方法文章

人类昼夜表型分析与真实世界中的日间功能测试

DOI：

10.3791/60448

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2020年4月7日

 ,  ,  , 
1Chronobiology, Faculty of Health & Medical Sciences, University of Surrey, 2Centre for Human Brain Health, University of Birmingham, 3Turner Institute for Brain and Mental Health, School of Psychological Sciences, Monash University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种方法，通过基于慕尼黑时间型问卷、金标准昼夜节律相位生物标志物及活动记录仪测量结果对受试者进行准确的昼夜节律表型分组，进而研究其行为表现的昼夜节律变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在我们持续发展的“全天候”社会中，亟需加深对生物学、生理学和心理学变化如何影响健康与表现的理解。这一挑战的核心在于，越来越需要考虑个体在睡眠和昼夜节律方面的差异，并探索一天中不同时间对现实世界中表现的影响。目前有多种方法可用于测量睡眠和昼夜节律，包括基于主观问卷的方法以及客观的睡眠-觉醒监测、活动记录仪（actigraphy）和生物样本分析。本文提出了一种结合多种技术的方案，用于将个体分类为早型、中间型或晚型昼夜表型组（ECPs/ICPs/LCPs），并建议如何在实地环境中开展日间表现测试。代表性结果表明，不同昼夜表型个体之间的活动-休息模式（来自活动记录仪数据）、昼夜节律相位（弱光下褪黑素分泌起始时间及皮质醇觉醒反应峰值时间）存在显著差异。此外，早型与晚型表型个体在日间表现节律上的显著差异，进一步强调了在研究中考虑昼夜表型的重要性。总之，尽管控制影响因素存在困难，该方案仍可在真实环境中评估昼夜表型对表现的影响。本文提供了一种在实地简便评估昼夜表型的方法，并支持在设计表现研究时必须考虑一天中测试时间的必要性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在行为层面，评估个体的休息/活动模式可通过主观的问卷调查方法或通过腕部活动记录仪进行客观监测。活动记录仪数据已通过多导睡眠图（PSG）对多种睡眠参数进行了验证，包括：总睡眠时间、睡眠效率以及入睡后觉醒时间1。尽管PSG被认为是测量睡眠的金标准，但在睡眠实验室之外长期使用存在困难2。因此，活动记录仪旨在提供一种简单且更具成本效益的PSG替代方案，可用于监测24小时的休息/活动模式。主观的自我报告测量可通过慕尼黑时间型问卷（MCTQ）3定义个体的“时间型”，或通过清晨性-晚间性问卷（MEQ）4评估其昼夜偏好。处于该谱两端的群体可分别称为早型昼夜表型（ECPs）和晚型昼夜表型（LCPs），介于两者之间的则称为中间型昼夜表型（ICPs）。

尽管早型人（ECPs）和晚型人（LCPs）可通过其行为（即睡眠/觉醒模式）明确区分，但这些个体差异也部分源于生理学5和遗传易感性6,7的差异。生理生物标志物常被用于确定个体的昼夜节律相位/时间。反映昼夜节律时间的两种主要激素是褪黑素和皮质醇：褪黑素在傍晚开始上升，至夜间中段达到峰值；皮质醇则在早晨达到峰值8。利用这些昼夜节律相位标志物，可以识别睡眠-觉醒模式的个体差异。例如，早型人的暗光下褪黑素起始分泌时间（DLMO）9,10以及皮质醇觉醒反应峰值时间11,12均较早，这一特征也体现在核心体温的昼夜节律上13。唾液易于采集，安全且无创，可从中通过放射免疫分析法（RIA）或酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测上述激素，无需提取任何细胞成分。RIA和ELISA是灵敏且特异的检测方法，通过抗原-抗体反应（涉及放射性同位素标记物，如碘（125I）或酶标记抗体14）来检测生物样本（如血液、血浆或唾液）中抗原的浓度。

