方法文章

使用二甲基苯并[a]蒽和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（DMBA-TPA）建立化学诱导皮肤癌变模型

DOI：

10.3791/60445

⸱

2019年12月19日

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

两阶段皮肤致癌过程由两种外用化学物质诱导。致突变剂7,12-二甲基苯并[a]蒽可导致表皮细胞发生突变，而持续应用促生长剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯则可加速皮肤乳头瘤的形成。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

癌症是最具破坏性的人类疾病之一。实验性癌症模型对于深入了解不同类型细胞和基因在促进肿瘤进展中的复杂相互作用至关重要，同时也为测试不同治疗策略的有效性提供了平台。最常用的实验性炎症性癌症模型之一是DMBA-TPA两阶段皮肤癌发生模型。该模型通过局部应用两种不同的化学物质——7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）——诱导皮肤乳头状瘤的形成。由于主要结局是皮肤中乳头状瘤的形成，该模型成为研究肿瘤起始（无瘤生存期）和肿瘤进展（可见肿瘤的数量和大小）的理想、可靠且可重复的方法。DMBA-TPA处理的作用通过炎症机制传递，这使得该模型特别适用于研究免疫系统在肿瘤形成中的作用。然而，该模型仅限于皮肤及其他可直接施加化学物质的表面。本文提供了一套详细的实验操作方案，以确保该模型的成功应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

癌症是全球主要的死亡原因之一。因此，迫切需要建立可靠的实验性疾病模型，以更深入地理解该疾病的机制，并探索潜在的治疗策略。在研究皮肤癌发生过程中，最常用的实验性体内模型之一是化学诱导的两阶段皮肤癌发生模型1,2。该模型可用于研究肿瘤的启动、促进和进展过程，还可用于分析免疫细胞浸润和血管生成等特定事件。

为了使用两阶段皮肤致癌模型，需用两种不同的化学物质处理小鼠背部皮肤，以共同诱导肿瘤形成。该模型首先以低剂量的致突变剂DMBA启动，随后进行长期的肿瘤促进剂TPA暴露3（图1）。DMBA通过与表皮细胞及主要角质形成细胞干细胞的DNA形成共价加合物，随机诱导DNA突变4,5,6,7。这些随机突变中的一部分发生在原癌基因（如Hras1）上（在Kras和Nras中也检测到突变），在适当刺激下，原癌基因转化为癌基因，从而驱动肿瘤形成。TPA则是最常用的肿瘤生长促进剂，其分子靶点为蛋白激酶C（PKC）

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案已获得芬兰国家动物伦理委员会批准（方案编号 ESAVI/23659/2018）。

1. 实验动物、试剂与设备

  1. 使用年龄和性别匹配的小鼠。在7–9周龄时开始实验，因为大多数小鼠的皮肤在此年龄段处于休止期（telogen）2。
  2. 在实验过程中观察动物行为，若发现其发生争斗（雄性小鼠中较为常见），应将它们单独饲养。争斗可能导致皮肤破损，从而促进肿瘤形成。由于雌性小鼠攻击性较低，因此更推荐使用。典型的实验组每组动物数量为8–20只24,25,26,27。
    注意：基于前期研究中观察到的生物学变异进行功效计算，有助于选择足够大的样本量。本文示例中使用的小鼠品系包括Balb/c和C57BL/6，但其他多种小鼠品系（如SENCAR和FVB）以及Wistar和Sprague-Dawley大鼠也已在DMBA-TPA模型中应用2,28,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主要结局是不同处理组或基因型组之间的生存时间（即无乳头状瘤时间）。次要结局是每组每周的乳头状瘤数量（图2）。预期结果为实验组（两个或以上）之间的无乳头状瘤时间及乳头状瘤数量存在统计学显著差异。建议在促癌阶段（TPA阶段）统计乳头状瘤数量并绘制曲线，以了解各组在此阶段的差异。过早终止实验可能掩盖统计学显著差异。

