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方法文章

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

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DOI：

10.3791/60455

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2019年12月12日

 , 
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

本文内容

摘要

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。

摘要

Notch 信号通路通过细胞间相互作用调控神经干细胞/前体细胞的维持。Notch 信号通路的组分呈现动态表达，其中信号效应因子 Hes1 和 Notch 配体 Delta-like1（Dll1）在神经干细胞/前体细胞中以振荡方式表达。由于这些基因振荡表达的周期非常短（2 小时），监测其周期性表达十分困难。为了研究基因表达或蛋白质动态的此类快速变化，需要响应速度快的报告系统。由于荧光素酶具有快速成熟动力学特性和高灵敏度，因此适用于在活细胞中监测基因表达的快速变化。我们采用了一种不稳定的荧光素酶报告系统来监测启动子活性，并使用荧光素酶融合报告系统在单细胞分辨率下可视化蛋白质动态。这些生物发光报告系统具有快速 turnover 特性，但产生的信号非常微弱；因此，我们开发了一种高灵敏度的生物发光成像系统，以检测此类微弱信号。这些方法使我们能够在活细胞和组织中监测多种基因表达动态，这些信息对于理解细胞的真实状态至关重要。

引言

哺乳动物的大脑由大量不同类型的神经元和胶质细胞组成。所有这些细胞均起源于神经干细胞/前体细胞（NPCs），这些细胞首先通过增殖扩大数量，随后开始分化为神经元，最终产生胶质细胞1,2,3,4,5。一旦细胞分化为神经元，便不再具有增殖能力或增加其数量，因此维持NPCs至发育后期至关重要。通过细胞间相互作用介导的Notch信号通路在维持NPCs中发挥重要作用6,7。Notch配体与邻近细胞表面的膜蛋白Notch结合并激活该蛋白。激活后，Notch蛋白发生蛋白水解，从而将其胞内结构域（NICD）从细胞膜释放并进入细胞核8,9,10。在细胞核内，NICD结合到Hes1和Hes5（Hes1/5）基因的启动子区域，并激活这些基因的表达。Hes1/5抑制促神经基因Ascl1和Neurogenin1/2 (Neurog1/2)的表达11,12,13,14。由于促神经基因可诱导神经元分化，因此Hes1/5在维持NPCs中起关键作用。此外，由于促神经基因能够激活Notch配体Delta样蛋白1（Dll1）的表达，Hes1/5也同时抑制Dll1的表达。因此，Dll1的表达通过Notch信号导致邻近细胞不表达Dll1。通过这种方式，细胞抑制相邻细胞采取相同的命运决定，这一现象被称为侧向抑制8。在发育中的大脑中，侧向抑制有助于生成多种不同的细胞类型。

单细胞水平的实时成像揭示神经前体细胞中Notch信号通路组分的动态表达15,16,17Notch信号通路激活基因表达 Hes1，但 Hes1 蛋白会结合到自身的启动子上并抑制其自身表达。此外，Hes1 是一种极不稳定的蛋白，可通过泛素-蛋白酶体途径被降解；因此，其对自身启动子的抑制作用仅持续较短时间，随后转录再次启动。通过这种方式，Hes1 的表达呈现振荡模式。 Hes1 在2小时周期内，转录和翻译水平均发生振荡18Hes1的振荡表达反过来会诱导其下游靶基因（如）的振荡表达， Ascl1, Neurog2 和 Dll1 通过周期性抑制15,16,17,19尽管成神经基因能够诱导神经元分化，但其振荡性表达不足以引发神经元分化；相反，成神经基因的持续表达对于神经元分化至关重要。成神经基因的振荡性表达主要作用在于维持神经前体细胞（NPCs），而非诱导神经元分化。14,15,16的表达 Dll1 在各种形态发生过程中（如神经发生和体节发生），其转录和翻译水平均呈现振荡表达。这种动态表达模式 Dll1 对正常的形态发生至关重要，而 Dll1 的稳定表达异常会诱导神经发生和体节发生的缺陷17这些研究结果表明，基因表达动态和蛋白质动力学在调控多种发育事件中具有重要作用（即不同的表达动态会导致细胞行为产生不同的结果）。

