通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

摘要

本文介绍了一种在创伤性脑损伤小鼠模型中进行非侵入性间充质干细胞（MSC）递送与示踪的实验方案。采用超顺磁性氧化铁 纳米颗粒作为磁共振成像（MRI）探针，对MSC进行标记，并通过实时MRI技术在经鼻递送后实现非侵入性的活体示踪。

摘要

基于干细胞的疗法在治疗创伤性脑损伤（TBI）等脑部损伤方面具有广阔前景，已进入临床试验阶段。然而，细胞递送侵入性强、移植效率低以及细胞追踪困难等技术瓶颈，仍是干细胞转化治疗面临的主要挑战。本文介绍一种新兴的干细胞标记与追踪技术，该技术利用超顺磁性氧化铁（SPIO） 纳米颗粒对间充质干细胞（MSCs）进行标记，并通过鼻内途径递送标记后的MSCs。这些纳米颗粒嵌合荧光素异硫氰酸盐（FITC），可安全地标记MSCs，随后通过鼻内途径递送至TBI模型小鼠的脑部。标记细胞可在体内通过实时磁共振成像（MRI）进行无创追踪。该技术结合SPIO标记与鼻内递送，具有多项重要优势：（1）细胞递送后可在活体内实现长期、无创的MSCs追踪；（2）由于MSCs递送途径无创，可实现多次给药方案；（3）鉴于SPIO的安全性、MRI细胞追踪方法的无创性以及给药途径的可行性，该技术具有潜在的临床应用前景。

引言

间充质干细胞（MSC）是用于治疗人类中枢神经系统（CNS）疾病和损伤的干细胞疗法中极具前景的候选细胞。此外，MSCs 还被用作递送治疗性蛋白至损伤部位的载体^1,2。近年来，已开发出若干有前景的创新技术，旨在建立 1）新型的细胞递送途径和 2）针对 CNS 疾病干细胞治疗的细胞追踪方法。干细胞经鼻入脑的递送依赖于细胞绕过筛骨板并部分通过实质途径进入嗅球的能力³。将经鼻递送与使用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记 MSCs 相结合，为 MSCs 在治疗 CNS 疾病中的临床应用提供了有前景的策略，因为 SPIO 纳米颗粒是磁共振成像（MRI）的安全探针，可实现 MSCs 递送后通过 MRI 进行无创、灵敏且纵向的追踪^3,4,5。此外，经鼻递送是一种安全、无创的途径，可在短时间内重复给药。

本文介绍了一种高度敏感且非侵入性的技术，用于在创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型中经鼻给药后在体追踪间充质干细胞（MSCs），该技术采用超顺磁性氧化铁（SPIO）标记细胞并结合磁共振成像（MRI）。SPIO标记的一个重要优势在于可通过MRI灵敏地检测组织中的SPIO，从而实现对细胞高效且非侵入性的追踪。本研究使用的SPIO纳米颗粒为市售产品，并标记了异硫氰酸荧光素（FITC）荧光团，因此无需免疫染色或额外处理即可检测组织中的SPIO。此外，该方法还可实现长期实时追踪，并用于研究递送的MSCs在体内的生物分布。

方案

本方案中涉及动物的所有操作均经机构动物照护与使用委员会批准，并获得中国台湾台北医学大学动物使用伦理委员会的核准（批准编号：LAC-2018-0574；批准日期：2019年3月15日）。

1. 使用SPIO纳米颗粒标记MSCs

1. 为了用SPIO标记MSCs，向含有MSCs（80%融合度）的T75培养瓶中加入6 mL标记培养基（含25 µg/mL SPIO的Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]，不含胎牛血清[FBS]）。
2. 将细胞置于CO₂培养箱（37 °C，5% CO₂）中与标记培养基共同孵育，不摇动。24小时后，使用连接塑料吸头的无菌巴斯德吸管并配合真空装置，轻轻移除标记培养基。用6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞单层2次，以去除未被细胞摄取的残留SPIO。
   1. 为确认细胞是否成功标记，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察标记后的细胞，前提是所用SPIO带有荧光标记（例如本文所用的SPIO；图1B,C）。或者，可对细胞进行普鲁士蓝染色（染色步骤见6.2–6.4）。
3. 使用3 mL胰蛋白酶处理贴壁细胞以收获细胞，并在37 °C下孵育。孵育5分钟后，加入7 mL预热的含10% FBS（v/v）的DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。用移液器将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
4. 在300 x g 条件下离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，用PBS重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞数量。
   注意：由于铁的负载，标记后细胞沉淀呈现深色（图1D）。本方案适用于MSC的标记及MRI成像。MSC标记的流程⁶此前已有优化，此处仅包含为体内追踪目的而制备标记MSC的步骤，因本研究重点为体内追踪。其他细胞类型的培养与标记方案应由研究人员自行优化。
5. 用PBS调节细胞浓度，使18 µL PBS中含150,000个细胞（或达到足够MRI信号的细胞数量）（或根据鼻内给药程序所需的总体积进行调整）。
   注意：观察发现，当PBS中细胞浓度超过150,000个/18 µL时，会导致细胞聚集，可能影响鼻内给药效率。若鼻内给药需要更多细胞，可增加细胞悬液的总体积，并增加鼻内给药次数，因为鼻内给药为非侵入性操作，允许多次给药。

