提出了一种方案,用于合成信息编码的肽寡聚物,以及将这些肽的序列定向自组装成分子阶梯,使用胺和醛作为动态共价反应物对和刘易斯酸性稀土金属三重膨胀作为多功能试剂。
该协议介绍了使用Lewis酸性多角色试剂来规避在信息编码寡聚绞线自组装过程中观察到的动力学陷阱,这种束链由成对的动态共价相互作用介导,模仿了用于互补核酸序列自组装的热循环。原胺单体携带醛和胺吊坠,通过正交保护组进行功能化,用作动态共价反应物对。使用经过修饰的自动肽合成器,通过固相亚单抗合成将主胺单体编码成寡聚糖(肽)链。通过高性能液相色谱 (HPLC) 和电喷雾电一定质谱 (ESI-MS) 进行表征后,序列特异性寡聚物受到刘易斯酸性稀土金属三聚苯的高载荷,这种聚苯酯既可破坏醛电流,又影响反应对平衡,使绞线完全分离。随后,提取了Lewis酸的一小部分,使互补序列特异性链的退火形成信息编码分子阶梯,其特征是基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)。本报告中概述的简单过程绕过了动态共价装配领域常见的动力学陷阱,并为未来设计坚固、复杂的架构提供了平台。
自组装的进展,即小子单元通过热力学驱动途径产生更大的结构的过程,通过利用分子间相互作用(如-堆叠和氢键1、2、3、4),改善了对宏观和超分子纳米结构的控制。特别是,核酸(即多核苷酸)已成为非常通用的纳米结构介质,因为沃森-克里克碱基配对提供的高信息密度允许组装复杂的序列选择性结构4、5。虽然这些瞬态分子间键固有的低强度使亚单元重新排列和纠错,但由此产生的结构往往容易受到热和机械降解6。相反,动态共价相互作用7,8,9,一类共价结合形成反应,在温和的条件下是可逆的或可重新排列的,最近被用来产生复杂的大分子,如阶梯10,11,12,13,笼子14,15,16和堆栈17,报价增加债券强度和稳健的结构。不幸的是,这些共价物种的重新排列率相对较低,削弱了它们自组装成所需产品的能力18。为了解决这种动力学捕获,催化剂或苛刻的反应条件通常与简单的构建基块结合使用。在这里,我们报告一个绕过动力学陷印的过程,使分子阶梯能够从序列特异性寡聚物中自组装,其中杂交由寡聚物残留序列中编码的信息引导。
鉴于其合成可访问性,聚(N-替代甘氨酸)(即,肽)被用作寡聚前体,分子阶梯从中组装19。肽是肽的结构构体,其中吊坠组被固定在骨干的氮气上,而不是与β-碳20耦合。使用固相合成,沿peptoid链的动态共价吊坠组的精确放置很容易实现,允许设计前体寡聚物,可以组装成复杂的超分子结构21。
在这一过程中采用了imine连接的动态共价重排,因为imine产生的冷凝反应提供了一种方便的方法来描述通过质谱仪来描述自组装,因为形成的每个键都会导致质量减少18 g/mol22。此外,通过改变酸浓度,可以改变胺和醛反应物和imine产物之间的平衡。具体来说,稀土金属三聚苯乙烯用于影响平衡,并另外去保护乙烯乙醛保护23,24,25。值得注意的是,三聚苯乙烯已经广泛应用于动态共价自组装领域,包括它最近在室温26、27下帮助合成共价有机框架(COFs)方面的成功。此外,寡聚物(peptoid)序列和稀土金属三聚苯酯的对比溶解度通过液体-液体萃取实现平衡控制。所报告的过程利用这种控制来规避阻止信息导向自组装的动力学障碍。
此处的技术描述了信息承载肽寡聚物的动态共价组装,其中信息按其吊坠组的顺序进行编码。在自组装反应期间,使用 Alloc 保护胺单体与乙烯乙醛保护醛单体结合使用,允许正交脱保护,使 Aloc 在自组装反应期间对珠子和乙醛脱保护在原位,从而确保合成的序列在寡聚物纯化和表征之前不会过早反应。重要的是,固相合成使用光实验室树脂进行,使在紫外线或紫光照射下从珠子中分离,从而阻止酸碱基乙烯乙醛基保护组过早解除保护。可以考虑若干备选的取消保护计划。例如,我们最初采用双酸-乙酰胺保护组(Boc-amine和乙烯乙醛),目的是在原位脱保护,然后用强酸进行中和,以便进行自组装反应;然而,这种方法导致在增加基地后立即产生沉淀物。或者,使用光碱保护组2-(2-硝基苯基)丙氧碳基(NPPOC)保护胺,在纯化前使用三氟乙酸(TFA)进行治疗时,可选择性地取消甲醛的保护。不幸的是,用紫外光保护组的原位光解没有提供定量的解保护,即使在光敏剂的存在和延长辐照期25之后。三甲基乙氧基(即Teoc)可用作胺保护组,使用稀土金属三聚苯乙烯处理后可进行裂解;然而,定量的Teoc脱硫需要比乙烯乙醛脱保护所需的更高的稀土金属三重膨胀荷载。对于此协议,可以使用 Teoc-amine,但必须相应地调整 Lewis 酸浓度,因为亚定量胺脱保护可能对较大的自组装结构造成问题。脂肪功能组被简要考虑,但去保护脂肪醛需要苛刻的条件,截流肽序列32,33。
将 Neee 和 Nma 作为惰性间隔残留物,有助于提高寡聚物溶解度,并使前体寡聚物的方便质量标记能够通过质谱法随时识别生成的物种。此外,鉴于peptoid的”+-strand”构象,相邻的骨干段采用相反的旋转状态,形成线性、无扭曲的寡聚物34,35,结合交替动态共价和惰性间隔残留物的序列有助于形成一种结构,其中反应吊坠组朝向同一方向。鉴于副单体方法的多功能性,可以使用大型和多样化的初级胺库来进一步修改肽寡聚物,但可能需要对协议进行调整以保持高耦合效率。
寡聚物(肽)可以在玻璃反应容器19中手动合成,而工艺的自动化将每次添加的残留物的时间从几个小时缩短到半小时。此外,自动化减少了单体和洗涤溶剂废物的数量,在使用非商业用的初级胺单体时尤其可取。虽然从受保护胺残留物中的阿洛克裂解是一种有效反应,但氧化氧化会导致不完全脱保护。因此,建议用ESI-MS测试一部分树脂的分块,并描述脱保护的程度。对于测试裂解,在 405 nm 辐照下 30 分钟释放足够的聚类光谱。部分脱保护可以通过使用厌氧条件或重复脱保护反应加以限制。
