方法文章

结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）

14.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60460

⸱

2020年4月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Infection and Global Health, School of Medicine, University of St Andrews, 2National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, 3Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, 4Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow

本文内容

摘要

我们介绍一种在痰液经加热灭活后进行的结核病分子细菌载量检测方法。加热灭活可使痰液样本失去传染性，从而无需在生物安全三级实验室中进行结核病分子检测。

摘要

结核分枝杆菌（Mtb）是引起结核病的病原体，被联合国（UN）归类为危险的B类生物物质。为保障工作人员安全，所有疑似含有Mtb的样本操作必须在三级防护（CL 3）实验室中进行。结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）是一种逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测，利用针对16S rRNA的引物和双标记探针来定量Mtb的杆菌负荷。本文描述了通过热灭活处理使结核病样本失去感染性，同时保留RNA以用于TB-MBLA检测的方法。取1 mL痰液样本置于密闭的15 mL离心管中，分别在80 °C、85 °C或95 °C下煮沸20分钟，以灭活Mtb杆菌。将热灭活样本与对照（活菌）样本培养42天，证实结核杆菌已被杀死。随后向灭活样本中加入100 µL提取对照物，并按照标准RNA提取流程进行RNA提取。经热处理的样本在培养中未观察到任何生长。所提取的RNA进行实时RT-qPCR检测，扩增Mtb 16S rRNA基因中的特异性靶序列，结果以定量循环数（Cq）形式输出。通过标准曲线将Cq值转换为细菌负荷，即每毫升估计菌落形成单位（eCFU/mL）。Cq值与样本的细菌负荷呈反比关系。该方法的局限性在于热灭活会导致部分细胞裂解，使RNA暴露于RNase酶中，造成小于<1 log10eCFU/mL（即<10 CFU/mL）的损失。后续研究将确定因热灭活导致极低负荷患者出现假阴性结果的比例。

引言

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，全球每年报告的新发病例超过 7 × 106 例，其中每年死亡人数超过 1 × 106 例1,2。为扭转这一趋势，世界卫生组织（WHO）提出了包含开发有效诊断和治疗工具在内的三支柱策略3。根据联合国分类，Mtb 属于危险生物物质 B 类，处理疑似 Mtb 阳性的样本需在生物安全三级（CL3）实验室中进行。CL3 实验室的建设和维护成本高昂，因此大多数国家将结核病培养服务集中在区域或国家级机构。这意味着在基层医疗卫生机构中，涂片显微镜检查是最可及的诊断工具。

世界卫生组织（WHO）已批准在第4级医疗卫生机构（主要位于区级）实施Xpert MTB/RIF等快速分子检测技术4,5。一些区级区域面积较大，部分人群难以到达。尽管Xpert MTB/RIF具有优势，但其原理是检测结核分枝杆菌（Mtb）的DNA。DNA是一种稳定的分子，可在细胞死亡后长期存留，因此不适合作为衡量活菌数量以监测治疗反应的可靠标准5,6。基于RNA的检测方法为活菌的准确测定提供了替代方案7,8,9,10,11,12,13。RNA存在多种稳定性不同的类型，包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）。信使RNA与基因表达相关，因此与细胞活性和存活状态关系最为密切14。需要指出的是，基因表达缺失并不等同于细胞死亡，因为像结核分枝杆菌（Mtb）这样的病原体已知可处于无活性（休眠）但仍有活力的状态15,16。因此，rRNA等稳定的RNA分子是活细胞（包括活跃和非活跃状态）更理想的标志物。

Sheridan 利用 Escherichia coli 证明，16S rRNA 的含量随着通过菌落形成单位（CFU）计数测定的细菌生长呈比例增加17。当 E. coli 细菌暴露于抗生素时，CFU 计数和 16S rRNA 含量同时下降。细胞死亡后 rRNA 的减少表明其可作为细胞活力的标志物13,17。基于这一原理，开发了结核病分子细菌载量检测法（TB-MBLA），通过靶向 M. tuberculosis 的 16S rRNA 来测量存活结核杆菌的载量，作为接受抗结核治疗患者治疗反应的指标11,18,19。我们进一步开发并优化了 TB-MBLA，加入了细胞提取对照，以反映 M. tuberculosis 杆菌的裂解情况，并确保该方法在不同环境条件下均具有稳健性20。TB-MBLA 检测的第一步需要从结核分枝杆菌（Mtb）中分离 RNA，此过程必须在三级生物安全实验室（CL3 实验室）中进行，直至 Mtb 细胞完全裂解，以确保操作人员的安全。此外，该方法还包括样本保存步骤，以便后续批量分析，样本需在硫氰酸胍（一种四级毒性物质）中于 -80 °C 保存。为此，我们采用加热法灭活 Mtb，使样本在涂片显微镜检查级别实验室中即可安全地进行 TB-MBLA 检测。

