方法文章

信息承载型肽模拟物的合成及其序列导向的动态共价自组装

DOI：

10.3791/60442

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2020年2月6日

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1Department of Chemical Engineering, University of Michigan, 2Department of Chemical Engineering, Monash University, 3Department of Materials Science and Engineering, Monash University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种合成信息编码的肽模拟寡聚物的方案，并利用胺类和醛类作为动态共价反应对，以及路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐作为多功能试剂，指导这些肽模拟物进行序列定向的自组装，形成分子梯状结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案介绍了一种利用路易斯酸性多功能试剂的方法，以克服在信息编码寡聚链通过成对动态共价相互作用介导的自组装过程中所观察到的动力学捕获现象，其方式模拟了常用于互补核酸序列自组装的热循环过程。带有醛基和氨基侧链基团的伯胺单体被引入正交保护基团，用作动态共价反应对。利用改进的自动多肽合成仪，通过固相单体合成法将伯胺单体编码至寡聚（肽素）链中。经高效液相色谱（HPLC）纯化及电喷雾电离质谱（ESI-MS）表征后，将序列特异性的寡聚物与高负载量的路易斯酸性稀土金属三氟甲磺酸盐共同作用，该金属盐可同时脱除醛基保护基团并调节反应对的平衡，使链完全解离。随后，部分路易斯酸被萃取除去，从而允许互补的序列特异性链退火，形成信息编码的分子梯状结构，并通过基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）进行表征。本报告所述的简便方法克服了动态共价组装领域中常见的动力学陷阱，为未来设计稳定且复杂的分子结构提供了平台。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自组装是指小的亚基单元通过热力学驱动的途径形成更大结构的过程，该领域的进展使得人们能够更好地控制宏观和超分子纳米结构，通常是通过利用分子间相互作用（如π-堆叠和氢键）来实现1,2,3,4。特别是核酸（即多核苷酸）因其具有高信息密度的沃森-克里克碱基配对能力，已成为一种极为灵活的纳米构建材料，可实现复杂且序列选择性的结构组装4,5。然而，这些短暂的分子间键固有的强度较低，虽然有利于亚基单元的重排和错误校正，但所形成的结构往往容易受到热和机械降解的影响6。相比之下，动态共价相互作用7,8,9——一类在温和条件下可逆或可重排的共价成键反应——近年来已被用于构建复杂的高分子结构，例如梯形结构10,11,12,13、笼状结构14,15,16和堆叠结构17，其具有更强的键合强度和更稳定的结构。遗憾的是，由于这些共价键的重排速率相对较低，导致其重排能力和错误校验能力减弱，从而限制了它们向目标产物自组装的能力18。为克服这种动力学捕获效应，通常需要结合使用催化剂或苛刻的反应条件以及简单的构建单元。本文中，我们报道了一种可规避动力学捕获的过程，能够实现由序列特异性寡聚体自发组装成分子梯状结构，其中杂交过程由寡聚体残基序列中编码的信息所引导。

由于具有良好的可合成性，聚（N-取代甘氨酸）（即肽拟物）被用作组装分子梯状结构的寡聚前体19。肽拟物是肽的结构异构体，其侧链基团连接在骨架氮原子上，而非与α-碳原子相连20。通过固相合成法，可精确地将动态共价侧链基团定位在肽拟物链上，从而实现前体寡聚物的设计，使其能够自组装形成复杂的超分子结构21。

本实验利用亚胺键的动态共价重排，因为生成亚胺的缩合反应可通过质谱表征自组装过程——每形成一个化学键，分子量减少 18 g/mol22。此外，通过调节酸浓度，可调控胺与醛反应物及其亚胺产物之间的平衡。具体而言，稀土金属三氟甲磺酸盐不仅可用于调节该平衡，还可实现对乙烯乙二醇缩醛保护的醛基进行去保护23,24,25。值得注意的是，三氟甲磺酸钪已在动态共价自组装领域得到广泛应用，包括近期在室温下促进共价有机框架（COFs）合成的成功案例26,27。此外，寡聚（肽素）序列与稀土金属三氟甲磺酸盐之间显著不同的溶解性，使得可通过液-液萃取手段实现对平衡的有效控制。本研究报道的方法正是利用这一控制策略，克服了阻碍信息导向自组装过程的动力学障碍。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