2. 控制性皮层冲击（CCI）损伤

注意：在本实验方案中，雄性 C57 BL/6 小鼠（7–8 周龄）饲养在 12/12 小时明暗循环条件下，并可自由摄取食物和水。

1. 为每只小鼠进行 CCI 损伤前，通过腹腔注射（i.p.）给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合物（1 mL/kg）。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度是否充分。 alternatively，将小鼠置于充满 2%–4% 异氟烷的麻醉舱中 60 秒.
2. 使用电子理发剪剃除耳间颅骨背侧表面的毛发。用浸有碘液的无菌棉签多次擦拭剃毛区域进行消毒。再用浸有70%乙醇的棉签擦去碘液。
3. 将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，使用耳杆和鼻杆固定小鼠。用无菌剪刀在剃净毛发的皮肤上做正中矢状切口（约2.5 cm），暴露颅骨表面。
4. 用棉垫去除骨骼上的组织以暴露颅骨。使用浸有3% H₂O₂的棉签清洁颅骨表面。₂O₂ 持续10秒，然后用干燥的棉垫擦拭干净。
   注意： 颅骨缝以及前囟点和后囟点现在均可轻松识别。
5. 在颅骨表面确定CCI损伤的目标坐标，并使用铅笔或适当的标记工具在坐标周围画出一个直径为4 mm的圆。
   注意： 在本方案中，采用前后方向（AP）-2.0 mm 和内外侧方向（ML）+1.5 mm 的坐标进行 CCI 诱导。
6. 使用微型钻和圆钻头（直径0.5 mm）对标记的圆形区域颅骨进行减薄。钻孔时避免施加压力，以免穿透骨质损伤脑实质。用干净干燥的棉签清除骨屑。
7. 使用无菌精细镊子轻轻移除颅骨瓣，暴露硬脑膜并保持其完整。将小鼠从用于伤前准备的立体定位仪架上取下，放入CCI装置的立体定位仪架中。
8. 使用耳杆和鼻杆固定小鼠头部。确保小鼠头部在头尾方向上保持水平，必要时调整鼻杆。
9. 根据控制盒上的说明，将撞击头调零至暴露的皮层表面。使用撞击器底座上的X轴和Y轴控制旋钮，确保撞击头精确对准目标皮层坐标的正上方。
10. 使用控制箱设置实验参数，速度为5 m/s，停留时间为250 ms，损伤深度为1 mm，以在小鼠中诱导轻度损伤。
11. 通过按控制箱上的“impact”按钮诱导损伤。若发生出血，使用无菌棉签擦拭。
12. 将小鼠从立体定位仪中取出，使用丝线手术缝合线缝合切口。禁止使用金属夹闭合手术切口，因为小鼠后续将接受磁共振成像（MRI），会暴露于磁场中。
13. 在手术部位涂抹局部抗生素（杆菌肽新霉素）以预防感染。将小鼠置于加热垫上，并在恢复期间密切监测。
14. 术后每日腹腔注射酮洛芬（2.5 mg/kg）一次，连续3天，除非酮洛芬的使用与研究目的相冲突。

3. 鼻内给药

1. 在CCI造模后第1天，通过腹腔注射给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合液。通过检测脚趾夹捏反射是否消失，确认小鼠已进入深度麻醉状态。
2. 通过透明质酸酶处理，为小鼠准备间充质干细胞的鼻内递送。
   1. 抓握小鼠颈背部皮肤，将其稳固地翻转至仰卧位，固定头部。将含有透明质酸酶的无菌PBS溶液（4 U/µL）的移液器尖端置于小鼠鼻孔附近，呈45°角。
   2. 每个鼻孔给予3 µL透明质酸酶悬液。将小鼠保持固定、仰面朝上置于洁净垫上5分钟。重复透明质酸酶处理4次（共给予100 U透明质酸酶悬液）。
3. 透明质酸酶处理后，将处理过的小鼠仰面朝上置于洁净垫上静置30分钟。
4. 为将间充质干细胞递送至脑部，按照步骤3.2.1所述方法牢固握住小鼠。每个鼻孔给予3 µL干细胞悬液，间隔3 秒。保持小鼠体位不变，持续30秒，直至液滴完全消失。
   注意：给药过程中应避免产生气泡。
5. 以2分钟间隔重复给药，最多3次。
   注意：需递送的细胞总数为150,000个，因此可在每个鼻孔分3次、每次3 µL，共给予18 µL细胞悬液。
6. 将小鼠放回笼中，并密切观察，直至其从麻醉中完全恢复。

