自动化是细胞制造中扩大规模和成本管理的关键。本文描述了一种逆流离心细胞处理装置在小规模生物加工中用于自动完成缓冲液置换和细胞浓缩步骤的应用。
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本文内容
摘要
摘要
基因和细胞治疗产品的成功商业化需要具备成本效益且可放大的生产工艺。缓冲液置换和产物浓缩是大多数生产工艺中必不可少的环节。然而，在产品开发的早期阶段，这些步骤通常依赖手动操作。采用手动终端离心法进行缓冲液置换劳动强度大、成本高，且难以放大。封闭式自动化系统可有效消除这一繁琐步骤，但其实施往往面临挑战。本文介绍了一种新开发的细胞处理装置，适用于小到中等规模的细胞处理，旨在填补手动操作与大规模自动化之间的空白。通过调整流速和离心速度，该方案可轻松适用于多种细胞类型和工艺流程。与手动操作相比，本方案实现了更高的细胞回收率和更短的处理时间。经自动化处理回收的细胞仍保持其原有的增殖能力。该装置可作为封闭式生产工艺中的模块化组件，用于实现缓冲液置换、细胞制剂制备和冷冻保存等步骤。
引言
基因与细胞治疗（GCT）领域的最新进展正迅速改变现代医学的格局。作为转化研究中发展最快的领域之一，GCT 行业也面临着独特且前所未有的挑战。除了需要稳健的临床效果外，高效且具有成本效益的生产工艺对于 GCT 的商业化成功至关重要，而在小规模生产中实现这一点尤为困难1。当每批细胞仅能为一名患者生产少数几剂，而非数百或数千剂时，时间、人力和质量保证的成本将显著增加。与生产工艺更类似于抗体和重组蛋白生产的同种异体细胞治疗不同，自体细胞治疗通常以小规模方式进行生产1。作为生物制药生产中相对较新的现象2，目前可用于小规模细胞处理的方案仍然十分有限。
缓冲液置换对于细胞制造至关重要。这是下游工艺中的一个步骤，通过该步骤将细胞从培养基中分离并浓缩，用于冷冻保存或输注。目前，小规模细胞制造通常采用类似于学术研究环境中的工艺，并依赖专用的洁净室来维持无菌状态3。手动的下游工艺通常使用台式离心机对细胞进行沉淀和重悬，以实现体积缩减和缓冲液置换。这些开放式操作成本较高（例如人力和洁净室维护），且生产能力有限，不适合商业化生产2,3。
已有....
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方案
1. 缓冲液置换所需试剂和细胞的准备
- 在 II 级生物安全柜中配制缓冲液（参见材料表）。使用注射器和针头组件，从 500 mL 生理盐水袋中抽出 50 mL 生理盐水，然后加入 50 mL 20% 人血清白蛋白（HSA），配制成含 2% HSA 的生理盐水，作为洗涤缓冲液。
- 从培养容器中收集细胞，并通过台盼蓝染色排除法进行细胞计数，以确定起始细胞数量和细胞活力。将细胞转移至转接袋中。
注意：本实验中，Jurkat 细胞在 RPMI 培养基中培养，MSCs 在 DMEM:F12 培养基中培养。两种培养基均添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液。细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。对于 MSCs 或贴壁细胞，需向培养容器中加入消化酶（如胰蛋白酶）以使细胞脱落，待细胞脱落后用培养基终止消化。本实验使用转接袋是因为细胞在培养容器中进行了扩增。然而，若细胞直接在细胞培养袋中培养，则可通过无菌管路焊接将培养袋直接连接至一次性使用套件。本实验中，每次运行使用 3 × 107 个 Jurkat 细胞或 1 × 107 个 MSCs，细胞悬浮于 40 mL 培养基中。- 若具备无菌管路焊接仪，可使用注射器和针头组件将细胞加载至转接袋（参见材料表），以便将转接袋与一次性使用处理套件连接。
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结果
在本方案中，我们采用Jurkat细胞和MSCs作为代表性示例，以演示自动化的缓冲液置换过程。在此过程中，Jurkat细胞和MSCs的处理步骤相同，仅在离心力和控制流速的泵速上有所差异（表1）。图2展示了摄像头拍摄到的流化细胞床在缓冲液置换过程中可能呈现的典型图像。通常情况下，流化细胞床的形态类似于图2A所示，细胞聚集在锥形腔室的中部及前部，腔室尖端留有少量空隙，此处无细胞聚集，且细胞加样入口的开口清晰可见。当引入黏度或密度不同的新缓冲液时，流化细胞床可能会被压缩（图2B）。在本方案中，洗涤步骤开始时，泵速从30–35 mL/min降低至20 mL/min；一旦腔室被新缓冲液充满，泵速即恢复至正常水平，以防止细胞在腔室尖端形成沉淀。较高的流速（图2C）可用于富集活细胞，.......
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讨论
所述的自动化缓冲液置换方案简单且易于操作。然而，该方案中仍有几个关键步骤至关重要，需特别注意。根据我们的经验，在处理较大的细胞（如间充质干细胞MSCs，平均直径为10–15 µm）时，每次运行应至少包含1 × 107个细胞，以实现最佳的细胞回收率（图4B）。处理较小的细胞（如Jurkat细胞，平均直径约10 µm）时，则需要约3 × 107个细胞才能形成稳定的流化细胞床（图4B）。当细胞数量过少时，细胞更容易从流化床中被冲出，从而影响最终的细胞回收率。此外，我们在保持离心速度恒定的条件下，比较了不同泵速下的细胞损失率。结果发现，随着流速增加，细胞损失也随之增加（图6），这是由于在较高流速下流化床的不稳定性增强所致。然而，当腔室中加载的细胞数量增加至10倍时，细胞损失百分比有所降低，这表明在处理较多细胞时可采用更高的泵速，从而加快处理速度。在操作步骤第.......
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披露
SW、IF 和 DJ 分别是 Scinogy Pty. Ltd. 的首席运营官、首席技术官和首席执行官。Scinogy 还提供了对 CFC 设备的使用权限。
致谢
本工作由维多利亚州政府运营基础设施支持计划以及经济发展、就业、交通和资源部提供的维多利亚州政府技术代金券资助。RL 获得国家健康与医学研究理事会职业发展研究员资助。AL 获得澳大利亚研究生奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 20 ml 鲁尔锁式注射器 | BD | 302830 | |
| 20% 人血清白蛋白（HSA） | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(二甲氨基)苯甲醛 | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500 ml 静脉输液盐水袋 | Fresenius Kabi | K690521 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| 自动细胞计数仪（Countess） | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| 细胞计数腔载玻片 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| 细胞刺激混合液（500倍浓缩） | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| 细胞转移袋 | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous 一步法细胞增殖检测试剂盒（MTS） | Promega | G3582 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM:F12 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision 酶标仪 | Perkin Elmer | N/A | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| 人白细胞介素 2（IL2）检测试剂盒 | Perkin Elmer | Al221C | |
| 鲁尔接头（雌性） | CPC | LF41 | |
| PC 笔记本电脑或 PC 平板设备 | ASUS | N/A | |
| 酶标仪（SpectraMax i3） | Molecular Device | N/A | |
| 重组人干扰素-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea 逆流离心细胞处理装置 | Scinogy | N/A | |
| Rotea 一次性使用处理套件 | Scinogy | N/A | |
| RPMI 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| 手术剪刀 | ProSciTech | 420SS | |
| 三氯乙酸 | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| 台盼蓝染液 | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 胰蛋白酶消化酶（TrypLE Express 酶） | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
参考文献
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Sp....
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