严格控制的实验室方案，如恒定状态实验（constant routine, CR）和强制去同步（forced desynchrony, FD），是研究内源性昼夜节律的金标准15。然而，目前越来越需要在非人工实验室环境下的家庭环境中研究个体，以获取情境数据并提高研究结果的外部效度。因此，我们需要更有效的方法来在实地研究中对个体差异进行分类、测量和评估。此外，已有研究发现，身体功能（如有氧能力、肌肉力量）和认知功能（如反应时间、持续注意力、执行功能）在一天中的不同时间存在显著的昼夜变化，晨型人（ECPs）在早晨的表现更优，而夜型人（LCPs）则在晚间表现更佳16,17。这表明，在开展研究中的性能测试时，应将测试时间以及个体的昼夜表型作为重要考虑因素。

实验室研究中采用的不同测量方法和方案使得能够实施高度受控的条件。由于影响因素众多，实地研究通常更具挑战性。因此，在监测个体于居家环境中的行为、心理及表现时，通过结合多种技术手段采用更为整体性的方法，可能提供更高的准确性18。本文讨论一种可在实地轻松实施的方法，用于识别个体在昼夜节律表型上的差异，该方法结合了MCTQ、活动记录仪（actigraphy）以及生理生物标志物。我们假设这些变量在不同昼夜节律表型组之间将存在显著差异，并且与时间型（chronotype，即通过MCTQ获取的自由日校正后中点睡眠时间MSFsc）存在显著相关性。此外，我们提出测量日间表现的方法，并强调需针对每种昼夜节律表型组分别分析数据。我们假设，若仅在整体人群层面进行数据分析，则日间表现节律的差异将被掩盖。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述所有方法均已获得伯明翰大学研究伦理委员会的批准。

1. 受试者筛选与实验设计

  1. 所有操作均须在获得相应伦理审批后进行，遵循《赫尔辛基宣言》的要求，并在参与者参与前取得其书面知情同意。
  2. 招募无睡眠障碍、神经系统或精神疾病既往诊断史，且未服用任何影响睡眠、褪黑素或皮质醇节律药物的参与者。
  3. 确保参与者非轮班工作者，近一个月内未跨越两个以上时区旅行，并能够自由参与本研究 （即能够承诺佩戴活动记录仪、在“自由日”提供唾液样本，并在指定时间参加行为表现测试（见第2.1节））。
  4. 邀请符合纳入标准的参与者参加初次设置会议，以获取知情同意、收集问卷数据、接受居家唾液样本采集培训，并配置体动记录仪和睡眠日记。在此次会议中，应使参与者熟悉生理采样流程，确保其充分理解所需配合事项（见第3节）。
  5. 要求参与者填写慕尼黑昼夜类型问卷（Munich ChronoType Questionnaire, MCTQ），该问卷用于评估个体在工作日与自由日的睡眠/觉醒变量及光照暴露差异3。由此可计算自由日校正后的中点睡眠时间（MSFsc），作为昼夜类型（chronotype）的指标。

2. 活动记录仪与睡眠日记

  1. 至少持续两周19（可根据研究目的延长），要求参与者佩戴腕部活动监测仪（即“活动记录仪”），以在整个研究期间收集其休息/活动模式以及光照（1–32,000 lux）数据。
  2. 向每位参与者提供活动记录仪的使用说明，包括在洗澡或淋浴时取下设备（若非防水型号），并避免衣袖遮挡设备，以确保能够采集光照数据。确保将活动记录仪佩戴于非优势手手腕上。
  3. 结合活动记录法，并为便于从活动记录数据中进行睡眠/觉醒分析，向每位参与者发放睡眠日记，要求其每日填写。确保日记中包含以下问题：上床时间、入睡时间、夜间觉醒次数、醒来时间、睡眠质量、日间小睡情况以及取下活动记录仪的时间。
  4. 收集活动记录数据用于休息/活动分析，根据研究需求设定相应参数（本研究采用30 Hz的采样频率和中等灵敏度设置）。从睡眠日记中提取每日上床和起床时间，并输入至设备制造商提供的软件或替代分析工具（例如开源且经过验证的代码），以获取与本研究相关的活动记录变量。