警告：本方案中使用的多种化学试剂具有腐蚀性、易燃性或毒性，必须在化学通风橱中使用。请在使用前穿戴适当的个人防护装备，并查阅所有相关的安全数据表（SDS）。

1. 单体合成

注意：伯胺的合成根据已发表的方法进行。

  1. 4-(2-氨基乙基)-N-(烯丙氧羰基氧)苯胺（Npam）的合成25,28
    1. 将5.0 g（36.7 mmol）4-(2-氨基乙基)苯胺加入150 mL 10%乙酸（水溶液，v/v）中。
      注：使用弱酸可选择性保护芳香胺，而不影响脂肪胺，这是由于两类基团的pKa值存在显著差异。
    2. 将4.9 g（40.4 mmol；1.1当量）烯丙基氯甲酸酯溶于150 mL 1,4-二氧六环中，配制成溶液。
    3. 将上述两种溶液合并至一个装有磁力搅拌子的500 mL圆底烧瓶中，在室温下搅拌反应混合物过夜。
    4. 反应完成后，用500 mL去离子水（DI水）稀释，并用二乙醚（Et2O，300 mL × 3）洗涤。弃去有机相。
    5. 向水相中加入2 M NaOH（水溶液）调节pH至14，然后用Et2O（150 mL × 3）萃取。
    6. 合并有机相，并用DI水（150 mL × 3）洗涤。
    7. 用Na2SO4干燥，然后过滤。
    8. 减压蒸干。
    9. 通过核磁共振（NMR）波谱法确认所得产物Npam的结构。预期结果如下：1H NMR（500 MHz，CdCl3）δ：7.31（d，J = 8.0 Hz，2H，Ar），7.14（d，J = 8.5 Hz，2H，Ar），6.65（s，1H，-NH-），6.04 – 5.89（m，1H，-CH=CH2），5.36（dq，J = 17.1，1.6 Hz，1H，-CH=CHH），5.26（dq，J = 10.5，1.4 Hz，1H，-CH=CHH），4.66（dt，J = 5.8，1.5 Hz，2H，-CH2-CH=CH2），2.94（t，J = 6.8 Hz，2H，-CH2-NH2），2.70（t，J = 6.8 Hz，2H，-CH2-Ar），1.04（s，2H，-CH2-NH2）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ：154.85，137.00，134.98，133.51，129.36，119.41，116.92，65.62，59.89，43.47，38.72。
      注：产物为淡黄色固体，总收率为69%。无需进一步纯化即可使用。
  2. 4-(1,3-二氧戊环-2-基)苯甲腈的合成29,30
    1. 将25 g（0.19 mol）4-氰基苯甲醛溶于200 mL甲苯中。
    2. 向反应混合物中加入42.2 mL（0.768 mmol；4当量）乙二醇和0.02 g（0.1 mmol；0.05 mol%）对甲苯磺酸。
    3. 使用Dean-Stark装置（即共沸蒸馏）在120 °C下搅拌并回流过夜，以除去反应过程中生成的水。
    4. 反应完成后冷却至室温，加入40 mL 5% NaHCO3（w/v）水溶液。
    5. 萃取有机层，并用DI水洗涤三次。
    6. 用Na2SO4干燥，然后过滤。
    7. 减压蒸干。
    8. 通过NMR波谱法确认所得产物的结构。预期结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.67（d，J = 8.0，2H，Ar），7.59（d，J = 8.4，2H，Ar），5.84（s，1H，CH），4.12 - 4.03（AAʹBBʹ，4H，(CH2O)2）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：143.20，132.34，127.30，118.72，113.02，102.56，65.57。
      注：产物为白色结晶固体，总收率为86%。无需进一步纯化即可使用。
  3. 4-(1,3-二氧戊环-2-基)苄胺（Npal）的合成29
    1. 将10 g（0.057 mol）4-(1,3-二氧戊环-2-基)苯甲腈溶于100 mL无水乙醚（Et2O）中，配制成溶液。
    2. 在0 °C下，将4.3 g（0.11 mol；2当量）LiAlH4小心加入装有100 mL无水Et2O的圆底烧瓶中。搅拌形成均匀悬浮液，并用充满氩气的气球密封体系。使用过的称量器具上残留的LiAlH4需小心用乙醇淬灭。
      注意：氢化铝锂（LiAlH4）具有轻微自燃性；应在惰性气体保护下操作，并避免接触湿气。
    3. 通过滴液漏斗或注射泵缓慢加入4-(1,3-二氧戊环-2-基)苯甲腈溶液，保持反应混合物温度为0 °C。
    4. 在0 °C下搅拌反应混合物4小时，随后在室温下继续搅拌12小时。
    5. 反应完成后冷却至0 °C，缓慢加入95%乙醇（30 mL）。再加入50%乙醇水溶液（v/v，20 mL）进一步淬灭。可使用鼓泡器监测淬灭过程。
      注：根据需要加入额外的无水Et2O，以维持足够的搅拌速率。
    6. 分离醚层上清液，并减压蒸干。
    7. 将所得油状物通过0.45 µm注射式滤膜过滤。
