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Campylobacter jejuni 在人粪便标本中于转运培养基内的检出限与存活能力的培养检测方法

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DOI：

10.3791/60457

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2020年3月10日

 ,  , 
1TECHLAB, Inc.

本文内容

摘要

尽管粪便培养用于 弯曲杆菌 不精确，但仍被视为鉴定的金标准。用于确定检测限及在转运培养基中存活情况的方法 C. jejuni 在人粪便中的检测方法被描述，并与一种准确性更高的新型免疫测定法进行了比较。

摘要

用于诊断由Campylobacter引起的肠道疾病的粪便培养通常需要数天时间，这一等待过程对医生和患者的耐心都是考验。此外，培养方法还容易因样本处理过程中细菌活力的随机丧失、其他粪便菌群的过度生长，以及多种致病性Campylobacter菌种在传统培养基上生长不良而出现假阴性结果。这些问题可能干扰临床治疗决策，并限制了该领域对Campylobacter生长与感染基本问题的研究。本文描述了一种用于估算培养法可检测细菌数量下限的实验流程，以及一种量化脆弱的C. jejuni在运输培养基中存活能力的方法。掌握这些信息后，即可为诊断试验设定具有临床意义的检测阈值，并探讨一些尚未研究的问题，例如无症状定植是否普遍、是否常与其他肠道病原体共感染，或细菌载量是否与症状及严重后遗症相关。本研究还检测了1,552份前瞻性收集的腹泻患者粪便样本，这些样本最初通过常规培养法进行分类，并进一步采用一种新的酶免疫测定法进行检测。对阳性及结果不一致的样本，再通过四种分子方法进行筛查，以确定其真实阳性或真实阴性状态。五种非培养方法在全部48份阳性和结果不一致样本中完全一致，而培养法错误识别了其中14份（28%）。培养法错误识别的样本包括13份假阴性和1份假阳性样本。该基础实验方案可适用于多种Campylobacter菌种，有助于确定引发人类胃肠炎症状的Campylobacter细菌数量，并更新其流行率数据。

引言

美国疾病控制与预防中心（CDC）近期发布，食源性疾病主动监测网络（FoodNet）监测项目报告了9,723例实验室确诊的食源性疾病病例 弯曲杆菌 2018年的感染1。这代表了12%的增长 弯曲杆菌 2015−2017 年的病例报告1全球范围内， 弯曲杆菌 spp. 是最常见的细菌性肠道感染之一2然而，数量的 弯曲杆菌每年发生的基于肠道的疾病病例据怀疑存在漏报情况3这种低估是可以预见的，因为大多数患者仅需忍受中度不适，无需医疗干预即可康复。然而，对于症状较重或有较高风险发展为严重疾病的患者，若其寻求医疗救治，粪便培养仍是评估是否感染的最常用方法 弯曲杆菌 是导致他们痛苦的病原体4.

对于 弯曲杆菌 spp.，粪便培养尤其困难。最常见的致病菌为 空肠弯曲菌，结肠弯曲菌，上皮弯曲菌， 和 C. lari 是微需氧的5这意味着细菌一旦暴露于空气中，将以随机且未知的速率死亡。因此，标本采集与培养接种之间的时间便成为影响可存活细菌检出能力的一个不可控变量。 弯曲杆菌 通过培养鉴定种（spp.）。

对于粪便标本的直接培养，Campylobacter 生长缓慢也是一个问题。Campylobacter 菌落在培养48小时后仍然非常微小，容易被粪便基质中其他竞争性微生物覆盖。目前广泛使用含有抗生素的培养基，其中大多数 C. jejuni 和 C. coli 菌株对这些抗生素具有耐药性，从而抑制了许多（但并非全部）竞争性粪便细菌的生长，有助于更清晰地观察 Campylobacter 菌落6。然而，其他 Campylobacter 物种，如 C. lari 和 C. upsaliensis，对其中某些抗生素敏感，可能生长不良甚至完全不生长。这导致由这些对抗生素敏感物种引起的 Campylobacter 感染被低估7。

培养空肠弯曲菌（Campylobacter）结果不准确的第三个原因是：细菌在受到压力时可能仍然存活，但会进入“不可培养”状态"non-culturable"8。根据定义，这意味着培养方法无法检测到样本中存在的细菌。这种情况的发生频率尚不清楚8。

