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利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估

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DOI：

10.3791/60427

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2020年6月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, 2Department of Physiology, Kilimanjaro Christian Medical University College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案旨在逐步描述利用去膜心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。该方法可利用从小块冷冻活检样本中获取的材料，对肌丝功能进行测量和急性调节，这些样本可从不同心脏部位获取，适用于从小鼠到人类的多种物种。

摘要

本文介绍了分离单个透化（"skinned"）心肌细胞并将其连接至测力装置和电机以进行功能研究的步骤。这些研究可用于测量心肌细胞的刚度（被动张力），并通过不同含钙离子（Ca2+）溶液激活细胞，从而测定包括最大张力生成、肌丝对Ca2+的敏感性（pCa50）、协同性（nHill）以及张力重建速率（ktr）在内的多种参数。该方法还可用于评估直接作用于肌丝的药物，以及外源性重组蛋白表达对心肌细胞主动和被动特性的影响。在临床方面，透化心肌细胞研究有助于揭示多种心肌疾病的病理生理机制，并可在体外评估靶向肌丝的治疗干预措施的效果。总体而言，该技术通过研究动物模型及开胸或心脏移植手术中获取的人体组织中体外与体内参数之间的相关性，有助于阐明心脏的病理生理过程。

引言

传统上，心肌机械特性的评估主要在多细胞组织样本上进行，例如乳头肌和小梁肌1,2。多细胞心肌条包含多种类型的细胞，其中包括收缩性心肌细胞，其取向和力生成模式未知，同时还存在电活动以及应力/应变分布的异质性，以及周围的结缔组织基质3,4。若采用不含胶原且仅含单个心肌细胞的制备方法，则可极为精确和可控地测量肌节长度及横桥收缩特性5,6。因此，在过去四十多年中，已发展出多种方法，用于研究单个心肌细胞的机械、收缩和舒张特性6,7。这些细胞的收缩功能在很大程度上依赖于肌节长度和横桥循环动力学3。因此，直接在单个分离的心肌细胞中研究肌肉功能是理想的，因为这可以评估肌节长度与功能表现，以及横桥功能和收缩特性。然而，将具有正常功能的心肌细胞成功分离并固定，同时在µN水平记录其力学信号，并保持足够的光学分辨率以观察肌节，目前仍具有挑战性且处于不断发展之中3,6。另一项挑战是从新鲜获取的活检组织中分离心肌细胞所需的操作流程。例如，人类心肌活检样本获取的时间不可预测，可能严重影响实验的可行性。

此外，由于对科学实验中动物使用的替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement）所涉及的伦理问题日益关注（即“3R原则”），研究正逐渐转向细胞和组织水平，优先采用人体活检样本或更小动物的样本进行研究。事实上，逐步优化在体外以更简单模型评估心脏功能的方法，有助于将实验结果合理整合至整体生理环境，并将其转化为临床应用7。因此，使用储存在-80 °C的样本分离心肌细胞可能是一种具有吸引力的替代方案。

将心肌组织切成小块，用研钵和研杵进行匀浆。匀浆后的结果是形成一种含有去膜的成束细胞和单个细胞的悬液，这些细胞的肌膜损伤程度不一，肌浆暴露于灌流液中，所有细胞内成分均被洗脱。而距离肌膜较远的结构（如肌原纤维）则得以保留。因此，与肌原纤维装置相关的肌节缩短功能特性保持完整，可被记录下来8,9。

心肌细胞力学测量系统由一个电磁马达和一个测力传感器组成，其中电磁马达用于调节心肌细胞长度，测力传感器用于测量心肌细胞的等长收缩力。将去膜（即“去膜处理”）的心肌细胞置于含有松弛液（[Ca2+] < 10 nM）的实验腔室中，并用硅胶将其两端固定于两根细针上：一根针连接马达，另一根针连接测力传感器。通过光学系统测定心肌细胞的形态和肌节长度。实验方案通常包括在含有不同Ca2+浓度缓冲液中进行一系列测力记录，测定肌动蛋白-肌球蛋白横桥动力学，以及在预设的肌节长度下测量固定心肌细胞的被动张力（图1）。从液氮中速冻（随后储存在-80 °C）的心肌组织样本中分离去膜心肌细胞的技术，结合细胞力学与蛋白质生物化学方法，用于测定单位横截面积上的最大Ca2+激活力（主动力，Tactive，kN∙m-2）、Ca2+非依赖性（被动）张力（Tpassive，kN∙m-2）、肌丝Ca2+敏感性（pCa50）、肌丝协同性（nHill）、主动力重建速率（ktr），以及Tactive、Tpassive、pCa50、nHill和ktr对肌节长度的依赖性。