为了分析 Notch 信号通路的动态变化，对组织和细胞进行静态分析是不够的，因为它们始终处于动态变化之中。单细胞实时成像是一种揭示基因表达动态的有力工具。Notch 信号分子的动态表达在 2–3 小时周期内表现出快速的振荡反应。这种快速周期性表达为实时监测带来了两个难题：（1）分子表达水平被抑制至很低；（2）快速的更新速率需要响应迅速的报告系统。为解决这些问题，我们此前开发了一种生物发光实时成像方法20。由于生物发光报告系统比荧光报告系统具有更高的灵敏度和更短的成熟时间，该策略使我们能够在活细胞中监测快速的动态变化。通过实时可视化观察，我们发现表现出动态表达的基因数量远超此前预期。此外，越来越多的研究报道了活细胞中基因表达与蛋白质动态变化的现象，并揭示了这些动态变化在多种生物学事件中的重要意义，提示基因表达的动态特性在生命活动中具有基础性作用21,22。

在本报告中，我们描述了一种在解离培养和皮层脑片培养中可视化观察神经前体细胞（NPCs）中Notch配体Dll1表达的方法。为了在单细胞水平监测Dll1基因的转录动态，我们建立了来源于携带pDll1-Ub-Fluc报告基因的转基因小鼠胚胎端脑的NPC解离培养体系，该报告基因由Dll1启动子驱动表达一种不稳定化的荧光素酶。为了在体内监测Dll1蛋白的动态变化，我们将Dll1-Fluc融合报告基因导入皮层中的NPCs，并在皮层脑片培养中观察该报告基因在NPCs中的表达情况。实时成像使我们能够以高时间分辨率捕捉活细胞中基因表达和蛋白质动态的各种特征。

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方案

所有涉及动物受试者的实验程序均已获得京都大学前沿生命与医学科学研究所机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 生物发光报告基因

注意：通过融合降解信号，荧光素酶报告基因适用于快速检测启动子活性的动态变化。此外，荧光素酶融合报告基因可实现对单细胞中蛋白质动态的监测。这两类报告基因系统均可用于单层培养（解离培养）和组织培养（切片培养）实验。

  1. 用于监测 Dll1 启动子活性的报告基因17
    注意：为了监测基因表达的快速变化，必须使用具有快速响应和不稳定特性的报告基因。与荧光素类报告基因相比，萤火虫荧光素酶（Fluc）成熟速度更快。由于泛素融合的荧光素酶报告基因（Ub-Fluc）具有快速降解和高周转率的特性，因此非常适合用于活细胞中动态基因表达的监测20。
    1. 使用由 Dll1 启动子驱动的不稳定型荧光素酶报告基因（泛素化荧光素酶，pDll1-Ub-Fluc，图1A 上图），在转录水平上监测 Dll1 表达的快速变化17。
    2. 构建携带 pDll1-Ub-Fluc 的转基因小鼠品系，以实现该报告基因的稳定表达。
  2. 用于监测 Dll1 蛋白动态的报告基因17。
    1. 为构建基因敲入小鼠，将荧光素酶 cDNA 插入 Dll1 编码区的 3´ 末端，使 Dll1-荧光素酶融合蛋白得以表达（Dll1-Fluc 报告基因，图1A 下图）17。
    2. 通过检测荧光素酶活性，监测 Dll1 在蛋白水平的表达动态。
    3. 为在组织水平上监测 Dll1 蛋白动态，可通过子宫内电穿孔技术将 Dll1-Fluc 报告基因导入胚胎端脑中的神经前体细胞（NPCs）。

2. 生物发光成像系统

  1. 构建一个生物发光活体成像系统，使用配备高灵敏度、水冷式CCD相机的倒置显微镜。为了降低噪声并获得高灵敏度，通过循环水冷却系统在优化温度-90 °C下对相机进行冷却。
  2. 对于活细胞/组织成像，将可控制温度和混合气体的培养系统安装至显微镜载物台上。
  3. 在对不稳定型荧光素酶报告基因表达进行成像时，使用高数值孔径（NA: 1.30）的40倍油浸物镜。该物镜的工作距离为0.2 mm，不仅适用于单层细胞培养，也适用于组织切片培养。
  4. 为同时监测荧光素酶和荧光素报告基因的表达，将LED照明装置安装至显微镜的光路中。
  5. 使用与显微镜配套的软件控制时间序列成像（例如MetaMorph软件的多维采集程序）。
  6. 将整个系统置于暗室中准备，因为不稳定型荧光素酶报告基因的信号非常微弱，需避免外界光线干扰成像采集。