    8. 通过NMR波谱法确认所得产物NpaI的结构。预期结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.44（d，J = 8，2H，Ar），7.32（d，J = 8，2H，Ar），5.80（s，1H，CH），4.14 - 4.0（AAʹBBʹ，4H，(CH2O)2），3.87（s，2H，-CH2-NH2）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：144.53，136.53，127.16，126.77，103.72，65.39，46.35。
      注：产物为黄色油状物，总收率为70%。无需进一步纯化即可使用。
  4. 2-(2-乙氧基乙氧基)乙基对甲苯磺酸酯的合成29,31
    1. 将20 g（0.15 mol）二甘醇单乙醚和50 mL四氢呋喃（THF）加入装有磁力搅拌器的250 mL圆底烧瓶中。
    2. 冷却至0 °C，并用充满氩气的气球将体系密封于惰性气氛下。
    3. 加入50 mL 6 M NaOH水溶液（2当量）。
    4. 将54 g（0.28 mol；2当量）对甲苯磺酰氯溶于80 mL THF中，将溶液逐滴加入反应混合物中。在0 °C下搅拌1小时。
    5. 让反应混合物升至室温，再继续搅拌1小时。
    6. 用Et2O（400 mL）萃取反应混合物。
    7. 有机层依次用1 M NaOH和DI水洗涤。
    8. 用Na2SO4干燥，然后过滤。
    9. 减压蒸干。
    10. 通过NMR波谱法确认所得产物的结构。预期结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.78（d，J = 8.0，2H，-S-C=CH-CH），7.33（d，J = 8.5，2H，-S-C=CH-CH），4.15（t，J = 5.0，2H，-CH2-CH2-O-Ts），3.68（t，J = 5.0，2H，CH2-CH2-O-Ts），3.60–3.42（m，6H，O-CH2-CH2-O-CH2-CH3），2.43（s，3H，C-CH3），1.17（t，J = 7.0，3H，O-CH2-CH3）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：144.79，132.95，130.26，129.80，127.90，126.95，70.75，69.68，69.29，68.61，66.57，21.56，15.11。
      注：产物为无色液体，总收率为98%。无需进一步纯化即可使用。
  5. 2-(2-乙氧基乙氧基)乙基叠氮化物的合成29,31
    1. 将40 g（0.14 mol）2-(2-乙氧基乙氧基)乙基对甲苯磺酸酯溶于250 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，置于装有磁力搅拌器的圆底烧瓶中。用充满氩气的气球将体系密封于惰性气氛下。
    2. 向反应混合物中加入32 g（0.49 mol；3.5当量）NaN3。
      注意：称量NaN3时切勿使用金属药匙。NaN3可能与铅或铜反应生成极易爆炸的金属叠氮化物。该物质具有急性毒性，吞食或皮肤接触可致死。
    3. 将反应混合物加热至60 °C，反应36小时，然后冷却至室温。
    4. 用大量水（500 mL）稀释，并用Et2O（150 mL × 3）萃取。
    5. 分离有机层，并进行水洗。
    6. 用Na2SO4干燥，然后过滤。
    7. 减压蒸干。
    8. 通过NMR波谱法确认所得产物的结构。预期结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.64（m，4H，O-CH2-CH2-O），3.58（m，2H，N3-CH2-CH2-O），3.51（q，J = 7.5，2H，O-CH2-CH3），3.38（t，J = 5.0，2H，N3-CH2-CH2-O），1.19（t，J = 7.5，3H，O-CH2-CH3）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：70.70，69.97，69.80，66.63，50.60，15.08。
      注：产物为黄色液体，总收率为85%。无需进一步纯化即可使用。
  6. 2-(2-乙氧基乙氧基)乙胺（Neee）的合成29,31
    1. 将20 g（0.13 mol）2-(2-乙氧基乙氧基)乙基叠氮化物溶于160 mL THF中，置于500 mL圆底烧瓶中，配备磁力搅拌器。
    2. 加入40 g（0.15 mol，1.1当量）三苯基膦，在氩气氛围下室温搅拌过夜。
    3. 用水（220 mL）淬灭反应混合物，并继续搅拌一天。
    4. 所得溶液依次用甲苯和二氯甲烷（DCM）洗涤。
    5. 在减压下蒸去水层。
    6. 通过NMR波谱法确认所得产物Neee的结构。预期结果如下：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.62–3.42（m，8H，NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH3），2.82（m，2H，NH2-CH2-CH2-O），1.48（s，2H，NH2），1.16（t，J = 7.5，3H，O-CH2-CH3）。13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：73.14，70.72，69.64，66.45，41.35，15.00。
      注：产物为黄色液体，总收率为58%。无需进一步纯化即可使用。