本方案旨在阐述并总结心肌细胞力学测量系统作为可靠方法的潜力，用于评估从不同物种的冷冻样品中分离出的单个去膜心肌细胞的功能性力学特性。

方案

所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物第 85-23 号，2011 年修订版）以及葡萄牙动物福利法（DL 129/92，DL 197/96；P 1131/97）。本实验方案已获得主管地方当局批准（018833）。

1. 储备液的配制（表1）

  1. 按照说明配制1,000 mL心肌细胞分离用松弛溶液（RELAX-ISO） 表2. 将上述试剂溶解于 ≈500 mL，用KOH调节pH至7.0，定容至1000 mL。
    1. 将RELAX-ISO分装至50 mL离心管中，于-80 °C保存。20 °C.
  2. 准备 250 mL 的 激活溶液 按照以下说明进行操作 表3. 将上述试剂溶解于 ≈100 mL超纯水，用5 M KOH调节pH至7.1 15 °C.
    注意：通常需要加入大量氢氧化钾（KOH）才能达到所需 pH 值。将容量瓶置于装有冰的容器中，以冷却溶液至 15 °C.
    1. 将最终体积调至250 mL。用磁力搅拌器持续搅拌此溶液，直至与松弛液混合前一刻。
  3. 制备100 mL的 松弛液 按照说明进行操作 表4. 将上述试剂溶解于 ≈50 mL超纯水，用5 M KOH调节pH至7.1 15 °C.
    注意： 通常需要加入大量 KOH 才能达到 pH 为 7.1。将容量瓶置于装有冰的容器中，使溶液冷却至 15 °C测量过程中所用溶液的离子强度为 180 mM。
    1. 将最终体积调至100 mL。用磁力搅拌器持续搅拌此溶液，直至与活化液混合前一刻。
  4. 按所示比例混合激活溶液和松弛溶液 表5 以获得 pCa 值在 5.0 至 6.0 之间的溶液。
    1. 混合两种溶液时，务必持续搅拌松弛液和激活液。
    2. 将每种混合物分装至2 mL 微量离心管 将所有微量离心管存放于 -20 °C.
  5. 为每种实验方案配制不同批次的 pCa 溶液（4.5 至 6.0）。

2. 力传感器的校准

注意：力传感器的校准是一项常规操作，应每隔几个月进行一次，或在怀疑其未校准时立即进行。力传感器非常敏感，容易损坏。在使用过程中的每一步（包括校准、心肌细胞粘附和清洁）都应轻柔操作。

  1. 将力传感器从装置的其余部分拆下。
  2. 借助夹具，将力传感器水平放置，使针头朝下，方向与心肌细胞产生力的方向一致。这有助于悬挂一系列已知质量的砝码（如弹性带、缝合线或针）。
    注意：在进行此步骤前，请检查力传感器的特性，确认其标度因子 [mg/伏特]，并避免在传感器上施加过重的负载。对于该型号的力传感器，标度因子为50（50 mg对应1伏特），我们使用5个质量介于12.5至250 mg之间的砝码。
  3. 打开力传感器电源，并预热30分钟。
  4. 首先将最轻的砝码悬挂在力传感器上，记录FORCE OUT端测得的相应电压。
    1. 对最多五个砝码重复此操作。
  5. 绘制施加在力传感器上的力（负载）与电压的关系图，并检查其线性关系。
  6. 若无良好线性，调节传感器电路板上的零点和增益电位器。请参考其具体说明书以获取更多信息。
    1. 调节零点电位器，使输出电压读数为0.0 V。
    2. 在传感器针头上悬挂一个中等质量的砝码，调节增益电位器，使其读取相应的电压（例如，50 mg对应1 V）。取下砝码后，重新调节零点电位器至0.0 V。
    3. 重复步骤2.6.2，直至加载和不加载砝码时的输出均正确。
  7. 将力传感器重新安装回装置中。

3. 设置实验装置

  1. 解冻一管激活溶液以及pH值分别为4.5、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0的溶液和松弛溶液，并将其置于冰上保存。
    注意：ATP和PCr为不稳定化合物，应保持在低温条件下。
  2. 准备显微镜、测试装置及相关计算机以供使用（图1）。
  3. 调节温度，使腔内温度计显示为15 °C。除激酶和磷酸酶孵育实验（20 °C）外，所有实验均在此温度下进行。
  4. 打开力传感器和电机。