3. 神经干细胞/前体细胞（NPC）分离培养

  1. 神经前体细胞分离培养的培养基、培养皿及试剂准备
    1. 配制用于培养神经干细胞/前体细胞的 N2/B27 培养基，其成分为 DMEM/F12 培养基中添加终浓度为 1x N2、1x B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸、10 ng/mL bFGF 和 50 U/mL 青霉素/链霉素。
    2. 配制用于组织解离的木瓜蛋白酶溶液：在 EBSS 培养基中加入终浓度为 7 U/mL 木瓜蛋白酶、0.006% DNase 和 1 mM N-乙酰半胱氨酸。
    3. 配制 100 mM 的D-荧光素钠溶液用于生物发光成像。将 100 mM 荧光素溶液用 N2/B27 培养基稀释至终浓度为 1 mM。
      注意：荧光素本身具有自发荧光。在进行荧光素酶-荧光双模成像（尤其是 EGFP）时，将荧光素浓度降低至 0.5 mM 更为合适。
    4. 用 40 μg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液在室温下对 35 mm 玻底培养皿（玻璃直径 27 mm）包被 1 小时。孵育后，用 PBS 洗涤 3 次，并使其自然干燥。
  2. 胚胎解剖及神经前体细胞的分离
    1. 通过 CO2 窒息和颈椎脱位法处死怀孕的 pDll1-Ub-luc 转基因小鼠（胚胎第 12.5 天（E12.5）），切开腹部并取出子宫。
      注意：研究人员必须遵守所在机构动物实验委员会的相关规定和指南。如使用麻醉或镇痛药物，应正确使用。
    2. 将子宫转移至含有 25 mL 冰上预冷 PBS 的 10 cm 培养皿中。在冰上预冷的 PBS 中使用显微剪刀和精细镊子取出胚胎。
    3. 用剪刀剪下每个胚胎的头部，并转移至含有冰上预冷 DMEM/F12 培养基的 10 cm 培养皿中。去除脑组织周围的表皮和软骨，然后将脑组织转移至含有 3 mL 冰上预冷 N2/B27 培养基的 35 mm 培养皿中。
    4. 从间脑处分离出左右端脑（图 1Ba-f, C,D）。使用精细镊子去除覆盖在端脑表面的脑膜（图 1Bi）。再次使用精细镊子，从端脑中取出大脑皮层的背外侧部分（图 1Bg,h,j-l E）。
    5. 使用 P1000 移液器将组织转移至新的 1.5 mL 离心管中，并用 P200 移液器吸除多余液体。每份脑组织（一对皮层）加入 0.1 mL 木瓜蛋白酶溶液。在 24 °C 下孵育 15 分钟后，用 P1000 移液器轻柔吹打 10 次。再次于 24 °C 下孵育 15 分钟。
    6. 用 P1000 移液器轻柔吹打样品 10 次。在 400 x g 条件下，室温离心 3 分钟，弃去上清液。
    7. 向沉淀中加入 1 mL DMEM/F12 培养基，用 P1000 移液器轻柔吹打 10 次。在 400 x g 条件下，室温离心 3 分钟，弃去上清液。重复此步骤至少再进行 2 次。
    8. 向细胞沉淀中加入 0.5 mL 含 1 mM 荧光素的 N2/B27 培养基并充分混匀。将细胞（1 × 106 个细胞）接种至已包被 PLL 的玻底培养皿中。在 CO2 培养箱中培养 1 小时。待细胞贴壁后，加入 2 mL 含 1 mM 荧光素的 N2/B27 培养基。
  3. 神经前体细胞分离培养中荧光素酶报告基因表达的可视化
    1. 在开始解剖操作前，启动生物发光活细胞成像系统。对于神经前体细胞培养，将载物台培养箱的温度设定为 37 °C，并将气体混合条件设定为 20% O2、5% CO2。
    2. 在物镜上滴加浸没油，将样品培养皿放置于显微镜载物台上。手动观察视野，选择最佳位置并对目标细胞进行调焦。点击 live 按钮以获取测试图像。
    3. 使用 多维采集 程序进行时间序列成像，以二维模式（生物发光与明场）连续采集 24 小时。选择 多维采集 程序，并按以下参数设置采集条件（见步骤 3.3.6）。
    4. 生物发光图像采集时使用以下相机参数：低转移速率（50 kHz）、2 × 2 或 4 × 4 二合一像素合并、曝光时间 10 分钟或 5 分钟；明场图像采集时使用以下参数：中等转移速率（1 MHz）、1 × 1 像素合并、曝光时间 100 毫秒。