在实验室和临床应用中使用热处理已有数百年历史21,22。然而，某些微生物（如结核分枝杆菌 Mtb）难以杀灭，短时间的热处理不足以杀死所有细胞23,24。一项研究表明，在 80 °C 下加热结核菌培养物 20 分钟可完全杀灭所有 Mtb 杆菌，同时不破坏用于 PCR 扩增所需的 DNA25。此后，目前已有多种实验室 DNA 提取技术采用 95 °C 的加热步骤。我们应用相同原理证明，将结核病样本在 80 °C、85 °C 或 95 °C 下煮沸，均可使 Mtb 失活，同时保留足够的 RNA，以供进行 TB-MBLA 检测。失活后的培养物或痰标本可在密闭容器中于室温或冷藏条件下保存 7 天，而可定量的 rRNA 含量不会降低。

结核病多重液态生物标志物检测（TB-MBLA）目前作为仅用于研究（RUO）的检测方法，具有良好的适应性，已应用于痰液、肺组织和脑脊液等多种样本类型。该技术尚未应用于支气管肺泡灌洗液、血液及其他类型的样本。以痰液为样本时，非洲多中心评估研究的结果（未发表数据）以及既往发表的研究18,26表明，MBLA的敏感性与分枝杆菌生长指示管（MGIT）液体培养法相当。然而，TB-MBLA检测速度更快，可在数小时内获得结果，而培养法则需数天至数周；同时具有高度特异性，不受样本中非结核分枝杆菌微生物的干扰，并可提供疾病严重程度的定量评估。世界卫生组织（WHO）近期已认可TB-MBLA作为替代涂片显微镜检查和培养法用于结核病治疗监测的候选方法2。

本文详细描述了Sabiiti等人发表的热灭活和结核病多药联用生物发光法（TB-MBLA）方案27。该详细方案将为全球TB-MBLA使用者提供一站式的可视化资源。

方案

1. 样品制备

  1. 培养
    1. 在洁净台或1级生物安全柜中，将处于对数生长期的卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）培养物1 mL分装至15 mL塑料离心管中。盖紧管盖。
      注意：处理完整的5 mL样本需要五个15 mL离心管。
      注意：操作任何结核分枝杆菌培养物时，必须使用生物安全柜。
  2. 患者痰标本
    1. 在通风良好的环境中操作，并佩戴鼻罩，小心打开标本杯，用移液器将1 mL分装至15 mL塑料离心管中，并盖紧管盖。
      注意：建议使用宽口吸头吸取痰液。可用剪刀剪去1 mL吸头前端细部，以制成宽口吸头。

2. 热灭活

  1. 在样品制备前，将水浴锅预热至 95 °C。
    注意： 95 °C 的温度有助于降低 RNase 活性，从而为后续的 TB-MBLA 实验保留更多的 RNA。
  2. 将样品管转移至浸没于水浴中的试管架上，确保每个样品管的四分之三部分浸入水中。
  3. 在 95 °C 下加热 20 分钟，然后将试管转移至实验台，在室温下冷却 5 分钟，随后开始 RNA 提取。
    注意： 通过将加热灭活的样品与对照组在 37 °C 下培养 42 天以检测是否生长，验证了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）和卡介苗（BCG）的完全热灭活。在培养开始时及此后每周测量 600 nm 波长下的光密度值（OD600），持续 42 天。