2. 寡聚（肽拟物）的固相亚单体合成

注意：采用固相合成（SPS）的亚单体方法，因其能够高效偶联并生成序列特异性的寡聚物。已对自动多肽合成仪进行改造，以快速制备寡聚（肽拟态物）。不同仪器可能需要调整相应参数设置。

  1. 准备
    1. 称取0.125 g Fmoc-光敏性SS树脂（典型载量0.8 mmol/g，0.1 mmol规模，100–200目，1% DVB），加入至带砂芯的自动合成仪反应容器中。将该容器插入合成仪的微波部分。
    2. 将主溶剂瓶装入DMF，脱保护瓶装入20% 4-甲基哌啶的DMF溶液（v/v）。清空废液瓶。
    3. 用DMF配制溴乙酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）的1 M溶液，总体积为1.5 mL ×（序列中残基数）+ 5 mL。额外的5 mL可确保无空气进入仪器。将0.47 mL乙酸酐加入DMF中，配制成5 mL封端溶液。
      注意：DIC可导致严重的眼损伤、皮肤刺激和致敏，以及呼吸道刺激和致敏。
    4. 用N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）配制用于取代步骤的每种伯胺（Npam、Npal、Neee和Nma（2-甲氧基乙胺））的0.5 M溶液。各伯胺溶液的总体积应为2.5 mL ×（相应伯胺的残基数）+ 2.5 mL。
    5. 将所有溶液加入自动合成仪的流路系统中。
  2. 合成
    注意：使用自动多肽合成仪进行操作。
    1. 用10 mL DMF在室温下溶胀树脂5分钟。排空反应容器。
    2. 用3 mL 20% 4-甲基哌啶溶液在75 °C下处理30秒，再在90 °C下处理90秒，以裂解Fmoc基团。排空容器。重复一次。用DMF洗涤（2 mL × 2次）。
    3. 向容器中加入1.5 mL溴乙酸溶液和1.5 mL DIC溶液。在75 °C加热反应4.5分钟，完成溴乙酰化反应。用DMF洗涤树脂（5 mL × 3次）。
    4. 向反应容器中加入2.5 mL伯胺单体溶液，进行取代反应。在75 °C加热4.5分钟。用DMF洗涤树脂（5 mL × 3次）。
    5. 重复步骤2.2.3和2.2.4，同时在步骤2.2.4中依次更换所用的伯胺单体，以序列特异性方式延长寡聚（peptoid）链。
    6. 完成最后一次取代反应后，加入2.5 mL乙酸酐溶液和2 mL DIC溶液进行封端。在50 °C加热2分钟。用DMF洗涤树脂（5 mL × 6次）。
    7. 将树脂转移至带有三通活塞的砂芯玻璃反应瓶中。该玻璃反应瓶应预先硅烷化，以防止树脂珠粘附于瓶壁。通过向瓶中充满5%二氯二甲基硅烷的二氯乙烷（DCE）溶液（v/v）至满，静置30分钟完成硅烷化。排空后用DCE和甲醇洗涤。使用前将玻璃瓶干燥。
    8. 用DCM洗涤树脂（5 mL × 3次），同时通过一个支臂通入N2鼓泡，另一支臂抽真空。
    9. 干燥并保存树脂及其连接的寡聚（peptoid），待后续进行脱保护和裂解。
  3. Alloc-胺基脱保护及从树脂上裂解
    1. 若树脂已存放超过一天，先用5 mL DMF鼓泡溶胀10分钟。排空容器后加入一小磁力搅拌子。
    2. 向玻璃多肽反应瓶中加入3 mL干燥DCM。
    3. 按每Alloc基团称取0.1当量四(三苯基膦)钯(0)和25当量苯基硅烷。使用夹具将反应瓶倾斜固定在搅拌器上方，使树脂在溶剂中保持轻柔搅动且悬浮。为防止DCM挥发，用盖子密封反应瓶。
    4. 反应1小时后，滤除溶液，并用DCM洗涤树脂（3 × 5 mL）。
    5. 重复步骤2.3.2和2.3.3。
    6. 依次用甲醇和DCM各洗涤树脂两次。
    7. 将树脂和磁力搅拌子转移至20 mL样品瓶中。
    8. 将树脂浸入DMF中，搅拌，并在405 nm光照射下（约25 mW·cm-2）裂解36小时。可在该步骤前取少量树脂进行裂解，并通过ESI-MS表征，以确认胺基上的Alloc基团已完全脱除。若仍有Alloc基团残留，重复步骤2.3.2和2.3.3。
    9. 通过注射器滤器将释放的寡聚（peptoid）与树脂分离。减压除去溶剂。
  4. 寡聚（peptoid）的纯化与表征
    1. 将peptoid溶于水/乙腈（50/50）混合溶液中。
    2. 采用反相制备型HPLC（C18）进行纯化。合并纯化组分，冷冻并冻干，得到类白色粉末。该粉末可保存以供后续使用。
    3. 纯化后采用ESI-MS进行分析。
    4. 在反射式正离子模式下进行MALDI质谱分析。取2 μL样品溶液（1 mM）与6 μL基质溶液混合，基质为200 μL乙腈中含10 mg [2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸（HABA）]。点样至MALDI样品靶板，风干。
    5. 为评估纯度，对纯化的寡聚（peptoid）进行分析型HPLC。

