信息承载Peptoids及其序列定向动态共价自组装的合成

Summary

提出了一种方案，用于合成信息编码的肽寡聚物，以及将这些肽的序列定向自组装成分子阶梯，使用胺和醛作为动态共价反应物对和刘易斯酸性稀土金属三重膨胀作为多功能试剂。

Abstract

该协议介绍了使用Lewis酸性多角色试剂来规避在信息编码寡聚绞线自组装过程中观察到的动力学陷阱，这种束链由成对的动态共价相互作用介导，模仿了用于互补核酸序列自组装的热循环。原胺单体携带醛和胺吊坠，通过正交保护组进行功能化，用作动态共价反应物对。使用经过修饰的自动肽合成器，通过固相亚单抗合成将主胺单体编码成寡聚糖（肽）链。通过高性能液相色谱 （HPLC） 和电喷雾电一定质谱 （ESI-MS） 进行表征后，序列特异性寡聚物受到刘易斯酸性稀土金属三聚苯的高载荷，这种聚苯酯既可破坏醛电流，又影响反应对平衡，使绞线完全分离。随后，提取了Lewis酸的一小部分，使互补序列特异性链的退火形成信息编码分子阶梯，其特征是基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）。本报告中概述的简单过程绕过了动态共价装配领域常见的动力学陷阱，并为未来设计坚固、复杂的架构提供了平台。

Introduction

自组装的进展，即小子单元通过热力学驱动途径产生更大的结构的过程，通过利用分子间相互作用（如-堆叠和氢键^{1、2、3、4），}改善了对宏观和超分子纳米结构的控制。特别是，核酸（即多核苷酸）已成为非常通用的纳米结构介质，因为沃森-克里克碱基配对提供的高信息密度允许组装复杂的序列选择性结构^4、5。虽然这些瞬态分子间键固有的低强度使亚单元重新排列和纠错，但由此产生的结构往往容易受到热和机械降解^6。相反，动态共价相互作用^7，8，9，一类共价结合形成反应，在温和的条件下是可逆的或可重新排列的，最近被用来产生复杂的大分子，如阶梯10，11，12，13，笼子14，15，16和堆栈^17，报价增加债券强度和稳健的结构。不幸的是，这些共价物种的重新排列率相对较低，削弱了它们自组装成所需产品的能力^18。为了解决这种动力学捕获，催化剂或苛刻的反应条件通常与简单的构建基块结合使用。在这里，我们报告一个绕过动力学陷印的过程，使分子阶梯能够从序列特异性寡聚物中自组装，其中杂交由寡聚物残留序列中编码的信息引导。

鉴于其合成可访问性，聚（N-替代甘氨酸）（即，肽）被用作寡聚前体，分子阶梯从^{中组装19。}肽是肽的结构构体，其中吊坠组被固定在骨干的氮气上，而不是与β-碳²⁰耦合。使用固相合成，沿peptoid链的动态共价吊坠组的精确放置很容易实现，允许设计前体寡聚物，可以组装成复杂的超分子结构^21。

在这一过程中采用了imine连接的动态共价重排，因为imine产生的冷凝反应提供了一种方便的方法来描述通过质谱仪来描述自组装，因为形成的每个键都会导致质量减少18 g/mol^22。此外，通过改变酸浓度，可以改变胺和醛反应物和imine产物之间的平衡。具体来说，稀土金属三聚苯乙烯用于影响平衡，并另外去保护乙烯乙醛保护23，24，25。值得注意的是，三聚苯乙烯已经广泛应用于动态共价自组装领域，包括它最近在室温^26、27下帮助合成共价有机框架（COFs）方面的成功。此外，寡聚物（peptoid）序列和稀土金属三聚苯酯的对比溶解度通过液体-液体萃取实现平衡控制。所报告的过程利用这种控制来规避阻止信息导向自组装的动力学障碍。