3. 生理样本采集

  1. 通过标记聚丙烯收集管或唾液采集管（本研究中使用7 mL塑料离心管）预先准备好采样包。用参与者编号、早晨或晚上以及 individual sampling numbers 标记试管。包含一个“备用”试管，以防出现错误时使用。
  2. 为早晨和晚上的采样方案分别准备一份样本采集记录表，以便参与者记录每次采样的时间戳（例如，早晨样本1，采样时间 = hh:mm；早晨样本2，采样时间 = hh:mm）。记录表中应包括参与者编号、用于季节信息的日期以及用于计算光周期的地点。
    注意：必须使用24小时制时间，以确保不会出现AM/PM混淆问题。可使用不同颜色的标签区分早晨和晚上的采样管，以帮助区分样本。
  3. 在培训参与者如何在家庭或工作环境中采集唾液样本时，向其提供相应的生理采样方案及预先准备好的采样包。
  4. 告知参与者，样本必须在自由日采集，即参与者能够按照自己偏好的时间上床睡觉和醒来（无需闹钟）。为确保DLMO（暗光褪黑素起始时间）计算的可靠性，参与者在进行性能测试的前一天不应执行晚间唾液采样方案，因为需要保持清醒超过习惯性就寝时间。
  5. 要求参与者在研究的第二周安排一个早晨和一个晚上（同一天）的时间段，确保能够完成唾液样本采集。建议参与者在同一天先采集早晨样本，再采集晚上样本。
    注意：必须遵循采样顺序（先早晨后晚上），以确保任何睡眠时间的变化不会影响结果（如果先采集晚上样本，需保持清醒超过习惯性就寝时间，这可能会影响次日早晨的样本结果）。
  6. 皮质醇觉醒反应的早晨采样方案
    1. 确保在首次醒来时（仍在床上）立即采集唾液样本，前1小时内每15分钟采集一次，随后1至2小时内每30分钟采集一次。通过将唾液吐入相应标记的试管中进行采集（从编号1、2、3等开始）。
    2. 在此期间，确保参与者：在整个测试期间避免饮酒、含人工色素的饮料及食物，并在采样期间避免刷牙（无论是否使用牙膏）。
    3. 所有样本采集完成后，确保参与者将样本储存在-20 °C的冰箱冷冻室中，直至研究团队取回。
      注意：最好尽可能将样本冷冻保存，但如果需在第二天由研究团队取回，样本在冰箱冷藏条件下仍可保持有效性。根据2004年《人体组织法案》（HTA），除非分析机构持有HTA许可证，否则样本必须在采集后七天内收集并处理，以使其去细胞化。
  7. 暗光褪黑素起始时间（DLMO）的晚间采样方案
    1. 确保从习惯性就寝时间前3至4小时开始，每30分钟采集一次唾液样本，持续至习惯性就寝时间后1至2小时（例如，若习惯性就寝时间为22:00，则参与者应从18:00/19:00开始采样，直至23:00/00:00）。通过将唾液吐入相应标记的试管中进行采集（从编号1开始，依次为2、3等）。
    2. 在此期间，确保参与者：从习惯性就寝时间前6小时起避免摄入含咖啡因的饮料（如茶、咖啡、可乐）（例如，若习惯性就寝时间为22:00，则应在采集当天16:00停止摄入咖啡因）。
    3. 确保参与者在室内静坐于弱光环境（< 10 lux，例如房间另一侧的一盏台灯，最好为红光，不使用顶灯、电子屏幕，窗帘关闭）。确保参与者在采样期间避免饮用含酒精或人工色素的饮料，并避免刷牙（无论是否使用牙膏）。
    4. 如果参与者希望进食、如厕或制作不含咖啡因的饮品，应确保其在完成一次样本采集后立即进行，并尽量在下一次采样前重新静坐至少15分钟。若在两次采样之间进食，应确保参与者在下次采样前15分钟用清水漱口。
    5. 确保其他所有房间也保持相同的光照条件，使参与者在整个采样期间始终处于弱光（最好为红光）环境中。
    6. 所有样本采集完成后，确保参与者将样本储存在-20 °C的冰箱冷冻室中，直至研究团队取回。
      注意：参与者严格遵守弱光采样方案至关重要。研究人员应尽可能测量光照条件，以监控光照强度和光谱组成。