3. 序列选择性梯形自组装

  1. 通过解离/萃取/退火实现自组装
    1. 用无水乙腈分别配制用于自组装的每种寡聚（肽素）序列的10 mM储备液，以及三氟甲磺酸钪（Sc(OTf)3）的10 mM储备液。
    2. 向一个装有磁力搅拌子的3 mL小瓶中，加入每种肽素储备液各20 µL。根据储备液，按每摩尔潜在亚胺键加入1.5当量的Sc(OTf)3。再加入适量水和乙腈，使总体积为200 µL，其中水/乙腈的体积分数为2%（v/v）。
    3. 在70 °C下轻轻搅拌2小时，以完成醛基的缩醛去保护及所有链的解离。
    4. 向小瓶中加入200 µL氯仿和2 mL水，轻轻振荡。
    5. 静置混合物（至少15分钟），待两相完全分层后，用微量移液器吸取有机相。
    6. 将有机相转移至新的小瓶中，在70 °C下搅拌退火，通常持续6小时。梯状杂交也可在室温下进行，但需更长时间。
  2. 自组装产物的表征
    1. 在完成步骤3.1.3、3.1.5和3.1.6后，对反应混合液进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析，以监测反应进程。若杂交不完全，按每摩尔潜在亚胺键加入1.5当量的Sc(OTf)3储备液，并重复步骤3.1.3–3.1.6，直至反应完全。
    2. 在持续氮气流下将样品干燥，然后用1 mL的2%硝酸水溶液（v/v）重新溶解。用HPLC级水稀释4×106倍。采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定萃取后样品中的钪浓度。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了展示信息编码的肽拟物（peptoids）能够通过序列选择性的动态共价自组装形成分子梯状结构，合成了一个代表性链段 H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma，并将其与互补的肽拟物序列进行杂交。单体 Npam 和 Npal（通过 1H NMR (500 MHz) 表征，图1）被用作动态共价反应对，其中 Neee 有助于提高最终自组装产物的溶解性。此外，引入 commercially available 的 Nma 单体可使两条互补序列在质谱上产生质量差异。在完成固相亚单体合成后，使用 Pd(PPh3)4 去除 Alloc 保护基团。在去保护前后，分别从树脂上切取部分样品，在 405 nm 光照下裂解，并通过 ESI-MS 进行表征（图2）。该序列通过制备型 HPLC 纯化，冷冻干燥得到类白色粉末，并通过分析型 HPLC 确认纯度（图3）。随后，该寡聚（肽拟物）与互补序列 H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal 杂交，形成注册匹配的梯状结构，经 MALDI-MS 确认（图4）。