Protocol

注意:本议定书中使用的几种化学品具有腐蚀性、易燃性或毒性，只能在化学烟气罩下使用。使用前请使用适当的个人防护设备，并查阅所有相关的安全数据表 （SDS）。

1. 单体合成

注:初级胺是根据已公布的方法合成的。

1. 合成 4-（2-氨基）-N-（铝氢氧）苯胺（Npam）^25，28
   1. 将 4-（2-氨基）苯甲酸的 5.0 g （36.7 mmol） 添加到 150 mL 的 10% 醋酸（水溶液，v/v）。
      注:使用弱酸可选择性地保护芳香胺，而不会影响脂肪胺，因为两组之间的pK_值差异很大。
   2. 在150 mL的1，4-二恶烷中制备4.9克（40.4毫摩尔;1.1等值）的基联氯二酯溶液。
   3. 将溶液组合在配有磁性搅拌棒的 500 mL 圆形底瓶中，并在室温下搅拌反应混合物过夜。
   4. 要处理反应，用 500 mL 的去离子 （DI） 水稀释，然后用二乙醚（Et₂O，300 mL = 3）清洗。丢弃有机馏分。
   5. 通过添加 2 M NaOH（水溶液）将水相调整到 pH 14，然后用 Et₂O （150 mL = 3） 萃取。
   6. 结合有机馏分，用DI水（150 mL = 3）洗涤。
   7. 干燥在Na₂SO_4，然后过滤。
   8. 在减压下蒸发至干燥。
   9. 通过核磁共振（NMR）光谱确认分离产物Npam的身份。预期结果如下: ¹H NMR （500 MHz， CdCl₃） = =7.31 （d， J = 8.0 Hz， 2H， Ar）， 7.14 （d， J = 8.5 Hz， 2H， Ar）， 6.65 （s， 1H， --NH-）， 6.04 = 5.89 （米， 1H， --CH+ CH_2），5.36 （ d， J， Ar， J = 17.1， 1.6 Hz， 1H， -CH=Ch=ChHH）， 5.26 （dq， J = 10.5， 1.4 Hz， 1H， -CH=CH=H），4.66 （dt， J = 5.8， 1.5 Hz， 2H， -CH₂-CH+CH₂）， 2.94 （t， J = 6.8 Hz， 2H， -H ₂-NH₂）， 2.70 （t， J = 6.8 Hz， 2H， -CH₂-Ar）， 1.04 （s， 2H， -CH₂-NH₂）¹³C NMR （125 MHz， CD₃OD） = =: 154.85， 137.00， 134.98， 133.51， 129.36， 119.41， 116.92， 65.62， 59.89， 43.47， 38.72。
      注:该产品为浅黄色固体，总收率为69%。使用产品无需进一步纯化。
2. 合成 4-（1，3-二恶英-2-yl） 苯甲酸酯^29，30
   1. 在200 mL的甲苯中溶解25克（0.19摩尔）的4-氰化物。
   2. 加入42.2 mL（0.768毫摩尔;4等值）的乙二醇和0.02克（0.1毫摩尔;0.05摩尔）对反应混合物的苯-p-磺酸。
   3. 使用 Dean-Stark 陷阱（即抗热蒸馏）在 120°C 下搅拌和回流过夜，以去除反应过程中产生的水。
   4. 反应完成后，冷却至室温，加入40 mL 5%NaHCO 3（w/v）水溶液。
   5. 提取有机层，用DI水洗涤三次。
   6. 干燥在Na₂SO_4，然后过滤。
   7. 在减压下蒸发至干燥。
   8. 通过 NMR 光谱法确认分离产品的身份。预期结果如下^:1H NMR （400 MHz， CDCl₃） = =7.67 （d， J = 8.0， 2H， Ar）， 7.59 （d， J = 8.4， 2H， Ar）， 5.84 （s， 1H， CH）， 4.12 - 4.03 （AA+， 4H， （CH₂O）₂。¹³C NMR （100 MHz， CDCl₃） = =143.20， 132.34， 127.30， 118.72， 113.02， 102.56， 65.57。
      注:该产品为白色结晶固体，总收率为86%。使用产品无需进一步纯化。
3. 合成 4-（1，3-二环-2-基）苯胺（Npal）²⁹
   1. 在100 mL无水Et₂O中制备10克（0.057 mol）4-（1，3-二恶烷-2-yl）苯甲酸酯溶液。
   2. 在 0 °C 的圆形底瓶中小心地加入 LiAlH 4 至 100 mL 的 LiAlH₄至 100 mL Et₂O。搅拌以创建一个混合良好的悬架，并使用充满气的气球在惰性气氛下密封系统。在用于称重的设备上小心地用乙醇淬火任何残留的 LiAlH_4。
      注意:氢锂（LiAlH_4）是一种温和的热磷;处理惰性气体，防止潮湿。
   3. 使用添加漏斗或注射器泵缓慢添加 4-（1，3-二氧基环-2-yl）苯甲酸酯溶液，同时保持反应混合物在 0 °C 的温度下。
   4. 在0°C下搅拌反应混合物4小时，在室温下搅拌12小时。
   5. 反应完成后，冷却至0°C，缓慢加入95%乙醇（30 mL）。在水中加入50%乙醇（v/v，20 mL）进一步淬火。气泡可用于监控淬火过程。
      注:根据需要添加额外的无水Et₂O，以保持足够的搅拌速率。
   6. 分离醚上清液，在减压下蒸发至干燥。
   7. 通过 0.45 μm 注射器过滤器过滤产生的机油。