本文重点介绍Sc(OTf)3作为多功能试剂,其他稀土金属三重膨胀剂,如二聚苯并重,已证明能够成功地调解分子梯的信息导向组装。值得注意的是,Sc(OTf)3是稀土金属三度膨胀中最酸性的;因此,由于其他稀土金属三酯24、36的催化能力降低,可能需要更大的等价物才能实现完全乙烯乙醛脱保护和绞线分离。所需的等效数量可以通过观察点通过MALDI质谱来确定,这些点在此时股完全分离。分离在自组装过程中至关重要,类似于在升高温度下核酸链的熔化。随后的催化剂提取能够形成和破坏动态共价配对,推动序列特异性双工的组装。寡寡头链的这种逐渐退火可规避其他方法经历的动力学陷印(对于分子阶梯,可以产生注册外物种或错误配对序列)。
氯仿是一种优良的溶剂,因为这里使用的氯仿/乙酰乙酸/水三元系统中的相分离促进刘易斯酸的部分萃取,而不会造成自组装结构的沉淀37。此外,氯仿是少数在保持分子阶梯溶解性的同时促进胺形成的溶剂之一。由于系统的动态特性,通常可以观察到大量未注册和未正确配对的双工。虽然该系统基本上不受稀土金属三聚物萃取时小变化的影响,但有时催化剂提取不足会产生相当一部分不完整的杂交和非特异性寡聚子联轴器。在这种情况下,通常最好先重新分离另外1.5个等效的催化剂,然后第二次提取,而不是立即重新提取,因为单股的完全分离对过程至关重要。要同时组装几个独特的信息编码分子梯,可能需要增加用于维持等效物和总反应量的稀土金属三聚苯酯溶液的浓度。
虽然这些自组装主要以质谱为特征,但其他技术,包括荧光共振能量转移 (FRET) 是可能的。限制包括所需材料的数量、单体的可负担性和信噪比。需要溶剂的技术,如1HNMR,可能还受到自组装结构的溶解性的影响。此外,稀土金属三聚苯二酯浓度萃取后可通过ICP-MS或19FNMR等内部标准测定。
随着在改进对宏观和超分子纳米结构和材料的控制方面取得进展,设计和制造常规但可修改的组件的挑战随之而来。本报告中描述的协议提供了一个途径,通过动态共价相互作用,通过序列选择性组件实现这种纳米结构。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了美国能源部、科学办公室、基础能源科学局#DESC0012479奖的支持。S.C.L.感谢国家科学基金会研究生研究奖学金计划的支持,A.F.A.感谢阿布扎比国家石油公司(ADNOC)的支持。
1,4-Dioxane | Fisher Scientific | D1114 | Certified ACS |
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA) | Millipore-Sigma | 54793 | Matrix substance for MALDI-MS; ≥99.5% |
4-(2-Aminoethyl)aniline | Ontario Chemicals | A2076 | 98% |
4-Cyanobenzaldehyde | Oakwood Chemical | 049317 | 99% |
4-Methylpiperidine | TCI America | P0445 | ≥98.0% |
4-Toluenesulfonyl chloride | Oakwood Chemical | BR1703 | 99% |
50 mL High Performance Centrifuge Tubes | VWR International | 21008-240 | Centrifuge Tubes used for automated synthesizer |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | Glacial |
Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10 | Certified ACS |
Acetonitrile | Millipore-Sigma | 34851 | For HPLC; Gradient grade; ≥99.9% |
All-plastic Norm-Ject syringes | Thermo Fisher Scientific | S7510-10 | Luer-Slip Syringe |
Allyl chloroformate | Acros Organics | 221741000 | 97% |
Bromoacetic acid | Alfa Aesar | A14403 | ≥98.0% |
Chloroform | Millipore-Sigma | 288306 | Anhydrous; ≥99%; Contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
Chloroform-d | Acros Organics | AC320690075 | For NMR; 99.8 atom % D; Packaged in 0.75 ml ampoules |
Dichlorodimethylsilane | Acros Organics | 1133100 | ≥99.0% |
Dichloroethane | Fisher Scientific | E175 | Certified ACS |
Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-4 | Stabalized; Certified ACS |
Diethyl ether | Acros Organics | 615080010 | Anhydrous; ACS reagent |
Diethylene glycol monoethyl ether | TCI America | E0048 | ≥99.0% |
Ethanol | Decon Labs | 2701 | 200 Proof; Anhydrous |
Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178 | Certified |