4. 体内电穿孔

注意：此步骤用于将 Dll1-Fluc 报告基因导入神经前体细胞。

  1. 电穿孔实验所需工具与试剂的准备
    1. 准备用于将DNA注射至胚胎端脑脑室的显微毛细管。用加热法拉伸玻璃毛细管，并使用抛光仪切割并抛光其尖端。
    2. 制备含染料的DNA混合液（例如台盼蓝）。将每种DNA溶于PBS中，浓度为1 μg/μL，再加入染料至终浓度为10%。
      注：使用以下DNA混合物以可视化Dll1蛋白动态：Dll1-Fluc（Dll1蛋白报告基因，图2E上图）和pEF-EGFP（由EF启动子驱动的EGFP表达载体，图2E下图），用于监测转染细胞的位置与形态。
    3. 准备两种麻醉剂：将戊巴比妥钠配制成3.88 mg/mL，赛拉嗪配制成0.12%，均溶于无菌1×PBS中。
    4. 手术过程中使用无菌器械和无菌外科手套。
  2. 子宫内电穿孔
    1. 对妊娠时间明确的ICR小鼠（E12.5）进行腹腔注射麻醉，注射体积为500 μL的3.88 mg/mL戊巴比妥钠和500 μL的0.12%赛拉嗪。
      注：研究人员必须遵守动物实验相关管理规定。如需使用麻醉或镇痛药物，应合理使用。
    2. 剪除腹部毛发，并用外科消毒液对皮肤进行消毒。
    3. 检查趾部夹捏反射是否消失。确认无足底反射后，沿腹中线做2–3 cm切口。在暴露区域周围放置纱布，并用温热的PBS润湿纱布，防止切口干燥。用环形镊子轻柔地取出右侧子宫角，计数胚胎数量。
    4. 用显微毛细管将1–2 μL DNA混合液轻柔地注射至胚胎端脑的脑室内。
      注：若注射成功，可在子宫表面观察到染料的蓝色。
    5. 在施加电压脉冲前，将子宫和电极润湿，然后轻柔固定胚胎头部。将带正电的电极置于注射DNA的一侧大脑半球。确保电穿孔脉冲条件为30–50 V，持续50 ms，脉冲间隔为1 s（50 ms充电，950 ms不充电）。对每个胚胎施加5次脉冲，并观察负极电极处是否有气泡产生。
      注：注意电极方向：DNA会进入正极侧的细胞。操作过程中不得移动电极位置。
    6. 对其他胚胎重复步骤4.2.3–4.2.4，并将子宫角放回腹腔。对左侧子宫角内的胚胎执行相同操作。
    7. 将左侧子宫复位后，使用丝线缝合线（4-0）和缝合针（17 mm）缝合切口。在完全关闭切口前，向腹腔内注入温热的PBS。
      注：缝合线间距约为2 mm。
    8. 手术结束后，将小鼠置于加热垫上以促进麻醉后恢复，并单独饲养。
      注：研究人员必须遵守所在机构关于动物实验的管理规定。如需使用镇痛药物，应合理使用。

