到的流化细胞床可能呈现的典型图像。通常情况下，流化细胞床的形态类似于图2A所示，即细胞聚集在锥形腔室中部及前部，腔室尖端留有少量空隙，此处无细胞聚集，且细胞加样入口的开口清晰可见。当引入黏度或密度不同的新缓冲液时，流化细胞床可能会被压缩（图2B）。在本方案中，洗涤步骤开始时，泵速从30–35 mL/min降低至20 mL/min。一旦腔室被新缓冲液充满，泵速即恢复至正常水平，以防止细胞在腔室尖端形成沉淀。较高的流速（图2C）可用于富集活细胞，...

讨论

所述的自动化缓冲液置换方案简单且易于操作。然而，该方案中仍有几个关键步骤至关重要，需特别注意。根据我们的经验，在处理较大的细胞（如间充质干细胞MSCs，平均直径为10–15 µm）时，每次运行应至少包含1 × 10⁷个细胞，以实现最佳的细胞回收率（图4B）。处理较小的细胞（如Jurkat细胞，平均直径约10 µm）时，则需要约3 × 10⁷个细胞才能形成稳定的流化细胞床（图4B）。当细胞数量过少时，细胞更容易从流化床中被冲出，从而影响最终的细胞回收率。此外，我们在保持离心速度恒定的条件下，比较了不同泵速下的细胞损失率。结果发现，随着流速增加，细胞损失也随之增加（图6），这是由于在较高流速下流化床的不稳定性增强所致。然而，当腔室中加载的细胞数量增加至10倍时，细胞损失百分比有所降低，这表明在处理较多细胞时可采用更高的泵速，从而加快处理速度。在操作步骤第...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 ml 鲁尔锁式注射器	BD	302830
20% 人血清白蛋白（HSA）	CSL Behring	AUST R 46283
4-(二甲氨基)苯甲醛	Sigma-Aldrich	156477-25g
500 ml 静脉输液盐水袋	Fresenius Kabi	K690521
抗生素-抗真菌剂	Thermo Fisher Scientific	15240112
自动细胞计数仪（Countess）	Thermo Fisher Scientific	N/A
细胞计数腔载玻片	Thermo Fisher Scientific	C10228
细胞刺激混合液（500倍浓缩）	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
细胞转移袋	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous 一步法细胞增殖检测试剂盒（MTS）	Promega	G3582
离心机	Eppendorf	5810R
DMEM:F12 培养基	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision 酶标仪	Perkin Elmer	N/A
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	10099141
人白细胞介素 2（IL2）检测试剂盒	Perkin Elmer	Al221C
鲁尔接头（雌性）	CPC	LF41
PC 笔记本电脑或 PC 平板设备	ASUS	N/A
酶标仪（SpectraMax i3）	Molecular Device	N/A
重组人干扰素-γ	PeproTech	300-02
Rotea 逆流离心细胞处理装置	Scinogy	N/A
Rotea 一次性使用处理套件	Scinogy	N/A
RPMI 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875119
手术剪刀	ProSciTech	420SS
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T6399-250g
台盼蓝染液	Thermo Fisher Scientific	T10282
胰蛋白酶消化酶（TrypLE Express 酶）	Thermo Fisher Scientific	12604013