4. 去膜心肌细胞的提取与透化

  1. 解冻 50 mL RELAX-ISO 溶液。
  2. 开启离心机，并快速预冷至 4 °C。
  3. 在含有 2.5 mL RELAX-ISO 溶液的培养皿中解冻 3–5 µg 心肌组织样本。
  4. 使用解剖刀片将组织切成小块（图 2）。应精确切割，以避免对细胞造成不必要的损伤。
  5. 用剪口的移液器吸头将含有组织的 2.5 mL RELAX-ISO 溶液转移至 Potter-Elvehjem 玻璃匀浆器中 。
  6. 使用研磨器以 30–40 rpm 的转速机械破碎组织，每次按压组织 2 秒，共按压 3 次，以获得良好的细胞悬液。
  7. 在 15 mL 离心管中配制 10% 的 Triton RELAX-ISO 溶液（250 µL Triton 加 2.25 mL RELAX-ISO），并将该溶液加入细胞悬液中。
  8. 通过轻轻倒置离心管 3 次进行温和混匀。
  9. 室温孵育 1 分钟，随后置于冰上孵育 4 分钟。
  10. 通过加入 RELAX-ISO 溶液至 15 mL 离心管顶部，洗涤去除 Triton；轻轻混匀（倒置离心管 3 次），最后在斜角转子离心机中离心沉淀细胞（348 × g，1 分钟）。弃去上清液，保留约 3 mL 液体在细胞沉淀上方。
    注意：弃上清时应轻柔操作，避免扰动细胞沉淀。尽管如此，仍不可避免地会损失部分悬浮在上清中的细胞。
  11. 重复步骤 4.10 至少 4 次，或直至观察不到由 Triton 残留产生的气泡为止。
    注意：洗涤次数越多，随弃去上清而损失的细胞也越多。
  12. 最后一次洗涤时，弃去上清液，保留 5–10 mL 细胞悬液。

5. 选择并粘附去膜心肌细胞

  1. 将细胞悬液滴加到置于载物片架中载玻片上的盖玻片表面（图1).
  2. 选择一个具有清晰横纹结构和合适大小的杆状心肌细胞（图2).
  3. 使用倒置显微镜的最低放大倍数找到力传感器和电机的针尖。
  4. 旋转盖玻片，使选定的心肌细胞呈水平方向，其两端与力传感器和电机的针头对齐图2).
  5. 使用棉签尖在盖玻片的一侧涂上一条细胶线图2).
  6. 将力传感器和电机的针尖浸入胶线中，使两个针尖周围形成一圈胶环。
    注意：步骤 5.6 - 5.10 需通过谨慎使用电动微调定位器完成。
  7. 迅速将针尖移至心肌细胞焦平面附近。
  8. 将力传感器的针尖向下移动，使其粘附在心肌细胞的一侧边缘。
  9. 用电机的尖端和细胞的另一端重复此操作。
    注意：此步骤必须在2-3分钟内完成，因为胶水固化速度非常快。
  10. 5-8 分钟后，提起针头 ≈15 µm 以避免将细胞粘附在盖玻片上。此步骤通过同时向上移动两个显微操作器来完成。
  11. 让胶水固化。此步骤所需时间可根据胶水类型在15至45分钟之间调整。在本实验中，心肌细胞在以下条件下已充分粘附 ≈15 分钟