5. 发育皮层切片培养的制备及皮层切片中荧光素酶报告基因表达的可视化

  1. 皮层脑片培养的培养基与试剂准备
    1. 制备用于皮层脑片培养的富集培养基，其中包含5%胎牛血清和5%马血清的N2/B27培养基。
    2. 将100% O2气体通入DMEM/F12培养基中，用于组织解剖及制备皮层脑片。
      注意：为安全使用氧气，应将O2气瓶存放于气瓶柜中，并使用氧气浓度检测仪监测空气中的氧气浓度。
    3. 用富集培养基将100 mM荧光素钠溶液稀释至终浓度为1 mM。
      注意：荧光素本身具有自发荧光。在进行荧光素酶-荧光双模成像（尤其是EGFP）时，建议使用较低浓度的荧光素（0.5 mM）。
    4. 将多气体培养箱设置为37 °C、40% O2和5% CO2。
  2. 胚胎解剖及荧光报告基因表达检测
    1. 对通过子宫内电穿孔导入报告基因（E13.5）的孕鼠实施安乐死后，切开腹部并取出子宫。
      注意：研究人员必须遵守动物实验相关法规。如使用麻醉剂或镇痛药物，应正确使用。
    2. 将子宫转移至含有PBS的10 cm培养皿中。在PBS中使用显微剪刀和精细镊子取出胚胎，剪下每个胚胎的头部，并转移至含有经100% O2气体饱和的DMEM/F12培养基的10 cm培养皿中。在DMEM/F12培养基中去除脑组织周围的表皮和软骨。
    3. 用环形镊子将脑组织置于培养皿盖上，并将皿盖放置于荧光体视显微镜载物台上。在激发光下观察皮层区域中荧光蛋白的表达情况（图2A,B）。
    4. 将脑组织转移至盛有30 mL经100% O2气体饱和的DMEM/F12培养基的硅胶橡胶切片板中。用精细镊子去除端脑表面覆盖的脑膜。
    5. 用显微手术刀或精细镊子沿背侧端脑内侧与外侧部分的边界切开，分离为两个半球。使用显微手术刀将皮层切成条状，制备皮层脑片（图2C,D）。用移液器吸取含脑片的培养基，转移至35 mm培养皿中的富集培养基内。
    6. 将脑片放置于玻璃底培养皿中含富集培养基的培养插件上，用精细镊子调整脑片方向，使脑片的切面朝向培养插件表面。用移液器吸除多余培养基。将脑片置于设置为40% O2、5% CO2、37 °C的多气体培养箱中孵育30分钟。
    7. 向玻璃底培养皿中培养插件外侧加入300 μL含1 mM荧光素的富集培养基。
  3. 脑片培养中荧光素酶报告基因表达的可视化
    1. 在开始解剖前启动生物发光活细胞成像系统。脑片培养条件设置为：40% O2、5% CO2、37 °C。
    2. 在40倍物镜上滴加浸油，将样品培养皿置于显微镜载物台上。在激发光下获取荧光测试图像，并设定目标区域的位置与焦平面。
    3. 进行连续24小时的三维（生物发光、荧光和明场）时间序列成像（图2F-H）。生物发光图像采集参数如下：低转移速率（50 kHz）、2×2或4×4像素合并、曝光时间10分钟或5分钟；荧光与明场图像采集参数如下：中等转移速率（1 MHz）、1×1像素合并、曝光时间100 ms。

6. 图像处理与分析

  1. 连接每幅图像并生成图像堆栈。从 文件 菜单中点击 导入图像序列（文件 | 导入 | 图像序列），选择保存已获取图像的文件夹。在 文件名包含 列中输入文件名中包含的部分文字。
  2. 为去除生物发光图像中的宇宙射线噪声，应用 ImageJ/Fiji 的 SpikeNoise Filter 插件。打开图像堆栈后，点击 SpikeNoise Filter。
  3. 应用 Savitzky Golay Temporal Filter 插件以获得报告基因表达的清晰动态变化。打开图像堆栈后，点击 Savitzky Golay Temporal Filter。
  4. 为测量报告基因表达的强度，对每个单细胞应用 Z Axis Profile Plus 插件。选择细胞并设置感兴趣区域（ROI），然后点击 Z Axis Profile Plus。

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结果

Hes1/7 基因的表达在多种细胞系以及体节发生过程中均表现出约2小时的振荡周期。此外，该振荡周期非常短，其mRNA和蛋白质均极为不稳定，半衰期约为20分钟。若使用响应缓慢的报告基因，则无法追踪如此快速的动态变化；而若使用稳定的报告基因，其产物会逐渐累积，无法反映基因表达的真实振荡情况。因此，报告基因必须能够快速降解，才能准确监测这类周期性表达基因的快速周转过程。为克服上述问题，我们采用荧光素酶报告系统来监测振荡基因的动态表达。由于生物发光报告系统的成熟时间短且灵敏度高，使其能够用于监测超日节律振荡器的快速动态变化。与荧光报告基因类似，荧光素酶报告基因也可通过与目标基因编码序列融合的方式，实时监测蛋白的表达动态（图1A、图2E 和 图3D）。荧光素酶融合基因产物在细胞内的表达、降解及转位动力学特性与内源性蛋白一致。此外，为监测振荡基因