3. RNA 提取

注意：此处描述的RNA提取过程适用于材料表中列出的RNA试剂盒。也可使用其他厂商的合适RNA提取试剂盒。

  1. 提取对照（EC）添加
    1. 将灭活后的样本各1 mL转移至1.5 mL离心管中。向每个样本中加入100 µL的EC，盖紧管盖，倒置混匀3次。
      注意：EC随TB-MBLA活性细菌检测试剂盒提供（材料表）。
  2. 细胞沉淀
    1. 使用台式微量离心机，在室温下以20,000 × g离心10分钟。用移液器吸除上清液，保留约50 µL沉淀物。
    2. 用移液器反复吹打，将沉淀重悬于950 µL裂解缓冲液中，并将全部悬液转移至RNA提取试剂盒提供的裂解基质管中（材料表）。确保管盖拧紧，并在管盖和管壁上做好标记。
  3. 进行细胞裂解时，将步骤3.2.2中的管子转移至均质器中。在6,000 rpm条件下均质40秒。
  4. 核酸纯化
    1. 将步骤3.3所得裂解液在室温下以12,000 × g离心5分钟。
    2. 准备新的1 mL离心管，每管加入300 µL氯仿。
    3. 使用1 mL吸头小心吸取上清液，避免接触裂解基质。
    4. 将上清液转移至含氯仿的离心管中，涡旋振荡5秒。静置5分钟或更长时间，直至出现清晰的三层（上层、中间层和底层）。
    5. 在室温下以12,000 × g离心5分钟。小心吸取上层液体，转移至新的1.5 mL离心管中。
    6. 向步骤3.4.5中的各管加入500 µL预冷的100%乙醇，盖紧管盖，轻柔倒置混匀3次。将管子在-80 °C孵育15分钟，或在-20 °C孵育30分钟，随后继续提取；也可在-20 °C过夜，次日完成提取。
    7. 将微量离心机预设为4 °C，并冷却至温度不高于12 °C后再开始离心。将管子放入离心机，在13,000 × g条件下离心20分钟。弃去上清液，加入70%预冷乙醇，再次在13,000 × g条件下离心10分钟。
      注意：70%乙醇应使用分子级无核酸酶水配制。
    8. 弃去步骤3.4.7中的全部上清液，将离心管转移至设定为50 °C的孵育器中。孵育20分钟以干燥RNA/DNA沉淀。保持管盖部分开启，以便乙醇完全蒸发。
    9. 向干燥的沉淀中加入100 µL无核酸酶水，在室温下孵育5分钟。涡旋振荡3秒以混匀内容物。
      注意：此时提取物可在冰箱中保存2–3天，或在-80 °C长期保存，直至进行第3.5节操作。
  5. DNA去除
    注意：    此步骤至关重要，因为提取物中残留的DNA会导致MBLA结果无效。本步骤基于DNA去除试剂盒（材料表）进行。
    1. 根据样本数量配制DNase I 10×缓冲液与DNase I酶的混合液（每样本10 µL缓冲液和1 µL DNase），额外增加10%以补偿移液损耗。涡旋混匀后，向每管RNA提取物中加入11 µL混合液。
    2. 涡旋振荡3秒混匀，短暂离心（13,000 × g，10秒）以去除管壁上的液滴。在金属浴或孵育器中37 °C孵育30分钟。向每管直接加入额外1 μL DNase I酶，充分涡旋混匀，继续在37 °C孵育30分钟。
    3. 在DNase孵育结束前10分钟取出DNase失活试剂，使其融化。涡旋20秒以确保形成均匀的乳白色悬液，然后向步骤3.5.2所得各RNA提取物中加入10 μL DNase失活试剂。
    4. 在室温下孵育5分钟。孵育期间涡旋混匀3次。
    5. 在13,000 × g条件下离心2分钟。小心将上清液转移至1.5 mL无RNase的离心管中，避免接触失活基质。
    6. 若当天进行RT-qPCR，可将RNA提取物短期存放于冰箱；若需长期保存，则置于-80 °C。

4. 逆转录 qPCR

  1. 对于未知样本，将所有待用的RNA提取物用无RNase水按1:10的比例稀释。涡旋振荡5秒以充分混匀，并短暂离心去除液滴或气泡。
  2. 对于标准曲线用的标准品，从-80 °C冰箱中取出结核分枝杆菌（Mtb）和提取对照（EC）RNA标准品，在室温下解冻。分别对Mtb和EC标准品进行七次和六次10倍梯度稀释。每次将混合液从一个管转移至另一个管前，均需更换移液枪头。
    注意： 标准品随TB-MBLA试剂盒提供。
  3. 预混液配制
    注意：     预混液（MM）是包含足够用于扩增所有样本、标准品以及无模板对照（NTC）的PCR试剂的混合溶液。NTC所用水应与提取过程及预混液配制中使用的水相同。确保每个标准品、每份RNA样本及其十倍稀释液均进行2次逆转录酶阳性（RT+）反应和1次逆转录酶阴性（RT-）反应。RT-反应用于评估DNA去除效率（表1）。
    1. 向每个PCR反应管中加入16 µL预混液。
    2. 向每个RT+和RT-反应管中加入4 µL RNA提取物，向NTC反应管中加入水。
    3. 将反应管放入实时PCR仪中，并设置PCR程序如下：50 °C反应30分钟，95 °C预变性15分钟，随后进行40个循环（94 °C变性45秒，60 °C退火延伸1分钟），并在绿色和黄色荧光通道进行信号采集。
      注意： 绿色通道为Mtb检测用荧光染料，黄色通道为提取对照检测用荧光染料。
  4. 结果解读
    注意：     同一样本的重复反应Cq值差异不应超过1个标准差。Mtb和EC的Cq值高于30时判为阴性。更多解读细节参见表2。
    1. 为评估治疗反应，利用标准曲线将Cq值转换为细菌载量（eCFU/mL）。根据治疗随访期间细菌载量的变化来判断治疗反应。
      注意： 治疗后细菌载量下降提示治疗反应良好（即抗结核药物正在杀灭结核杆菌）；若细菌载量无变化或升高，则提示治疗反应不佳，可能意味着结核杆菌对药物耐药或患者未依从治疗方案。TB-MBLA检测到的细菌载量下降与MGIT培养阳性时间（TTP）延长呈正相关。