6. 记录主动、被动及Ca2+敏感性的力测量数据

  1. 用松弛液填充第一个实验孔（55-100 µL 在实验装置中）以及含有激活溶液的第二个实验孔。
  2. 使用相机软件，将感兴趣区域（ROI）置于心肌细胞中具有清晰条纹图案的区域。
    注意：对于心肌细胞，工作状态下的肌节长度在1.8至 2.2 µm，最适肌节长度约为 2.15 µm.
  3. 测量心肌细胞两个极端之间的距离（从马达到换能器胶水晕圈）， 图3) 在设定最佳肌节长度后（2.2 µm）。在软件中记录该值作为心肌细胞长度。
  4. 测量心肌细胞的宽度和深度，其中深度测量需借助垂直于细胞放置的棱镜镜面完成。
    注意：需要使用强效的外部光源才能通过棱镜观察到细胞。若无棱镜，且假设心肌细胞呈椭圆形，则可将心肌细胞的厚度推断为心肌细胞宽度的70%。
  5. 计算横截面积（CSA，mm2假设心肌细胞呈椭圆形。
    figure-protocol-1
  6. 轻轻移动显微镜载物台，使细胞从盖玻片移至位于载物台背面、盛有松弛液的孔中。
    注意：此操作可能容易损伤细胞。在移动细胞前，应先轻轻将针头稍微上移。避免将细胞移出溶液。
  7. 选择软件中包含两次细胞缩短（缩短至初始长度的80%）的实验方案，该现象将在细胞置于含钙溶液中时发生2+ 溶液和松弛溶液中，分别（图1，补充文件).
    注意：首先 "斯莱克" 细胞的激活将在激活溶液中进行，随后进行第二步 "斯莱克" 在松弛溶液中。通过此操作，使用者能够计算总力（F总计细胞的）从第1个st 以及被动张力（F被动的细胞的2nd. 使用公式计算主动受力 F活性 = F总计 - F被动的细胞缩短80%以脱离所有横桥并记录力量。
  8. 通过移动显微镜载物台，使心肌细胞从松弛溶液进入激活溶液（pCa=4.5(1)），以诱发等长收缩。
    注意：如果细胞具有功能，它将立即收缩。
  9. 当达到力的平台期时，开始记录力的数据。
    注意：这些测试可以单独进行。根据软件的不同，可以创建一系列测试，以对应不同的Ca2+ Ca中的溶液2+-敏感性方案（图1，补充文件).
  10. 等待约10秒，然后更换浸有激活溶液的细胞。
    注意：将细胞浸入松弛溶液前，必须等待10秒。若过早移动细胞，可能导致用于计算细胞力复生速率（ktr值）的重要数据丢失。
  11. 迅速移动载物台，使心肌细胞浸入松弛液中。
  12. 等待测试结束。
  13. 重复步骤 6.8 - 6.12，使细胞在激活溶液（pCa=4.5(2)）中被激活两次。
    注意：通常情况下，首次激活后，心肌细胞末端可能会轻微脱离 从针尖处调整心肌细胞的长度、横截面积和/或肌节长度。重新调节至目标肌节长度，并将校正后的尺寸输入软件中。
    1. 继续进行步骤 6.13.2 以处理 Ca2+ 若仅需获取细胞的被动和主动收缩力数值，可省略灵敏度校准步骤或直接保存数据，随后将细胞从微针上分离，并用丙酮清洗微针以去除胶水。
    2. 调节细胞的肌节长度至 2.2 µm 如有必要，可再次轻轻拉伸。
    3. 用下一个Ca替换激活溶液2+ 溶液（55-100 µL 此处）。重复步骤 6.8 - 6.12。
    4. 用下一个Ca替换激活溶液2+ 溶液（55-100 µL 此处）并重复步骤 6.8 - 6.12，直至所有溶液（5.0、5.2、5.4、5.5、5.8、6.0）均完成测试。
    5. 最后，用激活溶液（pCa4.5(3)）重新激活细胞。重复步骤6.8–6.12。

7. 激酶和磷酸酶孵育

  1. 完成选定的基线方案后，用松弛液将激酶/磷酸酶稀释至推荐浓度。
    注意：建议在实验前先进行剂量-反应曲线测定。
  2. 将实验孔的温度设置为 20 °C。
  3. 在实验孔中加入激酶/磷酸酶、松弛液和激活液（55–100 µL）。
  4. 轻柔移动显微镜载物台，使细胞浸入含有激酶/磷酸酶的孔中。
  5. 根据生产商说明书，或至少孵育 30 分钟，使心肌细胞与激酶/磷酸酶共同孵育。
  6. 重复执行选定的基线方案。