鉴于培养方法可能存在这些潜在问题，我们采用了多种比较参照方法，以避免因培养结果错误而导致某一种对照检测显得不准确9。所采用的培养方法（例如，Campylobacter选择性培养基、转运培养基、产气袋）因其在临床实验室中广泛用于粪便标本培养而被选用10。

本文所述的培养方案是由于尚不清楚通过培养法在人类粪便中可检测到的Campylobacter jejuni的最低数量而开发的。尽管已有文献报道了禽类粪便中菌落形成单位（CFU）数量的估计值11，但这些结果不能直接等同于人类粪便的情况，因为Campylobacter spp. 在鸡体内属于共生菌，不会引起腹泻。这一基础信息对于确定在人体中引发胃肠炎症状的Campylobacter细菌数量，以及比较不同菌株或物种之间的毒力至关重要。

方案

1. 计数 弯曲杆菌 在人工制备的人类粪便样本中

注意：所有步骤均需在已消毒的层流安全罩内，使用无菌技术并在一次性防护垫上进行。

警告：活的Campylobacter具有传染性，可引起包括腹泻在内的疾病。操作细菌时务必佩戴手套、实验服和护目镜。禁止用口吸移液。所有接触过细菌的材料必须丢弃在适当的生物危害容器中。

  1. 细菌菌种培养物的培养
    1. 获取菌株 C. jejuni (ATCC-33560) 或 C. coli (ATCC 33559) (材料表）作为干燥或冷冻培养物，并根据制造商说明重新水化或解冻细菌。将重悬的细菌划线接种于琼脂平板上 弯曲杆菌-特异性琼脂平板接种以启动培养。将平板置于含微需氧气体发生袋的厌氧罐中，37 °C 培养 48 小时。
    2. 次日，配制100 mL含0.5%胰蛋白胨、0.5%蛋白酶肽胨、0.0125%丙酮酸钠和0.0125%亚硫酸氢钠的脑心浸液（BHI）生长培养基。
    3. 用松散的盖子盖住BHI肉汤的烧瓶，并将其放入厌氧罐中，罐内放置一个可产生微需氧环境的小袋。在37 °C下预还原肉汤过夜。同样地，进行预还原 弯曲杆菌-用于步骤1.1.10和1.2.2菌落计数的特异性平板
    4. 作为 弯曲杆菌 对空气敏感，接种肉汤前应提前准备好所有材料，操作培养物时动作要迅速。准备接种时，将胎牛血清（FBS）加入预还原肉汤中，使其终浓度为总体积的4%。保留1 mL预还原肉汤作为对照，用于600 nm波长下光密度（OD）测定的空白校准。600).
    5. 移除含有胎牛血清（FBS）的3 mL预还原培养基，并用该培养基刮取含有起始菌的平板 弯曲杆菌 培养。用接种环轻轻刮取平板上的菌落，然后将菌悬液转移至无菌试管中。
    6. 将约3 mL细菌悬液接种至100 mL预还原培养基中，在含有产气袋的厌氧罐内，于37 °C、115 rpm轻度振荡条件下培养。
    7. 通过分光光度法以浊度监测细菌在 OD 处的生长情况600使用预留的肉汤作为空白对照。如果厌氧罐已被打开，需更换气体发生袋。
    8. 在培养48−72小时后或OD值达到指定范围前终止肉汤培养600 数值达到约0.4。
      注意：此 OD600 通常相当于107 至 108 CFU/mL。参见 表1 以获得典型结果。
    9. 为确定纯培养物中的细菌数量，将100 µL肉汤在900 µL稀释缓冲液中进行八次10倍系列稀释，材料表）。在取出100 µL肉汤进行首次稀释后，将烧瓶放回厌氧罐中，并放入新的气体发生袋，等待用于加标粪便样本池。
    10. 使用无菌涂布珠将100 µL的10⁻⁶稀释液均匀涂布于平板上-5 至 10-7 在已预还原的重复样本上进行稀释 弯曲杆菌- 来自步骤1.1.3的特异性平板。用所使用的稀释度标记平板，将其放入装有气体发生袋的第二个厌氧罐中，在37 °C下孵育48−72小时。
      注意：参见 图1 和 图2 用于稀释方案及菌落照片。
    11. 生长后，选择菌落数在30−300之间的平板进行计数。利用计数值，通过以下公式计算原始肉汤培养物的CFU/mL： 公式 1：