5. 透射电子显微镜

  1. 将2 mL的热灭活培养物及对照样品分装至2 mL微量离心管中，在20,000 × g 条件下离心10分钟。
  2. 弃去上清液，将沉淀物重悬于700 µL细胞固定缓冲液中，室温孵育5分钟以固定细胞。
  3. 将悬液在16,000 × g 条件下离心30分钟，获得致密沉淀。弃去上清液，替换为含1%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS）。将沉淀物在4 °C的蔗糖溶液中保存，直至进行电镜切片。
  4. 切片与透射电子显微镜观察
    注意：     以下方案改编自Griffiths等人的研究28。
    1. 将细胞沉淀在含2.1 M蔗糖的PBS中4 °C过夜，进行低温保护处理。用冰预冷的水洗涤3次。
    2. 将经低温保护处理的细胞沉淀在液氮中冷却，并安装至低温切片机样品 stub 上。使用低温切片机切割90 nm的超薄切片。
    3. 使用钨丝环，以PBS中含2%甲基纤维素与2.1 M蔗糖的1:1混合液捞取切下的切片。
    4. 将切片转移至表面涂有Pioloform的150目六边形铜网（TEM载网）上，可在4 °C保存，或直接进行步骤5.4.5。
    5. 将载网在醋酸铀中染色，并在甲酸甲酯液膜中空气干燥。用冰预冷的水清洗载网，随后在5分钟内用两滴PBS洗涤，干燥15−30分钟。按照仪器制造商的说明，在透射电子显微镜下观察切片。
      注意： 除洗涤步骤在室温下进行外，所有标记步骤均在冰温（液体温度）下进行。

结果

加热可灭活所有结核分枝杆菌（M. tuberculosis）杆菌
对照组（活菌）的光密度（OD）随时间逐渐升高（0.04OD–0.85OD），而加热灭活样本的OD值未发生变化，分别表明有生长和无生长（图1）27。类似地，临床痰标本对照组在MGIT培养中第3天即呈阳性报警，而加热灭活的临床样本在整个培养期间均未出现阳性报警。Mtb在MGIT中的生长通过齐-尼染色涂片显微镜检查及MPT64抗原检测得以确认29。

灭活样品中的 RNA 在 37 °C 下可稳定保存 4 天
将热灭活样品在 37 °C 下孵育，以确定细胞热灭活后 RNA 是否发生降解。在 BCG 培养物（图 2A-C）和结核病阳性痰液（图 2D）中，热灭活后第 0 天（D0）立即提取的 RNA 与第 1、2、3 和 4 天提取的 RNA 之间未发现差异。

外源性RNase可提高热灭活组分中RNA的降解速率
为了确定RNA未发生降解的原因，在热灭活前和/或热灭活后外源性添加RNase A酶（1,000 U/mL）。结果导致在80 °C、85 °C和95 °C条件下孵育4天后，RNA的减少量分别相当于细菌载量下降1.5 ± 0.3、1.8 ± 0.2和1.3 ± 0.1 – log10 eCFU/mL。在热灭活前后添加RNase的样本中，RNA的降解程度存在差异（图3A-C）。

使用16S rRNA作为参考标记物，可保留足够的RNA用于TB-MBLA
热灭活对结核分枝杆菌（BCG）培养物及结核病阳性患者痰液中rRNA的影响进行了测定。对照组BCG培养物的测定细菌载量为5.3 ± 0.2 log10 eCFU/mL 为 0.2 ± 0.1 log10 高于联合值 5.1 eCFU/mL ± 0.3 log10 热灭活培养物的eCFU/mL（ANOVA p < 0.0001）在 80 °C, 85 °C，以及 95 °C (图 4A)27同样，对照患者痰液中的细菌载量为 7.1 log10 eCFU/mL，为0.8 ± 0.1 log10 eCFU/mL，高于联合值 6.3 ± 0.41 log10eCFU/mL 80 °C, 85 °C，以及 95 °C (图4B)27细菌负荷的减少 <两种被测样本中均记录到1个对数值。

Sidak 多重比较检验显示，95 °C 时的细菌载量与 80 °C 和 85 °C 时相比存在显著差异（p = 0.001）。在所有温度下，结核病样本之间未发现差异，p = 0.8。