4. 放射免疫分析

  1. 对人唾液中的褪黑激素和皮质醇进行放射免疫分析（RIA）或酶联免疫吸附试验（ELISA），以确定每个时间点的相对浓度。
    注意：本代表性结果中采用的程序为使用碘-125（125I）放射性标记示踪剂和固相分离的放射免疫分析法。该方法为英国萨里大学（University of Surrey）时间生物学实验室的常规检测方案20。
  2. 将个体褪黑激素起始分泌时间（DLMO）计算为褪黑激素浓度超过三个基线测量值（前三个样本）均值两个标准差的时间点。
    注意：与使用固定浓度阈值相比，该方法可校正个体间的基线差异14。根据采样时间点的不同（例如，24小时完整时间谱），也可采用其他计算方法14。
  3. 将皮质醇峰值计算为早晨皮质醇觉醒反应期间记录到的最高皮质醇浓度对应的时间。

5. 昼夜性能测试

注意：本方案中使用的测量方法包括精神运动警觉任务（Psychomotor Vigilance Task, PVT）21和卡罗林斯卡嗜睡量表（Karolinska Sleepiness Scale, KSS）22。然而，根据研究目的的不同，也可采用其他测试方法，同时保持相同的设计（例如，若研究旨在探讨昼夜节律表型对工作记忆的影响，则需采用记忆任务）。

  1. 要求参与者在测试前的一周内至少完成一次（根据任务而定）练习试验，以熟悉实验设置。
    注意：如果能够进行监督，练习试验可以远程完成。练习测试的次数应根据研究中所使用任务的具体情况而定。例如，相较于较简单的任务，更复杂的执行功能任务可能需要更多次的练习测试才能达到表现平稳期。
  2. 根据研究假设以及所考察的时间点数量，在特定的时钟时间安排测试会话。
    注意：根据研究设计，可以在家中或实验室进行性能测试。由于本方案对时间敏感，如果在家庭环境中进行测试，必须监控依从性，以确保由参与者本人完成测试，并且测试需带有时间与日期戳记。
  3. 在合适的设备上进行测试（本研究使用的是DQ67OW，i7-2600处理器，4GB内存，32位台式机，配备标准键盘和鼠标）。
    注意：如果测试需要使用笔记本电脑、iPad或其他设备，应确保所有参与者在每次测试会话中均使用相同的设备和设置，以避免因使用鼠标、触控板或触摸屏而可能引起的反应差异。

6. 分析

  1. 根据收集的五个变量值对昼夜节律表型组进行分类：校正后的中点睡眠时间（MSFsc）、起床时间、皮质醇觉醒反应的峰值时间、褪黑素分泌的昼夜节律起始时间（DLMO）和睡眠起始时间（分类阈值见表1）。
  2. 为每位参与者在每个变量上分配一个分数：若该变量属于早型（ECP）类别，则记为0分；属于中间型（ICP）类别，则记为1分；属于晚型（LCP）类别，则记为2分。例如，若某参与者在所有变量上均属于LCP类别，则其总分为10分。根据总分范围0–10，将参与者划分为ECP（0–3分）、ICP（4–6分）和LCP（7–10分）。
  3. 根据总分，可进一步确定昼夜节律表型的亚类：0 = 极端早型（ECP），1 = 明确早型，2 = 中度早型，3 = 轻度早型，4 = 早期中间型，5 = 中间型（ICP），6 = 晚期中间型，7 = 轻度晚型（LCP），8 = 中度晚型，9 = 明确晚型。
    注意：统计分析应根据具体研究问题确定。若数据不符合正态分布，应采用非参数检验。应进行事后检验以确定一天中不同时间点的效应。当测量多个参数时，应进一步进行多重比较校正（例如，对p值进行FDR校正）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ECP和LCP中的这些结果此前已由Facer-Childs、Campos等人发表23。所有出版许可均已获得。对于需要对三组（早期、中期和晚期）进行研究的实验，可采用相同的方法和截断值。