      原液中的菌落形成单位/毫升（CFU/mL）= 所选（重复）分析平板上的平均菌落数 ÷ （涂布体积（mL）× 平板稀释倍数） [公式 1]
  2. 人为制备临床粪便标本的制备与计数
    1. 在完成步骤1.1.10中用于分析计数的平板制备后，立即通过将储备肉汤进行连续10次2倍稀释，制备第二组储备肉汤稀释液，并加入一个 弯曲杆菌阴性粪便样本池（NFP）。例如，通过将等体积的肉汤与NFP混合（如各0.1 mL）制备第一级稀释液，随后通过将指定体积的肉汤与NFP混合液转移至含有等量指定体积NFP的试管中进行后续梯度稀释。设置一个不含NFP的肉汤对照平板 弯曲杆菌 添加到粪便样本池中以帮助识别非弯曲杆菌 菌落。
      1. 从已去标识化、经过检测且确认为阳性的腹泻患者监测样本或健康供体粪便中制备NFP 弯曲杆菌-阴性，通过诸如以下方法 弯曲杆菌 酶联免疫吸附测定和16S rRNA qPCR。
    2. T型划线接种每种10 µL 弯曲杆菌在已预还原的重复样本中进行粪便稀释 弯曲杆菌-特异性琼脂平板。将平板放入厌氧罐中，并加入产气袋，于37 °C培养48 ± 2小时。
    3. 目视检查划线平板上是否有与纯培养物相似的菌落 弯曲杆菌 培养物。
      注意：通常在第三象限可找到这些结果。参见 图1 和 图2 用于稀释方案以及菌落大小、颜色和形态的图像。
    4. 选择多个 弯曲杆菌类菌落及革兰染色。使用油镜显微镜检查稀疏划线区域，观察是否存在革兰阴性、呈弯曲状、螺旋状或雪茄形的小型细菌。
      注意： 弯曲杆菌 为革兰氏阴性菌，需使用碱性品红作为复染剂（而非常规的沙黄）以准确观察。可见典型的海鸥翼状细菌，但并非必需特征。参见 图2 用于代表性显微照片。
    5. 如果某一特定稀释度的两个重复平板中任意一个含有1个或更多个 弯曲杆菌 菌落出现，视为粪便培养阳性。
    6. 考虑最后一个含有可见产物的稀释度 弯曲杆菌类似革兰氏阴性菌落的培养检测限。使用 公式 2 计算人工临床粪便标本中阳性稀释液的CFU/mL：

      粪便样本中的CFU/mL = 最后一个阳性菌落的分析CFU/mL ÷ 稀释倍数 [方程 2]

      注意：参见 表2 用于典型结果。

2. 细胞活力测定 弯曲杆菌 保存于运输培养基中

  1. 将1 mL Campylobacter 肉汤培养物（步骤1.1.8）与1 mL NFP混合，用NFP制备10份两倍系列稀释液。随后将每份稀释液在Cary-Blair保存液中进一步额外稀释1:4，操作方式与临床样本在转运培养基中的处理方式相同。
  2. 将20个稀释管及一个阴性对照管密封后置于2−8 °C的Cary-Blair培养基中保存96小时，分别在0小时及之后每24小时对各稀释度的菌落进行计数。进行菌落计数时，取肉汤-粪便混合管样本，并设置粪便培养，对每个稀释度进行双份菌落计数。
  3. 每天取10 µL粪便稀释液涂布于Campylobacter选择性琼脂平板，按上述步骤1.1.9−1.2.7所述条件于37 °C培养48小时。
  4. 同步按上述方法（步骤1.1.9−1.1.11）对原始菌种储备液（来自步骤1.1.8或新鲜培养的肉汤菌液）进行分析性平板菌落计数。计算原始菌种储备液的CFU/mL（公式1），并据此推算转运培养基中粪便样本及其稀释液的细菌浓度（公式2）。