   8. 通过NMR光谱确认分离产品NpaI的身份。预期结果如下^:1H NMR （400 MHz， CDCl₃） =: 7.44 （d， J = 8， 2H， Ar）， 7.32 （d， J = 8， 2H， Ar）， 5.80 （s， 1H， CH）， 4.14 - 4A+BB- 4H， （CH₂O）₂） 3.87 （s， 2H， -CH₂- NH₂）¹³C NMR （100 MHz， CDCl₃） = =144.53， 136.53， 127.16， 126.77， 103.72， 65.39， 46.35。
      注:该产品为黄色油，总收率为70%。使用产品无需进一步纯化。
4. 合成 2-（2-乙氧乙氧基）乙基体甲酸酯^29，31
   1. 在带磁搅拌器的 250 mL 圆形底瓶中加入 20 g （0.15 mol） 的二乙二醇单乙醚和 50 mL 的四氢富兰 （THF）。
   2. 冷却至 0 °C，并使用充满气的气球在惰性环境中密封系统。
   3. 添加 50 mL 的 6 M 水性 NaOH（2 个等值）。
   4. 在80 mL的THF中溶解54克（0.28 mol;2等值）的氯酸盐，并将溶液滴至反应混合物中。在 0 °C 下搅拌 1 小时。
   5. 让反应混合物达到室温，再搅拌一小时。
   6. 用 Et₂O （400 mL） 提取反应混合物。
   7. 用1M NaOH清洗有机层，然后用DI水清洗。
   8. 干燥在Na₂SO_4，然后过滤。
   9. 在减压下蒸发至干燥。
   10. 通过 NMR 光谱确认分离产品的身份。预期结果如下: ¹H NMR （400 MHz， CDCl₃） = =7.78 （d， J = 8.0， 2H， -S-C+CH-C-CH），7.33 （d， J = 8.5， 2H， -S-C+CH-CH）， 4.15 （t， J = 5.0、2H、-CH₂-C_{H 2}-O-Ts）、3.68（t、J = 5.0、2H、CH₂-CH₂-O-Ts）、3.60-3.42（米、6H、O-CH₂-C H₂-O-CH₂-CH_3）、2.43（s、 3H、 C-CH₃）， 1.17 （t， J = 7.0， 3H， O-CH₂-CH₃）¹³C NMR （100 MHz， CDCl₃） = =144.79， 132.95， 130.26， 129.80， 127.90， 126.95， 70.75， 69.68， 69.29， 68.61， 66.57， 21.56， 15.11。
       注:该产品为无色液体，总收率为98%。使用产品无需进一步纯化。
5. 合成 2-（2-乙氧乙氧基）乙基阿齐德^29，31
   1. 用磁性搅拌器将40克（0.14摩尔）的2-（2-乙氧乙氧基）乙酰甲酸酯溶解在250 mL的二甲基甲酰胺（DMF）中。使用充满气态的气球在惰性气体下密封系统。
   2. 将NaN₃中的32克（0.49摩尔;3.5等值）加入反应混合物中。
      注意:称_纳3时不要使用金属铲。NaN₃可能与铅和铜发生反应，导致形成高度爆炸性的金属齐德。如果吞咽或与皮肤接触，则毒性极强，致命。
   3. 将反应混合物加热至60°C，使其运行36小时。然后冷却至室温。
   4. 用大量的水（500 mL）稀释，用Et₂O（150 mL = 3）萃取。
   5. 隔离有机层并进行水浇。
   6. 干燥在Na₂SO_4，然后过滤。
   7. 在减压下蒸发至干燥。
   8. 通过 NMR 光谱确认分离产品的身份。预期结果如下: ¹H NMR （400 MHz， CDCl₃） = =3.64 （米， 4H， O-CH₂-CH₂-O）， 3.58 （m， 2H， N₃-CH 2-C_{H 2}-O）， 3.51 （q， J = 7.5， 2H， O-CH₂-CH₃）， 3.38 （t， J = 5.0， 2H， N₃-CH₂-CH₂-O）， 1.19 （t， J = 7.5， 3H， O-CH₂-CH₃）¹³C NMR （100 MHz， CDCl₃） =70.70， 69.97， 69.80， 66.63， 50.60， 15.08。
      注:该产品为黄色液体，总收率为85%。使用产品无需进一步纯化。
6. 合成 2-（2-乙氧）乙胺（尼）^29，31
   1. 用磁性搅拌器将20克（0.13摩尔）的2-（2-乙氧乙氧基）乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙酰乙基乙酰乙酰乙酰乙基在500 mL圆形底瓶中溶解。
   2. 加入40克（0.15摩尔，1.1个等值）的三氯苯酚，在室温下搅拌过夜。
   3. 用水（220 mL）将反应混合物淬火，让它再搅拌一天。
   4. 用甲苯清洗所得溶液，然后用二氯甲烷（DCM）清洗。
   5. 在真空下蒸发水层。
   6. 通过NMR光谱确认分离产品Neee的身份。预期结果如下: ¹H NMR （400 MHz， CDCl₃） == : 3.62-3.42 （m， 8H， NH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₃）， 2.82 （米， 2H， NH₂-CH₂-CH₂-O - O - O - O - Ch 3 ）， 1.48 （s， 2H， NH₂）， 1.16 （t， J = 7.5， 3H， O-CH₂-CH₃。¹³C NMR （100 MHz， CDCl₃） + = 73.14， 70.72， 69.64， 66.45， 41.35， 15.00。
      注:该产品为黄色液体，总收率为58%。使用产品无需进一步纯化。