大多数结核分枝杆菌细胞的细胞壁完整性在加热过程中未被破坏
通过透射电子显微镜（TEM）我们检测了细胞是否因热灭活而发生裂解。将经多聚甲醛固定的细胞沉淀制成超薄切片，并嵌入富含电子的介质中，随后进行TEM观察。在低倍和高倍镜下观察细胞，均显示细胞壁完整，并可见细胞内脂质体。细胞在形态上呈拉长状，但并未发生裂解。图5展示了分枝杆菌细胞在不同放大倍数下的形态。上方两幅图显示了细胞内脂质体以及未受干扰的绳索样菌索结构，这是分枝杆菌属典型的形态学特征。下方两幅图为更高倍数的放大图像，进一步展示了脂质体的细节，并揭示了一些微细的细胞内结构。

通过 TB-MBLA 测定的细菌载量与 MGIT 培养阳性时间呈负相关
对于治疗有反应的患者，在整个治疗过程中，细菌载量平均每周下降 1 log10 eCFU/mL。快速应答者清除速度更快，通常在治疗 2 周内转为阴性（细菌载量为零）。TB-MBLA 测定的细菌载量下降与 MGIT 培养阳性时间（TTP）的延长相对应。图 6 展示了细菌载量与 MGIT TTP 之间的负相关关系。然而，两者的区别在于，TB-MBLA 结果可在 4 小时内获得，且检测时间与细菌载量水平无关，而 MGIT 培养检测则需要 5–25 天。此外，非结核分枝杆菌的污染会进一步影响培养检测结果的可靠性。

figure-results-1
图1：在80 °C（点状曲线）、85 °C（点划线曲线）和95 °C（虚线曲线）条件下验证BCG的灭活效果。对照组（黑色曲线）为活菌（未经加热）BCG培养物，接种于相同的培养基中。通过培养期间培养物OD值的增加确认其生长情况。该图改编自Sabiiti等27。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2：经80 °C、85 °C和95 °C加热灭活后，在37 °C孵育4天（D0–D4）的样本中可定量RNA的稳定性。（A）、（B）和（C）分别为在80 °C、85 °C和95 °C下灭活的BCG培养物；（D）为在80 °C下灭活的结核病痰液样本。对照组为未经处理（活菌）的同一样本组分。误差线表示标准差。实验重复三次，每次设三个复孔，共九个技术重复。请点击此处查看该图的高清版本。

figure-results-3
图3：外源添加RNase A酶后RNA降解程度更高。（A）80 °C热失活，（B）85 °C热失活，以及（C）95 °C热失活。误差条 = 均值标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：使用16S rRNA作为标记物，通过TB-MBLA测定细菌负荷时RNA的充分保存。（A）由体外BCG培养物估算的细菌负荷。（B）由结核病阳性痰液样本估算的细菌负荷。误差条表示均值的标准误（A和B分别为n = 18和20个重复）。该图改编自Sabiiti等人的研究27。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-5
图5：结核分枝杆菌在95 °C下灭活20分钟后完整菌体的透射电子显微镜图像。 透射电子显微镜（TEM）观察显示清晰完整的细胞壁以及大量脂质体。上方：低倍镜图像，显示成团细胞保持典型的分枝杆菌绳索样索状形态及胞内脂质体。下方：对上图区域的高倍镜放大图像，进一步展示脂质体的细节，并揭示部分胞内微细结构。请点击此处查看该图的高清版本。

figure-results-6
图6：接受抗结核治疗的患者在12周内的治疗反应曲线，显示TB-MBLA检测的细菌负荷量与MGIT TTP呈负相关。随着患者对治疗产生反应，细菌负荷量（蓝色曲线）下降，而TTP（红色曲线）上升。请点击此处查看该图的放大版本。

主混合液反转录阳性反应反转录阴性反应
每反应体积 × 反应数 + 5每反应体积 × 反应数 + 5
Quantitect 混合液10.0 μL10.0 μL
Mtb16S 引物混合液（F + R）0.4 μL0.4 μL
Mtb16S 探针0.2 μL0.2 μL
EC 引物混合液（F + R）0.4 μL0.4 μL
EC 探针0.2 μL0.2 μL
RT 酶0.2 μL-------
无 RNase 水4.6 μL4.8 μL
总体积16 µL16 μL

表1：结核病MBLA qPCR的主混合液制备指南。

类型MTB 通道EC 通道解释
样本阳性阳性有效
样本阳性阴性不确定
样本阴性阳性有效
样本阴性阴性无效
MTB + 对照阳性阴性有效
提取对照 (EC)阴性阳性有效
DNA 对照阴性阴性有效
阴性对照 (NTC)阴性阴性有效