昼夜节律表型分析（表1、表2及图1）
本文提出的第一个假设是，各组在睡眠和昼夜节律变量上将存在显著差异。在参与本研究的受试者（n = 22）中，被归类为早型人（ECPs）的评分为0-1分，而所有晚型人（LCPs）的评分为8-10分（分界值见表1）。为验证这些结果，对每项变量的组间平均值进行了比较。ECPs的MSFsc为02:24 ± 00:10 h，而LCPs为06:52 ± 00:17 h（t(36) = 12.2，p < 0.0001）。两个组之间的生理标志物也存在显著差异。ECPs的褪黑素起始分泌时间（DLMO）为20:27 ± 00:16 h，而LCPs为23:55 ± 00:26 h（t(30) = 6.8，p < 0.0001）。皮质醇觉醒反应峰值时间在ECPs中出现在07:04 ± 00:16 h，而在LCPs中为11:13 ± 00:23 h（t(36) = 8.0，p < 0.0001）。在睡眠起始和觉醒时间的体动记录变量中也观察到相同趋势：ECPs的平均睡眠起始时间为22:57 ± 00:10 h，LCPs为02:27 ± 00:19 h（t(34) = 8.9，p < 0.0001）；觉醒时间在ECPs中为06:33 ± 0.10 h，LCPs中为10:13 ± 00:18 h（t(34) = 9.9，p < 0.0001）。其他睡眠变量，包括睡眠持续时间、睡眠效率和入睡潜伏期，在两组之间无显著差异（表2）。

第二个假设是，从MCTQ收集的MSFsc将与公认的金标准——活动记录仪及昼夜节律相位生物标志物——显著相关。图1显示，MSFsc与褪黑激素分泌的夜间起始时间（DLMO）（R2 = 0.65，p < 0.0001）、皮质醇觉醒反应峰值时间（R2 = 0.75，p < 0.0001）、睡眠起始时间（R2 = 0.80，p < 0.0001）以及觉醒时间（R2 = 0.86，p < 0.0001）均呈显著相关性。

这些代表性结果表明，不同的昼夜节律表型组在睡眠起始/终止时间（即醒来时间）以及生理学变量（DLMO 和早晨皮质醇峰值时间）方面均存在明显差异。

日间测试（图2）
本研究假设，通过在一天内进行多次测试，可识别出各组（ECPs/LCPs）在主观嗜睡程度和行为表现上的日节律变化。此外，还假设若不考虑昼夜节律表型，仅在整体组别层面进行数据分析，则日间变异将被错误表征。

在全体组水平上，PVT 和 KSS 均显示出显著的昼夜节律变化。上午 08:00 测试时段的 PVT 表现显著慢于下午 14:00 的测试（p = 0.027），主观嗜睡程度也更高（p = 0.024）。上午 08:00 与晚上 20:00 之间的 PVT 表现差异同样显著（p = 0.041）。

当分别分析每个组时，LCPs 中发现 PVT 表现存在显著的昼夜节律变化，而 ECPs 中则未发现。LCPs 在 08:00 的表现显著差于 14:00（p = 0.0079），而在 20:00 的表现显著优于 08:00（p = 0.0006）。主观嗜睡程度在每组内部均表现出显著的昼夜节律变化。ECPs 在 20:00 报告的嗜睡程度高于 08:00（p = 0.0054）。而在 LCPs 中观察到相反的模式，其在 08:00 报告的嗜睡程度最高，在 20:00 最低。LCPs 在 08:00 的嗜睡程度显著高于 14:00 和 20:00（两者 p < 0.0001）。

昼夜节律相关性图表；皮质醇、清醒、DLMO、睡眠起始；R² 值已标明。
图 1：线性回归分析，展示通过活动记录仪和生理生物标志物测得的睡眠/清醒变量之间的关系。 自由日校正后的中点睡眠时间（MSFsc）以一天中的时间（h）表示在横轴上。蓝色框内为早期昼夜节律表型（ECPs），红色框内为晚期昼夜节律表型（LCPs）。(a) 皮质醇觉醒反应峰值时间（h），(b) 觉醒时间（h），(c) 低光照褪黑素起始时间（DLMO）（h），(d) 睡眠起始时间（h）。R2 值显示在右下角，显著性水平以 **** = p < 0.0001 表示。本图经许可修改自 Facer-Childs 等人23。 请点击此处查看此图的放大版本。