4. 体内磁共振成像

注意：既往曾使用脑组织的组织学染色来确认经鼻给药后干细胞成功递送。然而，该方法仅可用于研究的终点检测，无法进行纵向监测。利用磁共振成像（MRI）探针对治疗性干细胞进行标记，可实现对细胞在体内的纵向、无创性追踪。重要的是，该方案可显著减少所需实验动物的数量。在本方案中，于间充质干细胞（MSCs）递送后的第1、7和14天进行了MRI扫描。

1. 为准备小鼠进行MRI扫描，使用异氟烷麻醉小鼠（5%异氟烷，氧气流速1 L/min）。₂ 诱导时使用1.5%–2%异氟烷，维持时使用1.5%–2%异氟烷。通过脚趾夹捏测试确认小鼠达到所需的麻醉深度。
2. 将小鼠放置在成像支架上，并使用胶带或其他适当方法固定其位置。将支架移至MRI线圈（7 T/40 cm磁体）中心，并连接监测装置。
3. 使用自旋回波序列采集T2*加权扫描时，将重复时间（TR）设为1500 ms，回波时间（TE）设为2.8 ms。
4. 使用16 mm × 16 mm视野（FOV）、128 × 128采集矩阵（MTX）和0.75 × 0.8 mm层厚² 采用四个信号平均值和90°翻转角（FA）。
5. 扫描完成后，将小鼠固定器从MRI线圈中心移出。将小鼠放回笼中，并密切观察，直至其完全从麻醉状态恢复。
6. 使用 ITK-SNAP 软件（版本 3.8.0）在 T2* 加权图像上追踪并定量标记的间充质干细胞⁷.
   1. 将 MRI 扫描的原始数据以 DICOM（医学数字成像与通信）格式从 MRI 设备的计算机传输至用于分析的计算机。
   2. 运行 ITK-SNAP 软件，通过点击加载 MRI 图像 文件 按钮。然后，单击 打开主图像 在菜单中。按下 打开图像 显示窗口中的按钮，然后找到并打开 MRI 图像 浏览 按钮
      注意： MRI图像中标记细胞的可视化表现为低信号区域。如果需要调整图像对比度，请选择 工具 | 图像对比度.
   3. 对低信号区域、病灶或其他脑部结构进行分割，方法是选择 活性标签 在分割标签部分，为不同的区域使用不同的标签颜色（如果需要对多个部分进行分割）。
   4. 使用 多边形 工具在 主工具栏 勾画代表SPIO标记的MSCs的低信号区域。选择 接受位于MRI图像下方。被分割的区域将显示为与分配给该特定分割的活动标签相同的颜色。对所有MRI切片重复此分割步骤。
   5. 通过选择分割区域构建三维图谱，以呈现间充质干细胞在整个大脑中的分布情况 手术刀工具 在底部 3D 工具栏，位于 分割标签 位于 ITK-SNAP 工具箱底部的区域。然后，按压 接受 在生成的3D图的底部。
   6. 为了对代表标记细胞的分割低信号区域进行定量分析（体积和平均强度），请按下 分割 顶部面板中的按钮并选择 体积与统计学.

5. 小鼠脑组织的固定与冷冻切片

1. 为固定小鼠脑组织，在最后一次 MRI 扫描后，按照先前所述方法进行经心脏灌注 4% 多聚甲醛（PFA）⁸。
   1. 断头并取出脑组织⁸。将脑组织在 4% 多聚甲醛中固定，于 4 °C 下至少放置 48 小时。
   2. 将脑组织浸入 30% 蔗糖溶液中，在 4 °C 下脱水，直至脑组织沉入溶液底部。
2. 将脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在 -20 °C 下冷冻。使用冷冻切片机将脑组织切成 14 μm 厚的切片，并贴附于载玻片上。将切片载玻片保存于 -20 °C，待后续使用。