3. 验证培养结果的非培养检测方法

  1. 采用酶免疫分析法（EIA），选择假阳性结果最少的试剂盒12，并严格按照说明书操作，以验证培养结果。
  2. 使用可检测多种弯曲菌属（Campylobacter）物种的16S rRNA基因或其他基因的分子检测方法13。需确认该分子检测方法能够与在含抗生素的标准琼脂培养基上生长不良的物种（如 C. upsaliensis 或 C. lari）发生反应14。按照制造商说明，从粪便样本中提取DNA并进行检测。
    注意：对16S扩增产物进行双向DNA测序，可用于确认阳性样本中弯曲菌属（Campylobacter）的具体物种。特异性PCR（目标基因见Table 3）也可用于鉴定结果不一致或阳性样本中存在的物种15。

结果

在竞争性粪便菌群中识别Campylobacter spp. 菌落需要敏锐的观察力和丰富的判断经验。尽管据估计患者样本中可能含有 106−109 CFU/mL16,17 的细菌，但通过培养法能够检测到的最低菌落数量尚未得到系统研究。然而，患者样本无法用于定量分析，因为目前尚无独立方法可准确确定样本中的细菌数量。为克服这一局限，需使用同一批细菌储备液进行两项同步测量：一项用于在模拟临床样本的粪便基质中，通过系列稀释法肉眼观察Campylobacter菌落的可见检出情况；另一项则用于分析测定用于接种的细菌储备培养液中的 CFU/mL 含量（图 2A）。

弯曲杆菌的检测阈值不会是固定值。这是可以预期的，因为每种粪便基质都具有复杂性和独特性，且细菌的生长具有变异性。成功的关键参数是在竞争性粪便菌群中识别出针尖大小的菌落。图2C和图2D展示了加标粪便培养的代表性平板。未添加Campylobacter的阴性对照平板对于识别其他粪便菌群具有重要意义。对多个候选菌落进行革兰染色，也有助于训练观察者区分正确的有光泽菌落、品红染色的革兰阴性菌所呈现的中间粉红色，并确认所选菌落中细菌的形态（图2B）。共进行了七次独立实验，使用了5种C. jejuni和2种C. coli培养液，所得阈值范围重叠，介于0.3−5 × 106 CFU/mL之间。典型数据见表2。C. jejuni的平均检测限为2 × 106 CFU/mL，C. coli为1.2 × 106 CFU/mL。这表明，在临床实验室广泛使用的含抗生素的标准弯曲杆菌特异性琼脂上，培养法可能能够检测到每克粪便标本中约1−2 × 106的C. jejuni或C. coli。目前存在多种含不同抗生素的专用琼脂，其菌落检测阈值可能有所不同。本文所述方法应能促进更多定量和比较性研究，以提高培养法的准确性，并拓展新型培养基的适用性。例如，在第一个10-5稀释度平板上计数到152个菌落，在第二个10-5稀释度平板上计数到144个菌落，两个平板的平均值为148个菌落。这些平板接种了0.1 mL（100 µL）的10-5稀释液，根据公式1，相当于纯培养物原液中含148 × 106（即14.8 × 107）CFU/mL。在制备粪便稀释液时，将培养物以1:1比例加入阴性粪便混合液中。因此，根据公式2，粪便稀释曲线上的第一个点（平板“a”）对应浓度为14.8 × 107除以2，即7.4 × 107 CFU/mL。该“a”管用于制备后续9个稀释度。图1中，最后一个可见到单个革兰阴性、具有弯曲杆菌样形态菌落的稀释平板为“g”板。在此示例中，该点对应的粪便培养检测阈值为1.1 × 106 CFU/mL。

尽管持续的存活能力对培养的准确性至关重要，但在标本从患者送至诊所再转运至参考实验室的过程中，Campylobacter spp. 的存活能力保持仍存在困难。通常的储存方法是将标本置于普通带盖试管中冷藏，并暴露于空气中，且无特殊气氛环境。使用转运培养基（也称为保存样本）的标本被认为具有更好的存活率，但目前提供定量数据的报道较少18。