8. 完成实验

  1. 通过拉伸细胞，将心肌细胞从测力传感器和电机的尖端分离。
  2. 使用浸有丙酮的棉签小心地从针尖去除胶状晕环。
  3. 关闭设备。

9. 数据分析

  1. 收集所测试的每种心肌细胞的全部文件。
    注意：每次测试对应一个文件。这意味着每次 Ca2+ 溶液或肌节长度，将有相应的文件。
  2. 计算单个心肌细胞的主动力和被动力。
    1. 使用电子表格打开对应于第一次激活（pCa=4.5(1)）的文件图3附录A，见补充文件).
      注意：我们使用了自行开发的程序进行分析。详见 附录 A 在 补充文件.
    2. 平均值 ≈60 个值之前和平均值 ≈60 个值在第 1 个之后st 细胞松弛（当细胞浸入Ca2+ 溶液）。这两个值分别对应 a 和 b。
    3. 对2重复相同的分析nd 细胞松弛时的松弛度（当细胞浸入松弛溶液中时）。这两个值分别对应于 c 和 d。
    4. 计算 a 与 b 之间的差值（总力，F）总计).
    5. 计算 c 与 d 之间的差值（被动张力，F）被动的).
    6. 计算主动收缩力 F活跃的 = F总计 - F被动的.
    7. 将所有力值归一化至横截面积（CSA）（见上述公式），以获得总张力（T总计），被动张力（T被动的）和主动张力（T活性).
    8. 重复步骤 9.2.1 至 9.2.5，针对 2nd 激活（pCa=4.5(2)）
    9. 将这些值视为代表 T 的数值总计，T活性 和 T被动的 待分析心肌细胞的
      注意：细胞首次在pCa4.5(1)条件下激活通常会伴随细胞尺寸的变化。因此，第二次在pCa4.5条件下的激活更为准确，应采用该次数据。
    10. 对每份文件/测试的 pCa 溶液（5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、4.5(3)）重复步骤 9.2.1 至 9.2.5。
  3. 计算单个心肌细胞的pCa50和nHill值。
    注意：本分析中使用非标准化的 F活性 来自文件 4.5(2)、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0 和 4.5(3) 的数值。
    1. 将所有未归一化的 F 值放入电子表格文件中活跃的 每个Ca2+ 待测溶液（4.5(2)、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、4.5(3)）
    2. 计算校正因子 = F活性 [4.5(2)] - F活性 [4.5(3)] / 7.
    3. 计算F的校正值活跃的 每个 Ca2+ 溶液（5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0）通过减去 F活性 - 校正因子
    4. 计算相对力（F相对的) 每个Ca2+ 通过归一化每个 F 溶液活跃的 通过相应的校正值来计算数值。
      注意：F相对的 [4.5(3)] 应等于 1。每个实验方案均以在饱和 Ca 浓度下进行的对照激活开始和结束2+ 浓度（pCa 4.5(2) 和 4.5(3)）。这可通过比较最大钙激活力的变化来实现对制备物衰减程度的归一化和评估2+-激活的力（F最大）。如果在实验方案结束时，心肌细胞产生的力低于第一次收缩最大力的70%，则应将该细胞/测量数据从分析中剔除。
    5. 使用 F相对的 以及相应的 pCa 值拟合为如下方程所示的S形曲线：F(Ca) = CanHill/（Ca50nHill + CanHill).
    6. 从上述方程中推算出 pCa 和 nHill 值。
  4. 计算单个心肌细胞的力重新发展速率（ktr）。
    1. 对紧接在1之后的数值对应的曲线进行拟合st 细胞松弛
    2. 计算曲线的斜率，该值对应于力的重新发展速率。
    3. 重复步骤 9.4.1 和 9.4.2，针对每个 Ca2+ 溶液
      注意：对于最低钙浓度溶液，曲线拟合效果较差（R平方≤0.90）。

结果

功能正常的透化心肌细胞在整个实验过程中应呈现均匀一致的横纹结构。尽管长时间实验后出现一定程度的退化和收缩力下降是可预期的，但主动张力的数值应相对稳定。若细胞出现明显的横纹消失或显著的收缩力下降（< 15 kN∙m-2 或 <其初始活性力的80%）应予以排除。 表6 显示从啮齿类动物、猪和人类样本中获得的最重要参数的正常预期值。

所获得的参数主要取决于所选择的实验方案。 图5 展示了进行肌丝钙敏感性实验方案所需的8次力测量中的3次代表性力信号轨迹2+-敏感性。将细胞转移至含有激活溶液的孔中后，心肌细胞开始产生力量，直至达到平台期。进行一次快速松弛试验（持续时间为1 ms），使心肌细胞缩短至其原始长度的80%，由此获得零力的基线值。松弛试验后，细胞在激活溶液中继续产生力量。总力量（F总计) 通过从最小值中减去平台期值来计算。该曲线最后部分的斜率给出了力的重新发展速率（ktr）的值。图6)，这是横桥结合与解离表观速率的度量（f应用程序 和 gaap)10当 ktr R2 值是 <0.90 时，ktr 值应被排除，这种情况通常发生在较低的 Ca2+ 浓度（pCa 5.6、5.8 和 6.0）。将细胞重新转移至含有松弛溶液的孔中后，细胞发生松弛，其张力下降。被动张力（F被动的主动收缩力通过从该新的力值中减去最小值（细胞持续缩短后获得）来计算。主动收缩力是 F 与最小值之间的差值。总计 和 F被动的.

表征心肌细胞的最大主动和被动力来源于使用饱和Ca2+溶液（pCa = 4.5）进行第二次细胞激活所测得的数值。第一次激活通常被舍弃，因为肌节长度往往需要重新调整。

进行肌丝Ca2+-敏感性实验方案时，至少需执行9次激活测试（4.5；4.5；5.2；5.6；6.0；5.0；5.4；5.8和4.5）。此序列为示例性质，但应始终以4.5开始（重复两次），并以4.5结束。肌丝Ca2+-敏感性实验方案的数据采集软件编程设置如图1所示，见补充文件。