核磁共振谱分析的化学合成过程；反应方程式及质子标记图。
图 1：单体合成路线及1H-NMR 谱图。 (A) 单体合成路线及试剂与反应条件：(i) 烯丙基氯甲酸酯、10% 乙酸水溶液、1,4-二氧六环、室温、过夜；(ii) 乙二醇、对甲苯磺酸、甲苯、回流、过夜；(iii) LiAlH4、无水乙醚（Et2O）、0 °C 反应 4 小时，随后室温反应 12 小时；(iv) 对甲苯磺酰氯、四氢呋喃（THF）、0 °C；(v) NaN3、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、60 °C、36 小时；(vi) 三苯基膦、四氢呋喃（THF）、过夜。(B) 单体1H-NMR 谱图（500 MHz，CDCl3）：(i) 4-(2-氨基乙基)-N-(烯丙基羰基氧基)苯胺（Npam）；(ii) 4-(1,3-二氧戊环-2-基)苄胺（Npal）；(iii) 2-(2-乙氧基乙氧基)乙胺（Neee）。请点击此处查看该图的放大版本。

聚合物合成过程示意图及质谱结果；肽模拟物修饰，m/z 分析。
图 2：序列特异性寡聚（肽模拟物）的合成与去保护。 (A) H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma 在 Alloc 保护基团去除前后的结构，以及 (B) 电喷雾电离（ESI）质谱图。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱与质谱；高效液相色谱图；蛋白质分离；质荷比谱图
图3：信息编码肽模拟物的纯化与表征。 (A) 采用制备型高效液相色谱（HPLC）对链段进行纯化的色谱图，流动相为乙腈（MeCN）与水的线性梯度洗脱：(1) 30% MeCN，0.1–2.1 分钟；(2) 30–95% MeCN，2.1–16.1 分钟；(3) 95% MeCN，16.1–23.1 分钟；(4) 95% MeCN，23.1–26.1 分钟。峰 i 和 ii 分别对应低分子量的反应副产物（主要为DIC-脲）以及包含目标产物在内的寡聚物组分。(B) 冻干后 H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma 的分析型高效液相色谱图，以及 (C) 其电喷雾电离质谱（ESI-MS）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于聚合物相互作用分析的分子组装示意图和质谱图。
图 4：H2N-[Npam-Neee-Npal-Neee]2-Npam-Nma 与其互补序列 H2N-[Npal-Neee-Nam-Neee]2-Npal 的自组装。 (A) 两种序列的结构及其驱动形成的序列特异性组装产物。(B) 分子阶梯结构在室温下退火过夜后的 MALDI 质谱图。质荷比数据：预期 [M+Na]+ = 3306.7，实测 3306.0；预期 [M-1 亚胺+Na]+ = 3324.7，实测 3323.9；预期 [M-2 亚胺 +Na]+ = 3342.7，实测 3342.8；预期 [M-2 亚胺 +CH3OH+H]+ = 3352.8，实测 3352.0。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

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本文所述技术涉及信息性肽模拟寡聚物的动态共价组装，其中信息由其侧链基团的序列进行编码。通过使用Alloc保护的胺单体与乙烯基乙缩醛保护的醛单体，可实现正交去保护，从而在固相载体上选择性地去除Alloc保护基，同时在自组装反应中原位去除乙缩醛保护基，确保合成的序列在寡聚物纯化与表征前不会发生过早反应。重要的是，固相合成采用光敏树脂，可在紫外光或紫光照射下实现寡聚物从微球上的裂解，从而避免酸敏性的乙烯基乙缩醛保护基发生过早去保护。也可考虑若干其他去保护策略。例如，我们最初曾采用两种酸敏性保护基（Boc-胺与乙烯基乙缩醛-醛），拟通过强酸处理实现原位去保护，随后中和以启动自组装反应；然而，该方法在加入碱后立即产生沉淀。另一种方案是使用光敏性保护基2-(2-硝基苯基)丙氧羰基（NPPOC）保护胺基，醛基则可在纯化前用三氟乙酸（TFA）选择性去保护。遗憾的是，即使在光敏剂存在及延长光照时间的条件下，紫外光原位光解保护基也无法实现定量去保护25。可采用三甲基硅乙氧羰基（即Teoc）作为胺基保护基，其可在稀土金属三氟甲磺酸盐处理下裂解；然而，Teoc的定量去保护所需稀土金属三氟甲磺酸盐的用量远高于乙烯基乙缩醛去保护所需用量。在本实验方案中，可使用Teoc-胺，但必须相应调整路易斯酸浓度，因为胺基去保护不完全可能会影响较大自组装结构的形成。也曾短暂考虑使用脂肪族官能团，但脂肪族醛的去保护需剧烈条件，易导致肽模拟物序列截断32,33。