嗜睡与PVT表现图；时间影响；统计学显著性趋势。
图2：Karolinska嗜睡量表与心理运动警觉任务（PVT）表现的昼夜变化曲线。 横轴显示一天中的时间（h）。第一列为全组结果，第二列为早期昼夜表型（ECPs），第三列为晚期昼夜表型（LCPs）。(a) 主观嗜睡程度（KSS）评分，(b) PVT反应时间（s）。已拟合二阶多项式非线性回归曲线。显著性水平表示为：ns（无显著性），* (p < 0.05)，** (p < 0.01)，*** (p < 0.001) 和 **** (p < 0.0001)。本图经许可修改自 Facer-Childs 等人23。 请点击此处查看本图的放大版本。

测量变量ECP 类别ICP 类别LCP 类别
体动记录仪测定的起床时间< 07:30 h07:31 - 08:29 h> 08:30 h
早晨皮质醇峰值时间< 08:0008:01 - 08:59 h> 09:00 h
弱光褪黑素起始时间（DLMO）< 21:30 h21:31 - 22:29 h> 22.30 h
体动记录仪测定的入睡时间< 23:30 h23:31 - 00:29 h> 00:30 h
自由日校正后的中点睡眠时间（MSFsc）< 04:00 h04:01 - 04:59 h> 05:00 h
每项变量得分012
总分0 - 34 - 67 - 10
子类别0 = 极端早型（extreme ECP）
1 = 明确早型（definite ECP）
2 = 中度早型（moderate ECP）
3 = 轻度早型（mild ECP）		4 = 早期中间型（early ICP）
5 = 中间型（ICP）
6 = 晚期中间型（late ICP）		7 = 轻度晚型（mild LCP）
8 = 中度晚型（moderate LCP）
9 = 明确晚型（definite LCP）
10 = 极端晚型（extreme LCP）

表1：昼夜节律表型分为早型（ECP）、中间型（ICP）和晚型（LCP）的分类临界值。 根据每位参与者的检测结果，对每个变量赋予相应得分，总分（0-10）可用于将个体归入相应的组别及各亚类别。

测量变量ECPsLCPs显著性
样本量N = 16N = 22n/a
男性/女性人数M = 7M = 7p = 0.51c
F = 9F = 15
年龄（年）24.69 ± 4.6021.32 ± 3.27 年p = 0.028a
身高（cm）171.30 ± 1.97171.10 ± 2.38p = 0.97a
体重（kg）66.44 ± 2.7867.05 ± 2.10p = 0.88a
MSFsc（hh:mm）02:24 ± 00:1006:52 ± 00:17p < 0.0001a
入睡时间（hh:mm）22:57 ± 00:1002:27 ± 00:19p < 0.0001a
起床时间（hh:mm）06:33 ± 0.1010:13 ± 00:18p < 0.0001a
睡眠时长（h）7.59 ± 0.187.70 ± 0.14p = 0.72a
睡眠效率（%）79.29 ± 1.9677.23 ± 1.14p = 0.46a
入睡潜伏期（hh:mm）00:25 ± 00:0600:25 ± 00:03p = 0.30b
相位角（hh:mm）02:28 ± 00:1602:34 ± 00:18p = 0.84a
弱光褪黑素起始时间（hh:mm）20:27 ± 00:1623:55 ± 00:26p < 0.0001a
皮质醇峰值时间（hh:mm）07:04 ± 00:1611:13 ± 00:23p < 0.0001a

表2：昼夜节律表型组（早型ECPs和晚型LCPs）的研究变量。 除年龄以均值±标准差（SD）表示外，其余变量均以均值±标准误（SEM）表示。自由日校正后的中点睡眠时间（MSFsc）由MCTQ计算得出。所用统计检验类型以上标形式标注：参数检验a、非参数检验b、Fisher精确检验c。相位角由暗光下褪黑素分泌起始时间（DLMO）与睡眠起始时间之间的差值（小时）确定。所有p值均经过FDR校正24。本表经许可修改自Facer-Childs等人的研究23。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于昼夜节律和睡眠对行为的影响之间存在复杂的相互作用，探究各自相对贡献具有挑战性。基于实验室的研究方案在很大程度上不切实际且成本高昂，因此在将研究结果与日常功能关联时，其外部效度较差25。因此，越来越需要在个体的家庭环境中开展研究，以提高对现实情境的可推广性。尽管实地研究无法控制外源性影响因素，但采用整合性方法可能有助于阐明生物和环境因素如何共同影响健康、生理功能和行为表现23,26,27。本方案专门设计用于在个体遵循其日常习惯的同时，对其居家环境中的状态进行监测。此类唾液采样方案已在亚马逊28和南极洲29等具有挑战性的环境中成功实施，证明了该方案易于执行。