在计算所有这些激活溶液的主动收缩力后，需检查最后一次激活产生的力是否超过初始最大力的80%（否则应舍弃该细胞的数据，如上所述）。为校正实验过程中Fmax的下降，可使用插值得到的Fmax值对数据点进行归一化处理。归一化后的数据可拟合为以下方程描述的S形曲线：F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill)。所得参数值代表钙敏感性（Ca50，可转换为pCa50）和协同性（nHill）。所有力值在根据横截面积归一化后，均可转换为张力值。除了肌丝对Ca2+的敏感性及依赖长度的激活方案外，还可进行其他测试，例如Tactive、Tpassive（图7）以及心肌细胞残余力的肌节长度依赖性分析。残余力的记录值是通过细胞长度改变（80%）后恢复的初始力（pCa 4.5）计算得出，并归一化至每次长度改变前达到的总稳态力11。残余力的增加通常提示存在解离动力学较慢且刚度较高的横桥。

最后，需要强调的是，该技术可用于从冷冻或新鲜采集的样本中机械分离的去膜心肌细胞，也可用于经酶法分离后进一步进行膜透化的细胞。心肌细胞的分离方式对该技术所得结果具有显著影响。图8展示了三种分离方法之间观察到的差异。

figure-results-1
图1：测试装置的集成示意图。 测试装置包括显微镜、显微操作器及相关计算机。图的底部显示了一个固定在电机和力传感器之间的去膜心肌细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2：细胞分离、透化与固定实验流程图。 左上角图像由4张图片组成，显示了心脏样本在RELAX-ISO溶液中的不同阶段：（A）在培养皿中，（B）在用于组织机械匀浆的离心管中，（C）匀浆器，（D）组织匀浆后的即时状态，以及（E）用于Triton透化的离心管中。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：去膜心肌细胞长度和肌节长度的测定 肌节长度为时的细胞长度和宽度测定 ≈2.2 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：长度依赖性激活实验方案（体外模拟Frank-Starling机制）。 在将心肌细胞从A阶段（1.8 µm）拉伸至2.2 µm后（B），基于肌丝Ca2+敏感性实验所获得的代表性张力曲线及衍生参数。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
图5：肌丝对Ca2+敏感性实验方案。 典型的张力曲线及其衍生参数。为简化起见，仅展示8条张力曲线中的3条，分别为使用Ca2+浓度饱和溶液、中等浓度溶液和最低浓度溶液（pCa值分别为4.5、5.6和6.0）激活的心肌细胞所记录的曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-6
图6：小鼠心肌细胞在不同钙浓度溶液中激活的代表性曲线及其相应的ktr拟合曲线。 (A) pCa 4.5；(B) pCa 5.0；(C) pCa 5.2；(D) pCa 5.4；(E) pCa 5.6；(F) pCa 6.0，以及总张力、被动张力和主动张力的E值、ktr值和ktr拟合的R平方值。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-7
图7：被动张力 Tpassive（A）和主动张力 Tactive（B）与肌节长度关系的实验方案。 在单个心肌细胞中，计算了肌节长度从 1.8 µm 到 2.3 µm 范围内的被动张力和主动张力。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-8
图8：从新鲜组织机械分离的心肌细胞的代表性结果"新鲜"）和冻存的心肌样本（"冷冻"）以及经胶原酶消化心脏（改良Langendorf法）并随后用Triton进行透化处理"胶原蛋白+Triton"). （的值A总张力，（B) 主动张力与（C) 在肌节长度为 时，用 pCa 4.5 溶液激活心肌细胞产生的被动张力 ≈2.2 µm. (D钙敏感性曲线及相应的值（EpCa50 和（FnHill。G残余力与（H在最大激活溶液（pCa 4.5）下计算得到的ktr值。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充文件。 请点击此处下载该文件。

储存温度储备液[M]终体积 (mL)质量/体积备注
4°C氢氧化钾 (KOH)11005.611 g用于调节 pH
4°C氢氧化钾 (KOH)55014.03 g用于调节 pH
4°CBES15010.66 g
4°C丙酸11007.483 mL使用 5 M 或 1 M KOH 将 pH 调至 7.0
4°CCaEGTA 组成如下：0.1100混合后于 60°C 加热超过 1 小时，用 1 M KOH 将 pH 调至 5–6。
- CaCO30.11.001 g
- Titriplex (EGTA)0.13.804

表1：储备液配制说明。

RELAX-ISO（用于心肌细胞分离）[mM]重量
Na2ATP5.953.28 g
MgCl2.6H2O6.041.23 g
Tritiplex (EGTA)20.76 g
KCl139.610.41 g
Imidazole100.68 g

表2：Relax-ISO溶液配制说明。

激活溶液（用于测量）[mM]重量 / 体积
Na2ATP5.970.823 g
MgCl 1M6.281.57 mL
丙酸40.6410.16 mL
BES10025 mL
CaEGTA（先前配制的储备液）717.5 mL
Na2PCr14.50.925 g