上述分析样本与人工制备样本方法的结合再次被用于获得存活率及生存时间的估计值 C. jejuni 在运输培养基中。使用细菌储备液在粪便基质中制备10个重复的2倍至1024倍系列稀释样本。通过分析计数确定初始培养液的浓度为4.8 × 107 CFU/mL。在第0天制备的平板上， C. jejuni 在进行32倍稀释的划线平板上（两天后）检测到菌落，相当于1.5 × 106 CFU/mL。然而，在将 Cary Blair 粪便样本冷藏 24 小时后制备的平板上，仅 2 倍稀释（相当于 2.4 × 107 CFU/mL）长出可见菌落。在研究进行至96小时终止时，未观察到进一步的活力下降。这种活力下降相当于在不到24小时内可培养微生物数量减少了16倍（即94%），表明即使经过冷藏，当 Cary Blair 保存液中的粪便样本菌量低于107 CFU/mL C. jejuni 可能被培养法遗漏.

与培养结果相比，EIA 在初始时间点及整个 4 天测试期间均检测到 C. jejuni 在 256 倍稀释度下的存在。该 EIA 使用加标粪便样本检测 C. jejuni 的检出阈值为 8.4 × 104 CFU/mL。此阈值低于粪便培养法，可实现对 C. jejuni 更高灵敏度和更稳定的检测。

为了评估培养法在实际临床环境中检测Campylobacter spp.的能力，采用6种方法对1,552份临床粪便标本进行了表征：粪便培养、一种新的Campylobacter spp.免疫测定法，以及4种分子检测方法。所有样本均前瞻性收集，并最初由美国3个实验室通过常规培养法进行分类，随后通过酶免疫测定法（EIA）进行交叉验证。所有培养阳性或EIA/培养结果不一致的标本进一步接受分子方法筛查12。根据5种非培养方法的结果，确定标本的真实阳性或真实阴性状态。这5种非培养方法在全部48份阳性及结果不一致的标本中完全一致，而培养法错误鉴定出14份（28%）。培养法错误鉴定的标本包括13份假阴性和1份假阳性样本。

细菌培养稀释过程示意图；在平板上评估72小时内细菌生长情况。
图1：分析用与加标粪便样本同步制备示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

培养皿中的细菌菌落生长；革兰氏染色显微镜图像；实验实验室结果。
图 2：从纯培养物和粪便培养物中鉴定 C. jejuni 菌落。（A）纯细菌培养物经 72 小时培养后 C. jejuni 菌落的照片。（B）纯细菌培养物中 C. jejuni 的革兰氏染色，油镜 400 倍放大。（C）接种了 C. jejuni 的粪便培养物经 48 小时培养后的照片。（D）（C）中框选区域的放大图，10 倍放大。白色箭头指示针尖大小的革兰氏阴性 C. jejuni 菌落。黑色箭头指示一个稍大、革兰氏阳性且非 C. jejuni 的菌落。请点击此处查看该图的放大版本。

培养物OD600 @ T0OD600 @ T 最终1最终 CFU/mL
C. jejuni0.1460.3211.28 x 107
C. coli0.2450.5084.50 x 108

表1：C. jejuni 和 C. coli 菌种的典型生长情况及CFU/mL。1 C. jejuni 培养在培养48小时后终止。C. coli 培养在培养54小时后终止。

加标粪便样本的稀释管Campylobacter样菌落数量革兰氏阴性菌落数量1培养阳性？加标样本的计算CFU/mL
C. jejuni (1.28 x 108 CFU/mL 原液)(2倍稀释) a密集nd2是6.40 x 107
(4倍稀释) b20+nd是3.20 x 107
(8倍稀释) c4-10nd是1.60 x 107
(16倍稀释) dnd是8.00 x 106
(32倍稀释) end是4.00 x 106
(64倍稀释) f1-32个中有1个是2.00 x 106
(128倍稀释) g3个中有2个是1.00 x 106
3(256倍稀释) h2个中有1个是5.00 x 105
(512倍稀释) i1个中无否2.50 x 105
(1024倍稀释) j0nd否NFP
C. coli (4.50 x 108 CFU/mL 原液)(2倍稀释) a密集nd是2.25 x 108
(4倍稀释) bnd是1.13 x 108
(8倍稀释) c50+nd是5.63 x 107
(16倍稀释) d30+nd是2.81 x 107
(32倍稀释) e10+nd是1.41 x 107
(64倍稀释) f3-8nd是7.03 x 106
(128倍稀释) gnd是3.52 x 106
3(256倍稀释) h1-33个中有1个是1.76 x 106
(512倍稀释) i1个中无否8.79 x 105
(1024倍稀释) j0nd否NFP