2. 寡聚物的固相亚单抗合成（肽）

注:采用亚单体方法进行固相合成（SPS），因为它能够生产具有高耦合效率的序列特异性寡聚物。自动肽合成器被调整成快速产生寡聚物（肽）。设置可能需要修改不同的检测。

1. 制备
   1. 重量为 0.125 g 的 Fmoc-光实验室 SS 树脂（0.8 mmol/g 典型负载、0.1 mmol 刻度、100-200 网格、1% DVB），并添加到一个熔融的自动合成器反应容器中。将容器插入合成器的微波部分。
   2. 在主溶剂瓶中用DMF和脱保护瓶中填充20%的4-甲基苯丙胺（v/v）。空废物。
   3. 在DMF中制备1M溴乙酸和N，N'-二丙丙二溴二酯（DIC）溶液，总体积为1.5 mL Ω（按顺序排列的残留物数量）=5 mL。额外的 5 mL 可确保没有空气进入机器。向 DMF 添加 0.47 mL 的醋酸氢化物，以制作 5 mL 封盖溶液。
      注意:DIC可引起严重的眼部损伤、皮肤刺激和致敏，以及呼吸道刺激和致敏。
   4. 在用于置换步骤的N-甲基-2-丙酮（NMP）中制备每种原胺（Npam、Npal、Neee和Nma（2-甲氧乙酰胺）的0.5M溶液。初级胺溶液的总体积应为2.5 mL Ω（适当原发胺的残留物数）=2.5 mL。
   5. 将所有解决方案添加到自动合成器歧管中。
2. 合成
   注:使用自动肽合成器执行。
   1. 在室温下用 10 mL DMF 将树脂膨胀 5 分钟。排空反应容器。
   2. 在75°C下用3mL的20%4-甲基丙氨酸溶液，在75°C下30s，在90°C下90s切下Fmoc组。排空容器。重复。用 DMF 清洗（2 mL = 2）。
   3. 向容器添加1.5 mL的溴乙酸溶液和1.5 mL的DIC溶液。在75°C下加热反应4.5分钟，以执行溴乙酰化反应。清洗树脂（5 mL DMF = 3）。
   4. 在反应容器中加入2.5 mL原胺单体溶液，执行位移反应。在 75°C 加热 4.5 分钟洗涤树脂（5 mL DMF = 3）。
   5. 重复步骤 2.2.3。和2.2.4。而按顺序替换步骤 2.2.4 中使用的主胺单体。以序列特定的方式生长寡聚物链。
   6. 在最后排量步骤后，通过添加2.5 mL的醋酸氢化物溶液和2 mL的DIC溶液来盖住序列。在 50°C 加热 2 分钟，清洗树脂（5 mL DMF = 6）。
   7. 将树脂转移到装有三向止路器的玻璃反应容器。玻璃反应容器应事先进行硅化，以防止珠子粘附在墙壁上。将壁填充在二氯甲烷（DCE）（v/v）溶液中的5%二氯二甲基硅烷到顶部，让它坐30分钟。排空容器，用DCE和甲醇清洗。使用前使用干玻璃容器。
   8. 用 DCM（5 mL + 3）清洗树脂，用 N₂通过一只手臂冒泡，用另一只手臂拉真空。
   9. 干燥和储存树脂和附着的寡聚物（肽），直到脱保护和裂解。
3. 脱脂胺和树脂裂解
   1. 如果树脂已储存超过一天，则用 5 mL 的 DMF 冒泡10分钟，使树脂重新膨胀。然后排空容器，并添加一个小磁搅拌棒。