表3：激活液配制说明。

松弛溶液（用于测量）[mM]重量 / 体积
Na2ATP5.890.325 g
MgCl 1M6.480.65 mL
丙酸40.764.08 mL
BES10010 mL
Titriplex (EGTA)6.970.265 g
Na2PCr14.50.370 g

表4：松弛液配制说明。

pCa = -Log [Ca2+]松弛状态 (pCa=9.0)
mL		激活状态 (pCa=4.5)
mL
50.8639.14
5.11.238.80
5.21.5438.46
5.3238.00
5.42.5137.49
5.53.1436.86
5.63.8936.11
5.74.835.20
5.85.8934.11
5.97.1432.86
68.5731.43

表5：pCa溶液配制说明。

参数啮齿类猪人
主动张力，kN·m-2 （在 2.2 µm 时）17 – 2819 – 4019 – 36
被动张力，kN·m-2 （在 2.2 µm 时）3.6 – 5.51.9 – 6.81.8 – 2.3
pCa505.58 – 5.645.40 – 5.505.43 – 5.82
nHill2.60 – 2.762.95 – 3.362.99 – 3.10
ktr，s-14.00 – 8.001.00 – 3.000.90 – 2.00

表6：从啮齿类动物、猪和人类的单个透化心肌细胞中获得的典型参数和指数。 改编自12。

问题可能原因解决方案
心肌细胞在最大激活过程中脱落粘附时间不足；胶水过期或已干燥延长粘附步骤的时间；考虑开启一支新的胶水。
细胞悬液中含有无法再去除的Triton®重复提取步骤，增加一至两次Triton®洗涤步骤
在对照条件下心肌细胞产生的力较低提取过程出错，导致细胞质量差增加样本量并重新进行提取。若问题持续存在，可能是样本采集不当所致——弃用该样本
细胞明显收缩但未记录到力；细胞产生异常的力值力传感器未开启将其打开
力传感器校准不准确使用一组已知重量校准力传感器（参考制造商的操作手册）。
力传感器针头松动使用Crystal Bond 509或珠宝商蜡重新粘合针头。
条纹图案不够清晰，无法确定肌节长度光照不足增强显微镜光源，或将细胞移回盖玻片处重新评估肌节长度（孔板区域光照强度较低）
提取过程出错，导致细胞质量差增加样本量并重新进行提取
两根针尖不在同一平面上使用显微操作器上下调节针尖位置，直至观察到清晰聚焦的肌节
采集过程中无长度和/或力的变化电机或力传感器未开启将其开启
电机损坏，无法引起细胞缩短更换电机，或尝试使用函数发生器进行校准
采集记录中噪声过大设备周围气流过强避免设备受到直接气流影响
设备周围振动过多建议使用稳定平台。即便如此，也应移除任何可能带有压缩机或产生振动的设备（如冷冻机、冰箱）
Ca2+敏感性曲线出现异常值，且力值不随[Ca2+]升高而增加激活液与松弛液的混合不充分（参见方法部分3.10至3.14步骤，可能因混合不充分所致）将相同浓度的试剂瓶解冻后，将所有内容物收集至同一烧杯中，用搅拌器充分混合后再分装。在新的细胞上重新测试这些溶液。若问题仍未解决，则重新配制一批含Ca2+的溶液

表7：故障排除表。

讨论

利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估，是一种重要的技术，可用于阐明心肌细胞在生理（如牵张）和病理（如缺血）条件下发生的变化。该方法具有多种优势，例如仅需少量心肌组织即可评估解冻样本中心肌细胞的功能；可使用来自多种物种（小鼠13、大鼠1,14,15、兔16、猪17、狗18、豚鼠19和人类20）以及不同心脏部位（包括心房、左心室和右心室，或梗死心脏的特定区域）的心肌细胞。此外，该技术能够在维持调节和收缩结构天然构象的同时，精确控制Ca2+和能量（ATP）的浓度并测量其功能。