6. 普鲁士蓝染色

注意：普鲁士蓝染色法常用于检测SPIO标记细胞中的铁含量。此处采用普鲁士蓝染色以证实MRI图像中的低信号区域对应于SPIO标记的间充质干细胞（MSCs），而非伪影。普鲁士蓝染色是检测组织中铁含量最敏感的组织化学方法之一，甚至可识别细胞内单个铁颗粒。

1. 用蒸馏水清洗脑切片玻片，持续 5 分钟。
2. 将玻片浸入染色液中 30 分钟进行 普鲁士蓝染色，染色液由等体积的盐酸（10%）和亚铁氰化钾（10%）组成，需在使用前立即配制。
3. 用蒸馏水洗涤 3 次，每次 5 分钟。用核固红复染切片 5 分钟。用蒸馏水冲洗玻片 2 次。
4. 将玻片依次浸入 95% 和 100% 乙醇中，各 2 分钟，逐步脱水。用树脂封片剂加盖盖玻片。
5. 使用光学显微镜观察脑切片中染色的细胞。
   注意： 标记细胞中的铁会呈现蓝色沉积物。

结果

鼻内给药24小时后，在T2*加权图像上，皮质损伤内侧可见SPIO标记的MSCs呈现为明显的低信号区域图2B），表明SPIO靶向迁移至损伤部位。这种迁移在给药后14天内仍可观察到，因为在此期间低信号强度未见明显减弱。图2B）。用PBS处理的受伤动物未显示低信号区域，表明所观察到的低信号区域对应于SPIO标记的MSCs，而非信号伪影图2A通过MRI在体内观察到的标记MSCs的生物分布，采用三维重建进行可视化。图2C，D）。通过普鲁士蓝染色以及在标记的MSCs中利用FITC通道检测FITC标记的SPIO，从组织学上证实了MSCs向损伤皮层的迁移图3A，B).

图1：实验方案的示意图及体外验证MSC对SPIO的摄取情况。 MSCs（A）将MSCs与SPIO共孵育24小时以进行标记，随后通过鼻内（IN）途径将标记后的MSCs递送至创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型中。在不同时间点进行MRI扫描以追踪标记的MSCs。通过（B）荧光显微镜和（C）共聚焦显微镜（使用FITC通道）对SPIO标记MSCs的效果进行验证，因为SPIO纳米颗粒已标记FITC。（D）由于铁的负载，标记后MSC的细胞沉淀呈现深色。FITC = 异硫氰酸荧光素；SPIO = 超顺磁性氧化铁颗粒；MSCs = 间充质干细胞；MRI = 磁共振成像；IN = 鼻内；TBI = 创伤性脑损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：实时 MRI 能够检测并追踪 SPIO 标记的间充质干细胞（MSC）向创伤性脑损伤（TBI）小鼠脑内损伤部位的迁移过程。（A）小鼠接受 TBI 处理后，通过鼻内途径在损伤后 24 小时给予 PBS 或 SPIO 标记的 MSC。T2* 加权图像的冠状切面显示，在给药后第 1、7 和 14 天，标记的 MSC 在损伤部位边缘表现为低信号区域（箭头所示，轮廓区域为损伤区）。PBS 处理的小鼠未见低信号区域。（B）基于冠状面 T2*-MRI 图像对损伤区域（绿色）和标记的 MSC（红色）进行分割处理。（C）基于 T2* 加权图像对小鼠脑组织进行三维重建，展示给药后 14 天 SPIO 标记的 MSC 在脑内的生物分布情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：组织学分析证实经治疗动物脑内存在SPIO标记的MSCs。 对（A）PBS处理小鼠（对照组）和（C）SPIO标记MSCs处理小鼠的脑组织切片进行普鲁士蓝染色。在MSCs处理的小鼠中检测到SPIO阳性细胞（方框内细胞，蓝色），而在给药后第14天，对照组小鼠皮层损伤部位未见阳性细胞，该结果与MRI观察结果一致。在给药后第14天，对（B）PBS处理的对照组小鼠和（D）SPIO标记MSCs处理小鼠的皮层进行荧光显微镜分析。结果显示，在MSCs处理小鼠的受损皮层区域存在FITC标记的SPIO阳性细胞（方框内细胞，绿色），而在PBS处理小鼠的皮层中未检测到FITC信号。比例尺 = 50 µm，除非另有说明。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案概述了使用超小超顺磁性氧化铁（SPIO）标记间充质干细胞（MSCs）以及经鼻给药后通过磁共振成像（MRI）追踪SPIO标记MSCs的一般操作步骤。该方案提供了一种非侵入性方法，可用于在体内研究MSCs给药后在脑内的迁移及生物分布情况。