表2：结核病-巨噬细胞生物发光分析结果解读指南。

讨论

本文表明，在80 °C、85 °C和95 °C条件下加热处理20分钟可有效灭活结核病样本，从而使结核分枝杆菌最低抑菌浓度测定（TB-MBLA）能够在非生物安全三级（CL3）实验室中安全开展，避免对实验室工作人员造成感染风险。研究结果与以往部分研究的观察一致，但与另一些关于热灭活结核分枝杆菌（Mtb）有效性的研究存在差异25,30。例如，有报告指出，在菌量较高的样本中，80 °C加热处理效果不佳25,31,32,33。本研究通过确保所有痰液样本和纯培养物均以每15 mL离心管1 mL的体积进行加热，提供了足够的空间使样本各部分充分接触沸热环境，从而避免了高密度接种物效应27。

热灭活后RNA的保存使得TB-MBLA检测成为可能。该发现与两项已证明热灭活后RNA仍可保存的研究结果一致12,34。我们证实，热灭活样本中的RNA在37 °C下可稳定保存4天，这意味着实验室可通过将灭活样本在室温下保存一周来集中进行批次检测。使用需要冷藏或冷冻的RNA提取试剂盒时，在室温下保存热灭活样本的能力消除了在资源有限环境中开展TB-MBLA检测对冷链运输和生物安全三级实验室的需求。

使用16S rRNA作为标记时，细菌载量的损失不到1个对数级。尽管活菌样本与热灭活样本之间存在差异，但热灭活造成的损失极小，不足以影响下游实验结果。升高温度并未增加RNA的损失量，表明观察到的损失与热处理无关。高温热处理很可能导致细胞裂解，使RNA暴露于RNase而发生降解。事实上，在热灭活组分中外源添加RNase A会加快RNA降解速率。煮沸不能降低RNase的活性，说明该蛋白具有极强的稳定性。

需要注意的是，平均1.5 log10 eCFU/mL 的RNA降解量并不算显著损失。基于此，我们推测加热仅裂解了少量结核分枝杆菌（Mtb）杆菌，从而仅暴露了少量RNA至RNase。通过透射电子显微镜（TEM）我们证实，95 °C加热对Mtb的细胞形态及细胞壁完整性几乎无影响。这意味着，要显著降解RNA，可能需要多种生理因素以及充足的RNase供应，例如在宿主环境中才具备这些条件35,36。此外，由于16S rRNA是核糖体的结构组分，其对RNase的敏感性可能较低37,38。单个Mtb细胞含有约700个核糖体/0.1 mm3细胞质37，表明每个细胞中rRNA的含量较高。因此，少量RNase对其影响可能较小38。大量核糖体的存在使得TB-MBLA在检测灵敏度以及检出结核病低菌荷患者方面具有优势。

TB-MBLA测定的细菌载量与MGIT培养TTP之间存在强相关性。这在一定程度上证实了细菌载量是培养阳性结果的驱动因素。然而，TB-MBLA的优势在于其能够直接定量样本中存在的分枝杆菌载量，且在检测前无需结核分枝杆菌（Mtb）细胞增殖。相比之下，培养法的阳性时间取决于细菌载量水平以及Mtb细胞的增殖速率。未来的研究将在常规临床环境中评估TB-MBLA的工作流程，包括热灭活步骤。该研究还将探讨具有不同细菌载量的样本，以了解在热灭活后可能由阳性转为阴性（即细菌数量减少）的样本数量。

用于细菌载量分子定量的结核病-细菌载量测定（TB-MBLA）方案是细菌学领域的首个此类方法。该方法可直接从患者痰液中定量结核分枝杆菌（Mtb）的杆菌载量，且无需进行培养。这使其速度更快，并提高了在临床决策中评估患者病情进展的潜力。热灭活步骤降低了感染风险，使得TB-MBLA在不具备三级生物安全实验室条件的环境中也具有更高的适用性。在样本完成热灭活后，共有三个步骤可获得TB-MBLA结果：RNA提取、逆转录（RT）-qPCR，以及qPCR结果分析。