尽管该技术较为简单，但仍有一些关键步骤。从样本采集开始，必须确保每一步骤的质量。肌原纤维蛋白易受蛋白酶降解21因此，样本采集后必须立即存放在液氮中。未经过冷冻的新鲜样本会产生显著更高的力量，因此不建议在同一实验方案中混合使用新鲜样本和冷冻样本的测量结果。第二个最关键的步骤是心肌细胞的提取。在此过程中，大部分时间都必须将样本保持在冰上。提取和透化期间可使用蛋白酶抑制剂混合物以降低蛋白质降解的风险。22第三，应使用精确的手术刀操作将样本切成更小的片段，因为若忽略此步骤，我们观察到心肌细胞的质量会下降。另一个关键步骤是心肌细胞的洗涤，因为很难在洗去Triton（可使细胞膜通透但会促进细胞解离）与尽可能保留细胞完整性之间达到理想的平衡 尽可能多地保留上清液中的细胞。对于每种样本、物种或实验方案，应首先尝试确定提取条件和洗涤次数。例如，根据我们的经验，ZSF1肥胖大鼠组织提取物具有以下特点： "脂肪的" 方面，这使得细胞在粘附过程中更加光滑，但并未增加测量难度。我们通过增加实验次数，以确保每只动物获得足够数量的细胞，从而克服了这一问题。此外，选择适合粘附的优质细胞至关重要，即应选择具有清晰横纹和合理长度的细胞。如果心肌细胞不具备这些特征，则很可能从针尖脱落或无法产生/仅产生微弱的收缩力。同时，选择适合心肌细胞粘附的胶水也非常重要，需综合考虑粘附所需时间和胶水的粘附效率。在我们的实验中，硅胶（材料表固化速度快（10–15 分钟），且强度足够。最后一步关键操作是在细胞粘附后 5 分钟小心抬起心肌细胞（以避免细胞与盖玻片粘连），并在将其移至孔板前完成此操作（以防止细胞被显微镜载物台拖拽）。 表7 总结了该技术相关的故障排除方法、其根本原因以及解决常见问题的可能方案。

该方法的主要局限性在于，它无法回答所有与肌丝收缩力相关的问题，例如肌丝激活/失活的速度有多快。在体内情况下，心肌细胞收缩需要经历细胞膜去极化、细胞内Ca2+浓度升高及其向肌丝扩散的过程；而在去膜心肌细胞中，当细胞浸入含Ca2+的溶液时，Ca2+可立即扩散至肌丝。这种更快的Ca2+扩散速率将对肌丝激活/失活的分析造成偏差23。

这些实验受到多种因素的影响，包括温度、溶液 pH 值、机械扰动（松弛-重新拉伸与单纯松弛）以及细胞固定方法（针固定与胶粘），这些变量共同导致了文献中关于 ktr 值以及肌节长度依赖性收缩力增强结果的差异4,12。

该技术的未来进展包括在完整而非透化的心肌细胞中进行功能研究。该技术的缺点是依赖于 freshly isolated（未经冷冻）的心肌细胞。另一个虽不直接与本方法相关但可能显著影响实验结果的重要问题是样本冷冻保存的最长时间。具体而言，必须明确肌原纤维在保存期间的降解程度（即冷冻样本可保存多长时间，以确保从提取的心肌细胞获得高质量的功能数据）。

致谢

作者感谢葡萄牙科学技术基金会（FCT）、欧盟、国家战略参考框架（QREN）、欧洲区域发展基金（FEDER）以及竞争力操作计划（COMPETE）对UnIC（UID/IC/00051/2013）研究单位的资助。本项目获得FEDER通过COMPETE 2020——竞争力与国际化操作计划（POCI）的支持，以及由葡萄牙2020合作伙伴关系协议下北葡萄牙区域操作计划（NORTE 2020）资助的DOCNET项目（NORTE-01-0145-FEDER-000003）、通过欧洲区域发展基金（ERDF）资助的NETDIAMOND项目（POCI-01-0145-FEDER-016385），上述项目均获得欧洲结构和投资基金以及里斯本2020区域操作计划的支持。Patrícia Rodrigues由FCT（SFRH/BD/96026/2013）资助，João Almeida-Coelho由波尔图大学/医学院（Universidade do Porto/FMUP）以及欧洲社会基金（FSE-Fundo Social Europeu）、NORTE 2020—北部区域操作计划（NORTE-08-5369-FSE-000024—博士项目）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Sigma34580
腺苷-5’-三磷酸二钠盐水合物（Na2ATP）SigmaA2383
碳酸钙（CaCO3）Merck1.02067.0500
咪唑VWR24720.157
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）Merck1.05833.0250
氯化镁溶液（MgCl2 1M）SigmaM1028
N,N-双(2-羟乙基)牛磺酸（BES）SigmaB9879
磷酸肌酸二钠盐水合物（Na2PCr）SigmaP7936
氯化钾（KCl）Merck1.04936.1000
氢氧化钾（KOH）Merck8.14353.1000
丙酸（C3H6O2）Merck8.00605.0500
硅胶挤压管Marineland31003
三羟甲基氨基甲烷-EGTA（Tritiplex, EGTA）Merck1.08435.0025
Triton® X-100 10%Merck648463
组织匀浆器（GKH GT 电机控制）Terre Haute Glas-col
长度控制器（型号 315C-I）Aurora Scientific
力传感器（型号 403 A）Aurora Scientific
软件 ASI 600AAurora Scientific
软件 VSL（型号 900B）Aurora Scientific
倒置显微镜（IX51）Olympus

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