   2. 在玻璃肽容器中加入3 mL干DCM。
   3. 称量0.1等效的四基（三苯磷酸）和25等效苯基兰每个阿洛克组。使用夹子将反应容器定位在搅拌板上方的角度，使树脂在保持悬浮在溶剂中时经历温和的搅拌。为防止 DCM 蒸发，盖住反应容器。
   4. 1 小时后，过滤掉溶液，用 DCM（3 × 5 mL）清洗树脂。
   5. 重复步骤 2.3.2。和2.3.3。
   6. 用甲醇和 DCM 按顺序冲洗树脂两次。
   7. 将树脂和磁搅拌棒转移到 20 mL 小瓶中。
   8. 在 DMF 中浸入树脂，在辐照下搅拌和开结 36 小时，约25 mW.cm -2，405 nm。在此步骤之前，可以在 ESI-MS 中对一小部分树脂进行切块和特征化，以确保完全消除胺的解保护。如果任一 Alloc 组仍然存在，请重复步骤 2.3.2 和 2.3.3。
   9. 通过注射器过滤器从树脂中分离解放寡聚子（肽）。在真空下去除溶剂。
4. 寡聚物的纯化和表征（肽）
   1. 在50/50水/醋酸酯混合物中重组肽。
   2. 使用反相准备 HPLC （C18） 进行净化。结合纯化的馏分、冷冻和冻干，产生白色粉末。粉末可以储存以供进一步使用。
   3. 纯化后使用 ESI-MS 进行分析。
   4. 在反射子正电子模下执行MALDI质谱。将样品溶液的2μL（1 mM）与10mg基质[2-（4-羟基苯甲酸）苯甲酸（HABA）]混合物6μL，在200μL的醋酸中混合。在 MALDI 样品板上点，并允许空气干燥。
   5. 为纯度，执行纯化寡聚物（肽）的分析HPLC。

3. 序列选择性梯自组装

1. 通过分离/提取/退火进行自组装
   1. 准备用于自组装的每个寡聚物（肽）序列的10 mM库存溶液，以及无水乙酰乙酰三聚苯乙烯（Sc（OTf）3）的10mM库存溶液。
   2. 在装有磁性搅拌棒的 3 mL 小瓶中，添加每个肽汤溶液 20 μL。从库存溶液中每潜在 imine 债券添加 1.5 eq 的 Sc（OTf）_3。加入足够的水和醋酸酯，形成200μL 2%的水/醋酸溶液。
   3. 在70°C下轻轻搅拌2小时，用于乙醛脱保护和所有链的解构。
   4. 用200μL的氯仿和2 mL的水为小瓶充电。轻轻摇动。
   5. 让混合物站立（至少15分钟），在完全相分离后，用微升注射器提取有机层。
   6. 在70°C的新小瓶中搅拌，用于寡果退火，通常6小时梯杂交也可在室温下进行，但时间更长。
2. 自组装物种的特征
   1. 在步骤 3.1.3.、3.1.5.和 3.1.6 之后对反应混合物溶液执行 MALDI-TOF 质谱。以监测反应。如果杂交不完整，从股票溶液中每潜在 imine 键添加 1.5 eq 的 Sc（OTf）_3，并重复步骤 3.1.3-3.1.6。直到完成。
   2. 在稳定的氮流下干燥样品，并在1 mL的2%硝酸（水溶液，v/v）中重组。用HPLC水稀释4×10⁶倍。使用电感耦合等离子体质谱法 （ICP-MS） 确定提取后钠浓度。