从患者样本中分离结核分枝杆菌（Mtb）RNA的效率越高，结果的质量就越高。需要注意的是，痰液样本的质量会影响所分离RNA的产量。例如，唾液性痰液被视为低质量样本，通常与较低的杆菌负荷量相关。这意味着对患者进行高质量痰液咳出的培训非常重要。为了评估提取过程的效率，需在RNA提取前向样本中加入提取对照（即已知数量的非Mtb细胞）。成功回收提取对照可证实RNA提取过程的有效性。除非成功回收提取对照，否则RNA分离过程不能视为有效。鉴于Mtb是一种具有较强抵抗力的生物体，机械裂解成为该过程中的关键步骤。在珠粒（即裂解基质）存在下以高速（600 rpm）均质化样本可有效裂解细胞。对裂解物进行纯化后得到含有RNA和DNA的提取物。去除DNA是RNA提取过程中至关重要的最后一步。结核病信使RNA检测法（TB-MBLA）旨在通过定量RNA来测量活菌数量。因此，若未能去除基因组DNA，则检测结果中将包含来自DNA的信号，而DNA并非细胞活力的良好指标6。

RT-qPCR 采用双重标记探针同时检测结核分枝杆菌（Mtb）和提取对照。该过程包括三个步骤：在 50 °C 下由逆转录酶进行 30 分钟逆转录，95 °C 下变性 15 分钟，以及在 94 °C 和 60 °C 下进行 40 个循环的扩增。荧光信号的采集发生在 60 °C（即片段延伸阶段）。需要注意的是，TB-MBLA 已针对特定的 qPCR 仪器进行了优化，因此使用其他 qPCR 平台的操作人员应根据自身设备优化反应条件。通过在无逆转录酶（RT）的情况下对每个样本运行单次反应，以控制 DNA 去除的效率。该反应若出现阳性结果，则表明 DNA 未完全去除。对于 DNA 含量较高的高载量样本，可能需要加倍使用 DNase 酶以彻底去除 DNA。幸运的是，在细菌载量较高的样本中，少量 DNA 的存在对 RNA 检测结果的影响较小。核糖体 RNA（rRNA）是 TB-MBLA 的检测靶标，其天然含量约为 DNA 的两倍37。在 PCR 中，以溶解 PCR 试剂所用水作为无模板对照（NTC），用于监控是否存在外源性 DNA 或 RNA 的交叉污染。若 NTC 出现阳性信号，则提示存在交叉污染，该结果视为无效。这意味着所有使用该批水配制的溶液均需丢弃，并使用新开封的水重新配制。建议将 PCR 用水分装保存，以避免整批水被污染。阳性对照（Mtb RNA）用于监控 PCR 整体扩增效率。

结果分析需利用标准曲线将PCR的Cq值转换为细菌载量（即每毫升的估计菌落形成单位）。建立并优化标准曲线是此步骤的关键。推荐标准曲线的扩增效率为0.95–1。在对患者或其他检测样本进行仪器检测之前，应先建立并优化结核分枝杆菌（MTb）和提取对照的标准曲线。TB-MBLA试剂盒中已提供标准品。建议将RNA提取物进行10倍稀释后用于PCR检测。这意味着最终每毫升的细菌载量结果需将检测结果乘以10。需要注意的是，TB-MBLA检测中Cq值高于30被视为阴性。为评估治疗反应，至少需要两个不同时间点测得的前瞻性细菌载量结果。强烈建议其中至少一个结果为治疗前的基线值。然而，若患者的首次细菌载量评估是在治疗过程中进行的，则必须再获取一个时间点的细菌载量测量值，以评估治疗反应。TB-MBLA可在治疗期间相隔3天的时间内区分细菌载量变化，但理想情况下应间隔7天进行两次细菌载量测量。