问卷是睡眠与昼夜节律研究中的有用工具，因其能够快速简便地收集大量信息。然而，在试图研究个体差异时，主观测量与客观测量之间的不一致可能带来困难。因此，能够同时收集多种主观和客观测量指标，有助于加强对昼夜节律表型群体的分类。这种结合多种方法——即MCTQ（慕尼黑昼夜节律问卷）、活动记录仪、生理样本采集和行为表现测试——的方式凸显了若不考虑个体在昼夜节律表型上的差异，研究结果可能被误读。测量所有这些变量可提供最可靠的昼夜节律表型分类，但该方法仍有进一步优化的空间，以减少实施要求。例如，尽管其可靠性仍有待验证，但为了降低成本，研究人员可省略皮质醇采样步骤，或改用其他问卷。然而需要注意的是，由于褪黑激素的昼夜节律起始时间（DLMO）目前仍是昼夜节律时相的金标准指标，而活动记录仪是监测休息/活动模式的标准方法，因此这两项应作为评估中必须包含的关键变量。

根据时钟时间而非个体自身（内部生物时间）的时间安排来规划性能测试，提高了可行性，并使该方案能够在真实世界环境中应用。然而，这种设计的一个局限性在于无法区分昼夜节律系统与稳态因素各自的影响。这带来了一个挑战，即无法确认导致结果的具体机制。但由于本方案的目的是在真实场景下研究这些群体，若刻意减少睡眠依赖性机制的影响，反而会降低结果的外部效度。因此可以认为，采用一种整合性方法对于实地研究更具适用性和可行性。

对表现的直接测量与社会高度相关，但似乎如果不考虑多种影响因素，尤其是未根据个体的昼夜节律表型和睡眠压力进行分组，研究可能会遗漏关键结果。

如前所述，PVT 和 KSS 已在多个研究领域得到广泛应用。PVT 操作简单，且任务持续时间灵活，因此在需要多次测试的昼夜节律和睡眠限制研究中具有较高的应用价值，并已被证明是睡眠剥夺的敏感指标30,31。尽管测试准确性和整体反应时间随任务持续时间延长而提高，但2分钟、5分钟和10分钟的PVT任务均显示出相似的昼夜节律变化关系32。

如有需要，本方案设计可采用多种不同的表现任务，并在更频繁的时间点进行。以往研究表明，一天中的不同时段会对身体和认知表现指标产生影响，例如有氧能力15和执行功能25。实施本方案并考虑个体差异，将有助于加深对影响表现机制的研究，特别是在精英体育等较为特定的环境中。总之，本方案可实现对昼夜节律表型的现实世界评估，并为如何测量一天中不同时段对表现的影响提供见解。

披露

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B.M. 和 D.J.S. 是 Stockgrand Ltd. 的联合董事。作者声明无其他竞争性财务利益。

致谢

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本工作获得了生物技术和生物科学研究中心（Biotechnology and Biological Sciences Research Council，BBSRC，BB/J014532/1）和工程与物理科学研究委员会（Engineering and Physical Sciences Research Council，EPSRC，EP/J002909/1）的资助。E.R.F.C. 获得了惠康信托机构战略支持基金（Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund，ISSF）加速计划奖学金（Wellcome 204846/Z/16/Z）以及澳大利亚政府工业、创新与科学部资助（ICG000899/19/0602）的支持。我们诚挚感谢所有参与者以及Stockgrand Ltd提供检测试剂。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Actiwatch 光照监测仪Cambridge Neurotech Ltd可根据实际需求选用多种经过验证的活动记录仪设备
Sleep Analysis 7 软件Cambridge Neurotech Ltd可根据实际需求选用多种经过验证的软件
7 ml 塑料离心管可根据实际需求选用多种不同的试管或唾液采集管
DQ67OW，Intel Core i7-2600 处理器，4GB 内存，32 位 Windows 7 系统可根据实际需求选用多种不同的设备

参考文献

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