表2：加标粪便样本平板上典型的菌落数量。1 在类似Campylobacter的菌落中为革兰氏阴性菌落，2nd = 未测定，3加粗数据表示最后的阳性稀释度。

物种基因靶点
C. jejunihipO
C. colicadF
C. upsaliensiscpn60
C. laricpn60
C. helveticuscpn60
C. fetuscpn60
C. hyointestinaliscpn60
C. concisuscpn60

表3：用于检测单个弯曲杆菌（Campylobacter）物种的qPCR相关基因。

讨论

本文所述的培养方法基于简单且广泛使用的技术和材料，这些材料在大多数实验室中均可获得10。正是分析样本与人为设计样本的结合，提供了关于粪便培养临床相关检出阈值的新信息。此外，通过5种独立检测方法对培养结果进行判定，进一步支持了以下结论：Campylobacter粪便培养会错误鉴定相当一部分患者样本。酶免疫分析（EIA）和分子检测方法可作为有效的对照，因为它们各自基于不同的原理（抗原-抗体相互作用 vs. DNA扩增），并且重要的是，这两种方法均不依赖于细菌的存活状态。需注意的是，本研究中所用的EIA检测方法已得到充分验证，并已被证明与4种分子检测方法完全一致12。

Campylobacter spp. 的培养尤为困难，据报道其敏感性范围为 60−76%19,20，且从本研究中其约 30% 的真实阳性样本未能检出的情况即可明显看出。当培养结果为阴性时，实验人员应预期对照 EIA 和分子检测结果经常仍为阳性。

该实验方案中最关键的步骤是在竞争性粪便菌群中识别出针尖大小的菌落。当稀释度接近检测阈值时，菌落计数结果在零与非零之间交替出现（例如，2、0、1、0、0）是常见现象。需要明确的是，培养检测的阈值应为一个浓度范围，而非特定的CFU/mL数值。尽管如此，将约1 × 106 CFU/mL粪便作为培养检测下限的估计值，与已有文献报道的感染个体每克粪便可排出106至109个Campylobacter的结果相符较好21。抗生素种类或琼脂平板的改变，以及不同个体粪便样本之间不可避免的差异，无疑会影响检测阈值。本方案应有助于优化培养基的改进。

这一关于培养检测限的首次信息，有助于设定具有临床意义的诊断试验阈值，并为研究无症状携带等尚未深入探讨的微生物学问题奠定了必要的微生物学基础22,23 由 弯曲杆菌，或细菌载量是否与症状或严重后遗症相关。

披露

作者是 TECHLAB 公司的员工，该公司生产本文中用作对照的 QUIK CHEK™ 试剂盒。

致谢

这些研究由 TECHLAB, Inc. 资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
厌氧3.5L培养罐Thermo FisherHP0031A
AnaeroGRO空肠弯曲菌选择性琼脂Hardy DiagnosticsAG701
Bacto脑心浸出液蛋白胨BD Biosciences237500
Bacto蛋白酶蛋白胨Life Technologies Corp211684
碱性品红Fisher ScientificB12544
BBL胰蛋白胨Life Technologies Corp211921
C. coli标准菌株ATCC33559
C. jejuni标准菌株ATCC33560
CampyGen气体发生系统小袋Thermo FisherCN0025A
Campylobacter快速检测试剂盒TechLab, Inc.T5047 / T31025
Cary-Blair运送培养基Fisher Scientific23-005-47
Coli Roller无菌涂布珠Millipore Sigma71013
稀释缓冲液Anaerobe SystemsAS-908
胎牛血清Equitech-Bio, IncSFBM30
亚硫酸氢钠Sigma-Aldrich243973
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256
分光光度计比色皿USA Scientific9090-0460

参考文献

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