由于间充质干细胞（MSCs）能够分泌神经营养因子，从而1）触发神经修复过程，并2）通过其在损伤区域的抗炎作用提供神经保护，因此MSCs成为基于干细胞治疗中枢神经系统（CNS）疾病和损伤的有吸引力的候选细胞^9,10,11,12。尽管由于细胞分裂过程中细胞内超顺磁性氧化铁（SPIO）标记物的稀释，对SPIO标记的MSCs进行长期MRI示踪和检测可能受到限制，但在动物模型脑内移植后数周内仍可检测到标记的细胞¹³。

本文还描述了使用葡聚糖包被的超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒对间充质干细胞（MSCs）进行标记的方案，该方法无需转染试剂。文献中已报道其他多种标记方案^14,15,16。然而，在所有情况下，这些方案均需根据细胞类型、SPIO粒径、孵育时间及SPIO浓度进行优化调整。已有研究表明，SPIO标记后的MSCs其成软骨分化潜能可能受损，但成脂分化潜能未受影响¹⁷。因此，强烈建议在干细胞移植前进行分化能力检测，以评估SPIO标记对干细胞分化潜能的影响。在先前的一项研究中已证实，使用与本文相同类型和浓度的SPIO对MSCs进行标记，并不影响其成骨或成脂分化潜能⁶。

通过鼻内途径递送治疗性干细胞以治疗脑部疾病和损伤，是干细胞临床应用的一种有前景的方法。然而，决定干细胞在鼻腔内行为的内在机制和分子机制仍不明确。尽管鼻内途径已被广泛用于小分子药物的递送，但治疗性干细胞的尺寸和生物分布行为与小分子存在差异。本方案表明，间充质干细胞（MSCs）在经鼻内递送后倾向于向损伤部位迁移。

本研究中采用T2*加权成像来追踪SPIO标记的间充质干细胞（MSCs）。其他研究曾使用梯度回波成像，但由于细胞内SPIO的存在，梯度回波成像常出现磁敏感伪影。在本实验方案中，T2*加权图像上显示的低信号区域（代表SPIO标记的MSCs）的位置与组织学检查所检测到的脑切片中SPIO分布的位置一致（图3）。这表明T2*加权自旋回波成像在脑内SPIO标记的MSCs追踪中具有足够的敏感性。

总之，所述方案有助于脑损伤和脑部疾病中的活体干细胞示踪研究。 干细胞的纵向追踪 体内研究传统上需在多个时间点处死动物。本方案提供了一种非侵入性且高效的方法，用于间充质干细胞（MSCs）的递送与示踪，代表了一种在临床环境中针对脑损伤和脑部疾病开展干细胞治疗的潜在操作流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养耗材（塑料制品）	ThermoFisher Scientific	Varies	可替换为任意来源
一次性切片刀	VWR	95057-832
含GlutaMAX的D-MEM/F-12（1×）培养基	GIBCO	10565-018
冷冻组织标本包埋介质（O.C.T.）	Sakura Finetek	4583
胎牛血清（FBS）	GIBCO	12662-029
荧光宽场显微镜	Olympus	Olympus BX43
Forcept	Fine Science Tools	11293-00	手术用
庆大霉素（10 mg/mL）	GIBCO	15710-064
毛发剪	Pet Club	PC-400
头部创伤挫伤装置	Precision Systems and Instrumentation	Model TBI-0310
牛睾丸来源透明质酸酶	MilliporeSigma	H3506
ITK-SNAP 软件	宾夕法尼亚大学宾大图像计算与科学实验室（PICSL）和犹他大学科学计算与成像研究所（SCI）	ITK-SNAP 3.8.0
氯胺酮（Ketavet）	Pfizer	778-551
小鼠	中国台湾国家实验动物中心	C57BL6	本研究中使用的野生型小鼠品系
微型钻机	Nakanishi	NE50	与钻头配合使用以制备颅骨窗
切片机	Leica	RM2265
小鼠（C57BL/6）间充质干细胞	GIBCO	S1502-100
MRI 扫描仪	Bruker Biospec
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
7.5% 聚维酮碘	Purdue product L.P.		外科刷洗剂
普鲁士蓝染色试剂	Abcam	ab150674
剪刀	Fine Science Tools	14084-08	手术用
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 900
超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒	BioPAL	Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51	用于通过MRI进行活体追踪的干细胞标记
单股缝合线	Ethicon	G697	缝合用
计时器	Wisewind		可替换为任意来源
TrypLE	GIBCO	12604-013
赛拉嗪（Rompun）	Bayer	QN05 cm92