Results

为了证明信息编码肽进行序列选择性动态共价自组装到分子阶梯的能力，一个代表性链_，H2N-Npam-Neee-Neee-2-Npam-Nma，与其互补的肽序列进行合成和杂交。单体Npam和Npal（以¹个H NMR（500 MHz）为特征，图1）作为动态共价反应对，与Neee帮助最终自组装产品的溶解性。此外，将商用 Nma 单体合并使两个互补序列之间的质量差异成为可能。在固体相亚单体合成完成后，与Pd（PPh_3）4一起移除了分配组。在去保护前后，树脂的某些部分在405 nm光下被斩结，其特点是ESI-MS（图2）。该序列通过制备HPLC进行纯化，冻干以达到白色粉末，并通过分析HPLC确认纯度（图3）。寡聚物（peptoid）随后被杂交其互补序列，H₂N-Npal-Neee-Nam-Neee= 2-Npal，以支付由MALDI-MS确认的注册阶梯（图4）。

图1:单体合成方案和¹个H-NMR光谱。（A）具有试剂和条件的单一体合成方案:（一）亚联氯二醇、10%水性醋酸、1、4-二恶烷、室温、过夜;（二）乙二醇、甲苯-p-磺酸、甲苯、反流、通宵;（iii） LiAlH_4，无水 Et₂O， 0 °C 4 小时， 室温 12 小时;（iv）多氯甲酸，THF，0°C;（v） NaN₃， DMF， 60 °C， 36 h;（六）三烯磷，THF，过夜。（B）单体¹H-NMR光谱（500兆赫，CDCl 3）:（i） 4-（2-氨基）-N-（铝碳氧）苯丙胺（Npam）;（二） 4-（1，3-二环环-2-基）苯丙胺（Npal）;（iii） 2-（2-乙氧基）乙胺（尼）。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:合成和消除序列特异性寡聚子（肽）。（A） H₂N-[Npam-Neee-Npal-Neee]₂- Npam-Nma 的结构在 Alloc 保护组移除之前和之后，并伴有（B） ESI 质量谱。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:信息编码肽的纯化和表征。（A）用乙酰乙酯（MeCN）和水的线性梯度进行预化HPLC的链纯化图:（1） 30%MeCN，0.1-2.1分钟;（2） 30-95% MeCN， 2.1-16.1 分钟;（3） 95% MeCN， 16.1-23.1 分钟;（4） 95%MeCN，23.1-26.1分钟。 峰值i和ii分别对应于低分子量反应副产品，主要是DIC-尿素和包括所需产品的寡聚种。（B）耐冻后H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma的H2N--内帕-内卡的化学质量谱分析_HPLC色谱和（C）ESI质量谱。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:H₂N-[Npam-Neee-Npal-Neee]₂- Npam-Nma 及其互补序列的自组装，H₂N-Npal-Neee-Neee=_2-Npal。（A）两个序列的结构以及生成的序列驱动程序集。（B）分子阶梯的MALDI质量谱在室温下退火过夜。质量: 预期 [M_Na]⁼ = 3306.7，发现 3306.0;预期 [M_{-1 imine}[Na]⁼ = 3324.7，发现 3323.9;预期 [M_{-2 imine} [Na]⁼ = 3342.7，发现 3342.8;预期 [M_{-2 imine} [CH₃OH_H]⁼ = 3352.8，发现 3352.0。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

此处的技术描述了信息承载肽寡聚物的动态共价组装，其中信息按其吊坠组的顺序进行编码。在自组装反应期间，使用 Alloc 保护胺单体与乙烯乙醛保护醛单体结合使用，允许正交脱保护，使 Aloc 在自组装反应期间对珠子和乙醛脱保护在原位，从而确保合成的序列在寡聚物纯化和表征之前不会过早反应。重要的是，固相合成使用光实验室树脂进行，使在紫外线或紫光照射下从珠子中分离，从而阻止酸碱基乙烯乙醛基保护组过早解除保护。可以考虑若干备选的取消保护计划。例如，我们最初采用双酸-乙酰胺保护组（Boc-amine和乙烯乙醛），目的是在原位脱保护，然后用强酸进行中和，以便进行自组装反应;然而，这种方法导致在增加基地后立即产生沉淀物。或者，使用光碱保护组2-（2-硝基苯基）丙氧碳基（NPPOC）保护胺，在纯化前使用三氟乙酸（TFA）进行治疗时，可选择性地取消甲醛的保护。不幸的是，用紫外光保护组的原位光解没有提供定量的解保护，即使在光敏剂的存在和延长辐照期²⁵之后。三甲基乙氧基（即Teoc）可用作胺保护组，使用稀土金属三聚苯乙烯处理后可进行裂解;然而，定量的Teoc脱硫需要比乙烯乙醛脱保护所需的更高的稀土金属三重膨胀荷载。对于此协议，可以使用 Teoc-amine，但必须相应地调整 Lewis 酸浓度，因为亚定量胺脱保护可能对较大的自组装结构造成问题。脂肪功能组被简要考虑，但去保护脂肪醛需要苛刻的条件，截流肽序列^32，33。