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讨论

Notch 信号通路的组分在体节发生过程中表现出同步的振荡性表达，而在神经发生过程中则呈现不同步的振荡，这导致在后一种情况下难以通过静态分析捕捉其表达动态。因此，需要实时监测以揭示 Notch 信号通路组分（如 Hes1 和 Dll1）的表达动态。由于 Hes1 和 Dll1 振荡表达的周期极短，约为 2–3 小时，因此需要响应迅速且不稳定的报告基因系统来监测其表达动态。为此，我们开发了生物发光报告基因与成像系统。荧光素酶报告基因具有快速成熟动力学和高灵敏度，可有效追踪此类周期性基因表达的快速转换过程。然而，报告基因的快速降解会导致产生的信号极为微弱。为了检测这些由生物发光报告基因产生的微弱信号，我们采用了一套优化的生物发光成像系统，包括一个高灵敏度、水冷式 CCD 相机，并配备超低读出速度（50 kHz），以将噪声降至最低。此外，高数值孔径（N.A.）的物镜使我们能够最大程度地收集来自不稳定化荧光素酶报告基因所释放的光信号。为了获得更高的灵敏度，我们通常使用较高的像素合并模式（例如 2 × 2、4 × 4、8 × 8），并保持长时间的曝光（例如 5–20 分钟）。...

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披露

作者无利益冲突的财务关系。

致谢

感谢岩本由美子对视频制作的支持。我们还感谢石村彰宏在图像分析方面的讨论与支持，宫地仁志在转基因动物制备中的技术支持，以及来自奥林巴斯医疗科学的新庄裕司、江川正俊、石津拓也，以及安道尔日本的国滝欧因，他们在生物发光成像系统方面提供了技术支持与讨论。本研究得到了革新性科学技术研发项目（JPMJCR12W2）（R.K.）、文部科学省创新领域科学研究所助成金（MEXT 24116705 对 H.S.，MEXT 16H06480 对 R.K.）、日本学术振兴会科学研究费补助金（C类）（JSPS 18K06254）（H.S.）、武田基金会（R.K. 和 H.S.）以及日本文部科学省“生命系统动态解析平台”的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物发光成像系统
冷却水循环器（冷水机）Julabo型号：F12-ED
制冷CCD相机Andor Technology型号：iKon-M 934
培养箱系统TOKAI HIT型号：INU-ONICS
倒置显微镜Olympus型号：IX81
倒置显微镜Olympus型号：IX83
LED照明装置CoolLED型号：pE1
MetaMorphMOLECULAR DEVICES型号：40000
混合气体控制器Tokken型号：TK-MIGM OLO2
物镜Olympus型号：UPLFLN 40X O
解剖前准备
解剖显微镜Nikon型号：SMZ-2B
荧光体视显微镜Leica型号：MZ16FA
精细镊子DUMONTINOX No.5
剪刀、显微剪刀
镊子
环形镊子
10 cm塑料培养皿greiner664160-013
35 mm塑料培养皿greiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
神经前体细胞分离培养试剂
B27添加剂invitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029储存液：0.1% BSA/PBS中1 μg/ml
D-荧光素Nacalai Tesque01493-85储存液：0.9%生理盐水中100 mM
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172储存液：EBSS中1000 U/ml
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
玻璃底培养皿IWAKI3910-035
N2添加剂（100倍浓缩）invitrogen17502-048
N-乙酰半胱氨酸SigmaA-9165-25G
木瓜蛋白酶Worthington Biochemical CorporationLK003178储存液：EBSS中7 U/ml
青霉素/链霉素Nacalai Tesque09367-34
聚-L-赖氨酸SigmaP-628140 mg/ml溶于去离子水
子宫内电穿孔准备
50 ml注射器TERUMO181228T
电极Neppagene7 mm
电穿孔仪NeppageneCUY21 EDIT
镊子
纱布Kawamoto co.7161
微毛细管自制
PBSNacalai Tesque14249-24
戊巴比妥KyoritsuseiyakuSomnopentyl
环形镊子
剪刀、显微剪刀
缝合针Akiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
赛拉嗪BayerSeractal
脑片培养准备
10 cm塑料培养皿greiner664160-013
35 mm塑料培养皿greiner627160
培养插件MilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
胎牛血清Sigma172012-500ML
精细镊子DUMONTINOX No.5
镊子
马血清Gibco16050-122
显微手术刀Alcon19 Gauge V-Lance
多气体培养箱PanasonicMCO-5MUV-PJ
N2/B27培养基自制参见：神经前体细胞分离培养
PBSNacalai Tesque14249-24
环形镊子
剪刀、显微剪刀
硅橡胶切割垫自制

参考文献

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
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  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
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