引入Neee和Nma作为惰性间隔残基可提高寡聚物的溶解性，并便于对前体寡聚物进行简单的质谱标记，从而通过质谱法快速鉴定生成的产物。此外，由于肽拟态物具有“Σ-链”构象，其相邻的骨架片段采取相反的旋转状态，形成线性且无扭曲的寡聚物34,35，因此在序列中交替引入动态共价键残基和惰性间隔残基，有助于形成使反应性侧链基团朝向一致的结构。鉴于亚单体方法的多样性，可使用大量且结构多样的伯胺库进一步修饰肽拟态物寡聚物，但可能需要对实验方案进行调整，以保持较高的偶联效率。

尽管寡聚（肽拟态物）可在玻璃反应容器中手动合成19，但自动化合成可将每个残基的添加时间从数小时缩短至半小时。此外，自动化还能减少单体和洗涤溶剂的消耗量，这在使用非商业化的一级胺单体时尤为有利。尽管从保护的胺残基上切除Alloc基团是一种高效的反应，但钯催化的氧化过程可能导致去保护不完全。因此，建议对部分树脂进行测试性切割，并通过电喷雾质谱（ESI-MS）表征去保护的程度。在测试性切割中，405 nm光照30分钟即可释放出足量的肽拟态物用于质谱分析。采用无氧条件或重复去保护反应可有效减少部分去保护的发生。

尽管本文重点讨论 Sc(OTf)3 作为一种多功能试剂的应用，其他稀土金属三氟甲磺酸盐（如三氟甲磺酸镱）也已被证明可成功介导信息导向的分子梯形结构组装。值得注意的是，Sc(OTf)3 是所有稀土金属三氟甲磺酸盐中路易斯酸性最强的；因此，由于其他稀土金属三氟甲磺酸盐的催化能力较弱24,36，可能需要使用更高当量的试剂才能实现乙烯基缩醛的完全去保护及链段解离。所需当量数可通过基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）观察链段完全解离的时点来确定。解离在自组装过程中至关重要，类似于核酸链在升温条件下的熔解过程。随后对催化剂的去除可促使动态共价配对的形成与断裂，从而推动序列特异性双链结构的组装。这种逐步退火过程避免了其他方法中常见的动力学捕获现象（对于分子梯形结构而言，可能导致错位物种的生成或序列的错误配对）。

氯仿是一种优良的溶剂，此处使用的氯仿/乙腈/水三元体系可通过相分离部分萃取路易斯酸，同时不会导致自组装结构沉淀37。此外，氯仿是少数几种能够在维持分子梯状结构溶解性的同时促进亚胺形成的溶剂之一。由于体系具有动态特性，通常可观察到微量错配及错误配对的双链结构。尽管该体系在萃取过程中对稀土金属三氟甲磺酸盐浓度的微小变化大多不敏感，但偶尔因催化剂萃取不足，会导致大量不完全杂交和非特异性寡聚物偶联。在此情况下，通常更宜先加入额外1.5当量的催化剂使体系重新完全解离，然后再进行第二次萃取，而不是立即重复萃取，因为单链的完全解离对该过程至关重要。若需同时组装多个不同的信息编码分子梯状结构，可能需要提高所用稀土金属三氟甲磺酸盐储备液的浓度，以保持当量关系和总体反应体积。

尽管这些自组装结构主要通过质谱法进行表征，但也可采用其他技术，包括荧光共振能量转移（FRET）。其局限性包括所需材料的数量、单体的成本以及信噪比。对于需要溶剂的技术，例如1H NMR，还可能因自组装结构不溶而受到影响。此外，萃取后稀土金属三氟甲磺酸盐的浓度可通过ICP-MS或以内部标准物进行的19F NMR等方法测定。

随着在宏观和超分子纳米结构与材料的可控性方面不断取得进展，设计和构建规则但可调控的组装体系成为一项挑战。本报告所述方案通过动态共价相互作用实现序列选择性组装，为获得此类纳米结构提供了一条可行途径。