小鼠乳头瘤的Kaplan-Meier生存曲线和生长图表，比较Balb/c与C57BL/6品系。
图2：DMBA-TPA诱导的小鼠皮肤癌发生模型的主要结果。 小鼠皮肤上乳头瘤的代表性图像及其两项主要结果。数据来自四次独立实验的合并结果。注：Balb/c和C57BL/6小鼠的实.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DMBA-TPA诱导的皮肤癌是最常用的癌症模型之一，因其具有高度可重复性，并能提供从肿瘤起始到恶性发展的全过程信息。关键的观察指标——乳头状瘤的形成，可简便且可靠地进行定量分析。该模型可同时评估肿瘤的起始（无瘤生存期）和进展（肿瘤数量和大小）。该模型适用于研究不同化合物（如潜在治疗药物）以及在基因修饰动物中单个基因对肿瘤进展的影响。在将该模型应用于任何特定小鼠品系时，建议查阅现有文献，以了解该品系在该模型中的反应特征（例如，首个乳头状瘤出现的速度）。使用基因修饰小鼠时，始终推荐使用野生型同窝小鼠作为对照。关于是否应增设其他对照组（例如用丙酮替代DMBA或TPA，或两者均替代），目前存在很大争议，因为已知去除DMBA或TPA，或颠倒其给药顺序，极不可能诱导乳头状瘤的形成34。当必须单独研究肿瘤起始阶段（即仅给予DMBA）时，可在给予DMBA剂量后处死动物进行分析。在研究转基因或基因敲除背景下单个基因的作用时，建议采集未经处理动物的样本，以检测基因工程小鼠与野生型小鼠在肿瘤形成前可能存在的差异30,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由芬兰科学院（资助号 25013080481 和 25013142041（I.J.），286377 和 295814（M.P.），287907（T.J.））、Päivikki 和 Sakari Sohlberg 基金会（M.P.，T.J.）、芬兰医学基金会（T.P.）、坦佩雷大学医院专家责任区竞争性国家研究资助（资助号 9V049 和 9X044（M.P.），9X011 和 9V010（T.J.））、Fimlab 实验室专家责任区竞争性国家研究资助（资助号 X51409（I.J.））、Tays 支持基金会（I.J.，M.P.，T.J.）、坦佩雷结核病基金会（I.J.，M.P.，T.J.）、芬兰文化基金会（M.V.）、Paulo 基金会（T.P.）、芬兰癌症协会（M.P.）以及 Emil Aaltonen 基金会（T.P.）资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000 µl RPT XL 带刻度滤芯吸头（无菌），补充装StarlabS1182-1730-C
300 µl RTP 带刻度滤芯吸头（无菌），补充装StarlabS1180-9710-C
7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）SigmaD3254-100MG吞咽有害，可能致癌。需避光保存。
丙酮Sigma1000141011易挥发且易燃。
Attane vet 1000 mg/gPiramal Critical Care Limited吸入用液态异氟烷
电池驱动剃毛器 IsisAlbert Kerlb GmbHGT421用于剃除毛发
CONTRAfluran-废气过滤器ZeoSys GmbH用于麻醉
Linex Nature N1030 尺子 30 cmStaples Business Advantage60383用于测量乳头状瘤
中型 CO₂ 室 300 × 200 × 200 mm - 红色VetTech Solutions LtdAN045AR用于安乐死
MekasoftMekalasi23008台面覆盖物
小鼠（Balb/c JRj）Janvier labs其他品系亦可使用
小鼠（C57BL/6JRj）Janvier labs其他品系亦可使用
Panasonic Lumix DMC-FS5 数码相机Panasonic
多聚甲醛Merck30525-89-4用于组织学样本
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA），又称佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯EnzoBML-PE160-0001
精密天平 PLJ-C/PLJ-GKERN & SOHN GmbHPLJ 600-3CM
Pre-Set CO₂ 双室系统-不锈钢外壳VetTech Solutions LtdAN044BX用于安乐死
RNAlaterQiagen76104用于核酸样本
Tacta 移液器 100–1000 µlSartoriusLH-729070
Tacta 移液器 20–200 µlSartoriusLH-729060
UNO 麻醉剂加注钥匙Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉
UNO 小鼠面罩Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉
UNO FM2200 流量计Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉
UNO 气体排空装置Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉
UNO 诱导箱Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉
UNO200VAP 蒸发器Scintica Instrumentation Inc.用于麻醉

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
  2. Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols.....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DMBA TPA

相关文章