Fmoc-Photolabile SS resin | CreoSalus | SA50785 | 100-200 mesh; 1% DVB |
Glass Peptide Vessel | Chemglass | CG-1866-02 | Solid Phase, T-Bore PTFE Stpk, Vacuum, Medium Frit, GL 25 Thread |
LC-6AD HPLC pumps | Shimadzu Corporation | Equipment | |
LED 405nm | ThorLabs | M405L2-C1 | 405 nm LED used for photocleavage of peptoid |
LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | Driver for LED light used in photocleavage of peptoid |
Liberty Blue Automated Peptide Synthesizer | CEM Corporation | Equipment | |
Lithium aluminum hydride | Millipore-Sigma | 199877 | Powder; Reagent grade; 95%; CAUTION: Mildly pyrophoric, handle under inert gas and protect from moisture |
Luna C18 analytical RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4252-E0 | Equipment |
Luna C18 prepatory RP-HPLC column | Phenomenex | 00G-4253-P0-AX | Equipment |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | Certified ACS |
Microliter Syringe | Hamilton Company | 80700 | Cemented Needle (N) |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) | Oakwood Chemical | M02889 | ≥99.0%; CAUTION: DIC is hazardous to eyes, skin, via respiratory inhalation, and may cause skin sensitization |
N,N-Dimethylformamide | Millipore-Sigma | 319937 | ACS reagent; ≥99.8% |
Nitric acid | Fisher Scientific | A200-212 | Certified ACS Plus |
Nitrogen gas | Cryogenic Gases | Contents under pressure, may explode if heated | |
Phenylsilane | Oakwood Chemical | S13600 | 97% |
Prominence SPD-10A UV/vis Detector | Shimadzu Corporation | Equipment | |
p-Toluenesulfonic acid monohydrate | Millipore-Sigma | 402885 | ACS reagent; ≥98.5% |
Scandium(III) triflate | Oakwood Chemical | 009343 | 99% |
Single-use Needle | Exel International | 26420 | 18G x 1 1/2″ |
Sodium azide | Oakwood Chemical | 094448 | 99%; CAUTION: NaN3 may react with lead and copper which results in the formation of highly explosive metal azides. It is acutely toxic and fatal if swallowed or in contact with skin. |
Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Powder; Certified ACS |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | Pellets; Certified ACS |
Sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | Anhydrous; Granular; Certified ACS |
Syringe Filter 0.45 µm | VWR International | 28145-497 | PTFE, Syringe Filters with Polypropylene Housing |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | T397 | Certified |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium(0) | Oakwood Chemical | 034279 | 98% |
Toluene | Fisher Scientific | T324 | Certified ACS |
Triphenylphosphine | Oakwood Chemical | 037818 | 99% |