将 Neee 和 Nma 作为惰性间隔残留物，有助于提高寡聚物溶解度，并使前体寡聚物的方便质量标记能够通过质谱法随时识别生成的物种。此外，鉴于peptoid的"+-strand"构象，相邻的骨干段采用相反的旋转状态，形成线性、无扭曲的寡聚物^34，35，结合交替动态共价和惰性间隔残留物的序列有助于形成一种结构，其中反应吊坠组朝向同一方向。鉴于副单体方法的多功能性，可以使用大型和多样化的初级胺库来进一步修改肽寡聚物，但可能需要对协议进行调整以保持高耦合效率。

寡聚物（肽）可以在玻璃反应容器¹⁹中手动合成，而工艺的自动化将每次添加的残留物的时间从几个小时缩短到半小时。此外，自动化减少了单体和洗涤溶剂废物的数量，在使用非商业用的初级胺单体时尤其可取。虽然从受保护胺残留物中的阿洛克裂解是一种有效反应，但氧化氧化会导致不完全脱保护。因此，建议用ESI-MS测试一部分树脂的分块，并描述脱保护的程度。对于测试裂解，在 405 nm 辐照下 30 分钟释放足够的聚类光谱。部分脱保护可以通过使用厌氧条件或重复脱保护反应加以限制。

本文重点介绍Sc（OTf）3作为多功能试剂，其他稀土金属三重膨胀剂，如二聚苯并重，已证明能够成功地调解分子梯的信息导向组装。值得注意的是，Sc（OTf）3是稀土金属三度膨胀中最酸性的;因此，由于其他稀土金属三酯^24、36的催化能力降低，可能需要更大的等价物才能实现完全乙烯乙醛脱保护和绞线分离。所需的等效数量可以通过观察点通过MALDI质谱来确定，这些点在此时股完全分离。分离在自组装过程中至关重要，类似于在升高温度下核酸链的熔化。随后的催化剂提取能够形成和破坏动态共价配对，推动序列特异性双工的组装。寡寡头链的这种逐渐退火可规避其他方法经历的动力学陷印（对于分子阶梯，可以产生注册外物种或错误配对序列）。

氯仿是一种优良的溶剂，因为这里使用的氯仿/乙酰乙酸/水三元系统中的相分离促进刘易斯酸的部分萃取，而不会造成自组装结构的沉淀^37。此外，氯仿是少数在保持分子阶梯溶解性的同时促进胺形成的溶剂之一。由于系统的动态特性，通常可以观察到大量未注册和未正确配对的双工。虽然该系统基本上不受稀土金属三聚物萃取时小变化的影响，但有时催化剂提取不足会产生相当一部分不完整的杂交和非特异性寡聚子联轴器。在这种情况下，通常最好先重新分离另外1.5个等效的催化剂，然后第二次提取，而不是立即重新提取，因为单股的完全分离对过程至关重要。要同时组装几个独特的信息编码分子梯，可能需要增加用于维持等效物和总反应量的稀土金属三聚苯酯溶液的浓度。

虽然这些自组装主要以质谱为特征，但其他技术，包括荧光共振能量转移 （FRET） 是可能的。限制包括所需材料的数量、单体的可负担性和信噪比。需要溶剂的技术，如^1HNMR，可能还受到自组装结构的溶解性的影响。此外，稀土金属三聚苯二酯浓度萃取后可通过ICP-MS或^19FNMR等内部标准测定。