披露

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作者无任何披露信息。

致谢

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本工作由美国能源部科学办公室基础能源科学项目资助，项目编号为 #DESC0012479。S.C.L. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的支持，A.F.A. 感谢阿布扎比国家石油公司（ADNOC）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二噁烷Fisher ScientificD1114符合ACS标准
2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸（HABA）Millipore-Sigma54793MALDI-MS基质物质；≥99.5%
4-(2-氨基乙基)苯胺Ontario ChemicalsA207698%
4-氰基苯甲醛Oakwood Chemical04931799%
4-甲基哌啶TCI AmericaP0445≥98.0%
4-甲苯磺酰氯Oakwood ChemicalBR170399%
50 mL 高性能离心管VWR International21008-240用于自动合成仪的离心管
乙酸Fisher ScientificA38-212冰醋酸
乙酸酐Fisher ScientificA10符合ACS标准
乙腈Millipore-Sigma34851用于HPLC；梯度级；≥99.9%
全塑料Norm-Ject注射器Thermo Fisher ScientificS7510-10鲁尔滑动式注射器
烯丙基氯甲酸酯Acros Organics22174100097%
溴乙酸Alfa AesarA14403≥98.0%
氯仿Millipore-Sigma288306无水；≥99%；含0.5–1.0%乙醇作为稳定剂
氘代氯仿Acros OrganicsAC320690075用于NMR；氘原子含量99.8%；包装于0.75 ml安瓿中
二氯二甲基硅烷Acros Organics1133100≥99.0%
二氯乙烷Fisher ScientificE175符合ACS标准
二氯甲烷Fisher ScientificD37-4稳定化处理；符合ACS标准
乙醚Acros Organics615080010无水；ACS试剂
二甘醇单乙醚TCI AmericaE0048≥99.0%
乙醇Decon Labs2701200 proof；无水
乙二醇Fisher ScientificE178符合认证标准
Fmoc-光敏SS树脂CreoSalusSA50785100–200目；1% DVB
玻璃多肽反应容器ChemglassCG-1866-02固相，T型接口聚四氟乙烯塞子，真空，中等烧结滤板，GL 25螺纹
LC-6AD HPLC泵Shimadzu Corporation设备
LED 405nmThorLabsM405L2-C1用于多肽类似物光裂解的405 nm LED
LED驱动器ThorLabsLEDD1B用于多肽类似物光裂解过程中LED光源的驱动装置
Liberty Blue 自动多肽合成仪CEM Corporation设备
氢化铝锂Millipore-Sigma199877粉末；试剂级；95%；注意：轻微自燃性，需在惰性气体下操作并防潮
Luna C18分析型反相HPLC色谱柱Phenomenex00G-4252-E0设备
Luna C18制备型反相HPLC色谱柱Phenomenex00G-4253-P0-AX设备
甲醇Fisher ScientificA412符合ACS标准
微量注射器Hamilton Company80700固定针头（N）
N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）Oakwood ChemicalM02889≥99.0%；注意：DIC对眼睛、皮肤有害，吸入可致呼吸道损伤，可能引起皮肤致敏
N,N-二甲基甲酰胺Millipore-Sigma319937ACS试剂；≥99.8%
硝酸Fisher ScientificA200-212符合ACS Plus标准
氮气Cryogenic Gases内含加压气体，受热可能爆炸
苯基硅烷Oakwood ChemicalS1360097%
Prominence SPD-10A 紫外/可见光检测器Shimadzu Corporation设备
对甲苯磺酸一水合物Millipore-Sigma402885ACS试剂；≥98.5%
三氟甲磺酸钪(III)Oakwood Chemical00934399%
一次性针头Exel International2642018G × 1 1/2″
叠氮化钠Oakwood Chemical09444899%；注意：NaN3可与铅和铜反应生成高度爆炸性的金属叠氮化物。该物质具有急性毒性，吞食或皮肤接触可致死。
碳酸氢钠Fisher ScientificS233粉末；符合ACS标准
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100颗粒；符合ACS标准
无水硫酸钠Fisher ScientificS421-500无水；颗粒状；符合ACS标准
0.45 µm 注射器滤器VWR International28145-497聚四氟乙烯材质，带聚丙烯外壳的注射器滤器
四氢呋喃Fisher ScientificT397符合认证标准
四(三苯基膦)钯(0)Oakwood Chemical03427998%
甲苯Fisher ScientificT324符合ACS标准
三苯基膦Oakwood Chemical03781899%

参考文献

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