尽管该方案能够产生有关治疗反应的 informative 定量结果，但其过程仍主要依赖人工操作，需要大量时间进行 RNA 提取。繁忙实验室的技术人员可能无法投入如此多的时间。目前正在进行相关安排，以实现 RNA 提取和 PCR 过程的自动化。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得益于欧洲及发展中国家临床试验伙伴关系（EDCTP）——泛非生物标志物扩展计划（PanBIOME）项目资助（项目编号 SP.2011.41304.008），以及圣安德鲁斯大学医学院研究基金的支持。本论文及结核病磁珠发光检测（TB-MBLA）方案作为可视化资源的发表，得到了苏格兰资助委员会和全球挑战研究基金对圣安德鲁斯大学的资助支持。感谢马普托妇产医院和马瓦拉内卫生中心提供临床痰标本，以及马普托结核病治疗单位团队在临床痰标本热灭活实验中提供的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
热灭活：
15 mL 离心管Fisher-Scientific10136120若样品体积较大，可使用 50 mL 管
15 mL 金属丝试管架Fisher-Scientific11749128可使用其他具有相似结构的品牌
水浴锅Fisher-Scientific15700619可使用其他具有相似结构的品牌
RNA 提取：
氯仿Sigma372978-1L其他 RNA 提取试剂盒品牌中非必需
无水乙醇（99–100%）Sigma51976-500ML-F有更大包装可选
提取对照SOI group St AndrewsVitalbacteriaEC随 TB-MBLA Vitalbacteria 试剂盒提供
FASTRNA Pro blue 试剂盒MP Biomedicals116025050配套提供裂解基质管
分子级水（无 RNase）SigmaW4502-1LQiagen、Fisher-Scientific 也可提供相同产品
Precellys 24 匀浆仪VWR432-3750也可使用 FastPrep（MP Biomedicals）
冷冻微量离心机，Fresco 21，HeraeusFisher-Scientific15352117可使用具有相似容量的其他品牌
恒温混匀仪EppendorfBLD-455-010C适用于 1–2 mL 管
TURBO DNA-freeFisher-ScientificAM1907M耗时较长，但比短时去 DNA 方法更有效
RT-qPCR：
引物和 TaqMan 探针SOI group St AndrewsVitalbacteriaPP随 TB-MBLA Vitalbacteria 试剂盒提供。探针荧光基团为 Mtb 使用 FAM（绿色），提取对照（EC）使用 HEX（黄色）。Applied Biosystems qPCR 平台使用 VIC 代替 HEX。
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR 试剂盒Qiagen204845包含 PCR 混合液及逆转录酶
RotorGene Q 5plex 仪器Qiagen9001580其他 qPCR 仪器如 Vii7、QuantStudio、StepOnePlus 等也可使用
0.1 mL 联排管及管盖Qiagen981103根据转子尺寸可选用其他规格管。其他 PCR 平台需使用 96 孔 PCR 板。
非热灭活样本保存材料
1 M Tris-HCl（pH 7.5）Sigma93313即用型
2-巯基乙醇Sigma63689多家合格供应商可提供
硫氰酸胍（GTC）PromegaV2791推荐使用 Promega 品牌以保证质量
分子级水（无 RNase）SigmaW4502-1L确保 GTC 溶液无核酸酶污染
通用材料（使用但非 TB-MBLA 特有）
500 mL 塑料容器734-5087推荐使用 Nalgene 品牌
生物废弃物收集罐多家合格供应商可提供
化学废弃物收集罐多家合格供应商可提供
一次性耐化学手套多家合格供应商可提供
冷冻柜（-20 °C）多家合格供应商可提供
超低温冰箱（-80 °C）多家合格供应商可提供
冰箱（0–8 °C）多家合格供应商可提供
通风橱用于安全操作有毒试剂
实验室天平用于试剂的精确称量
塑料量筒确保试剂的准确量取
PCR 反应管应与所用 PCR 仪器兼容
移液器及配套无菌滤芯吸头无 DNA 酶和 RNA 酶，推荐使用 P1000、P200、P10、P2 范围
Qiagility 加样板Qiagen5 孔预混液板、16 孔试剂板、32 孔样本板、72 孔和 96 孔反应板
QIAgility 移液机器人Qiagen对高通量移液至关重要
1.5 mL 和 2 mL 微量离心管架，以及 15 mL 和 50 mL Falcon 管架推荐耐化学腐蚀且可高压灭菌的类型
RNase Away（清除工作区域中的 RNase 酶）Fisher Scientific10666421确保台面和设备无 RNase 酶污染
耐化学护目镜Fisher Scientific也可从 Sigma 购得。用于保护眼睛免受有毒试剂伤害。
无菌巴斯德吸管（1.5–3 mL）多家合格供应商可提供
无菌无 RNase 微量离心管推荐使用适用于 -80 °C 冻存的 1.5 mL 管
结核病消毒剂，例如 Tristel Fuse确保新鲜配制或在一周内配制
涡旋振荡器推荐 Genie 2 品牌
透射电子显微镜
戊二醛（8%）SigmaG7526-10ML细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分
HEPES（pH 7.4，100 mM）SigmaH4034-25G细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分
Leica FCS 超低温切片机Leica用于组织切片的冷冻切片机
甲基纤维素Agar ScientificAGG6425低温包埋树脂
多聚甲醛（4% PBS 溶液）SigmaP6148-500G细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分
蔗糖Sigma84097-250G保存和封固介质
醋酸铀Agar ScientificAGR1260A通用电子显微镜染色剂

参考文献

  1. World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
  2. World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
  3. World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
  4. Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
  5. World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
  6. Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
  7. Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
  8. Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
  9. Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
  10. Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
  11. Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
  12. Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
  13. Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
  14. Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
  15. Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
  16. Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
  17. Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
  18. Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
  19. Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
  20. Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).
  21. Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).
  22. Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
  23. Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
  24. Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
  25. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
  26. Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
  27. Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
  28. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
  29. Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79(2011).
  30. Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
  31. Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
  32. Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
  33. Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
  34. McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
  35. Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
  36. O'Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
  37. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
  38. Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RT qPCR RNA Mycobacterium tuberculosis

相关文章