随着在改进对宏观和超分子纳米结构和材料的控制方面取得进展，设计和制造常规但可修改的组件的挑战随之而来。本报告中描述的协议提供了一个途径，通过动态共价相互作用，通过序列选择性组件实现这种纳米结构。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-二恶烷	Fisher Scientific	D1114	认证 ACS
2-（4-羟基苯基拉唑）苯甲酸 （HABA）	Millipore-Sigma	54793	MALDI-MS 的基质物质; ≥99.5%
4-（2-氨基乙基）苯胺	安大略省化学品	A2076	98%
4-氰基苯甲醛	奥克伍德化学	049317	99%
4-甲基哌啶	TCI 美国	P0445	≥98.0%
4-甲苯磺酰氯	Oakwood Chemical	BR1703	99%
50 mL 高性能离心管	VWR International	21008-240	用于自动合成器的离心管
	Fisher Scientific	A38-212	冰
醋酸酐	Fisher Scientific	A10	认证 ACS
用于 HPLC 的 Acetonitrile	Millipore-Sigma	34851	;梯度等级;≥99.9%
全塑料 Norm-Ject 注射器	Thermo Fisher Scientific	S7510-10	鲁尔滑针
烯丙基氯甲酸	Acros Organics	221741000	97%
溴乙酸	Alfa Aesar	A14403	≥98.0%
无水氯仿	Millipore-Sigma	288306	; ≥99%;含有 0.5-1.0% 乙醇作为稳定剂
氯仿-d	Acros 有机物	AC320690075	用于 NMR;99.8 原子 % D;包装在 0.75 ml 安瓿瓶中
二氯二甲基硅烷	Acros Organics	1133100	≥99.0%
二氯乙烷	Fisher Scientific	E175	认证 ACS
二氯甲烷	Fisher Scientific	D37-4	稳定;经认证的 ACS
二乙醚	Acros Organics	615080010	无水;ACS 试剂
二甘醇单乙醚	TCI America	E0048	≥99.0%
乙醇	Decon Labs	2701	200 证明;无水
乙二醇	Fisher Scientific	E178	认证
Fmoc-Photo不稳定 SS 树脂	CreoSalus	SA50785	100-200 目;1% DVB
玻璃肽容器	Chemglass	CG-1866-02	固相，T 孔 PTFE Stpk，真空，中等熔块，GL 25 螺纹
LC-6AD HPLC 泵	岛津公司		设备
LED 405nm	ThorLabs	M405L2-C1	405 nm LED，用于类肽
LED 驱动器	ThorLabs	LEDD1B	用于类肽光裂解的 LED 光驱动器
Liberty Blue 自动肽合成仪	CEM Corporation		设备
氢化铝锂	Millipore-Sigma	199877	粉;试剂级;95%;注意：轻微自燃，在惰性气体下处理并防止受潮
Luna C18 分析 RP-HPLC 色谱柱	Phenomenex	00G-4252-E0	设备
Luna C18 制备型 RP-HPLC 色谱柱	Phenomenex	00G-4253-P0-AX	设备
甲醇	Fisher Scientific	A412	认证 ACS
微升注射器	Hamilton Company	80700	胶合针 （N）
N，N'-二异丙基碳二亚胺 （DIC）	奥克伍德化学	M02889	≥99.0%;注意：DIC 通过呼吸道吸入对眼睛、皮肤有害，并可能导致皮肤过敏
N，N-二甲基甲酰胺	Millipore-Sigma	319937	ACS 试剂;99.8%
硝酸	Fisher Scientific	A200-212	认证 ACS Plus
氮气	低温气体		在压力下，内容物受热可能会爆炸
苯基硅烷	Oakwood Chemical	S13600	97%
突出 SPD-10A UV/vis 检测器	岛津公司		设备
对甲苯磺酸一水合	Millipore-Sigma	402885	ACS 试剂; ≥98.5%
三氟化钪	Oakwood Chemical	009343	99%
一次性使用针	Exel International	26420	18G x 1 1/2″
叠氮化钠	Oakwood Chemical	094448	99%;注意：NaN3 可能与铅和铜反应，从而形成高爆炸性金属叠氮化物。吞咽或皮肤接触具有急性毒性和致命性。
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233	粉末;经认证的 ACS
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-100	沉淀;经认证的 ACS
硫酸钠	Fisher Scientific	S421-500	无水;颗粒;ACS 针
头过滤器认证 0.45 µm	VWR International	28145-497	PTFE，带聚丙烯外壳的针式过滤器
四氢呋喃	Fisher Scientific	T397	认证
（三苯基膦） 钯（0）	克伍德化学	034279	98%
甲苯	Fisher Scientific	T324	认证 ACS
三苯基膦	奥克伍德化学	037818	99%