铜绿假单胞菌小菌落变体的培养及其藻酸盐的定量

摘要

本文介绍了一种用于培养铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）小菌落变异体的生长条件。同时，我们还描述了两种独立的方法，用于检测和定量铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）产生的胞外多糖——藻酸盐，这两种方法分别为传统的糖醛酸咔唑测定法和基于藻酸盐特异性单克隆抗体（mAb）的酶联免疫吸附测定（ELISA）。

摘要

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性革兰氏阴性细菌病原体，可过度产生一种胞外多糖——藻酸盐，从而导致一种称为黏液型的独特表型。藻酸盐与囊性纤维化（CF）患者中慢性肺部感染的发生相关，并导致预后不良。深入了解调控藻酸盐生成的信号通路，有助于开发靶向抑制藻酸盐合成的新型治疗策略。另一种与疾病相关的表型是小菌落变异株（SCV）。SCV 的特征是细菌生长缓慢，通常还伴有对抗微生物药物的耐药性增强。本文中，我们首先介绍一种因嘧啶生物合成基因突变而导致的 P. aeruginosa SCV 的遗传定义型培养方法。通过补充含氮碱基（如尿嘧啶或胞嘧啶），可恢复这些突变株的正常生长，表明该菌存在一种能够从环境中摄取游离碱基的补救代谢途径。接着，我们讨论两种测定细菌藻酸盐含量的方法。第一种方法基于将多糖水解为其单体——糖醛酸，随后使用生色试剂咔唑进行衍生化反应；第二种方法则采用基于商品化藻酸盐特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）。这两种方法均需使用标准曲线进行定量分析。我们还证明，免疫学方法对藻酸盐的定量具有特异性，可用于临床标本中藻酸盐含量的检测。

引言

慢性肺部感染 铜绿假单胞菌 是囊性纤维化（CF）患者发病和死亡的重要原因。在幼儿期，患者会定植多种细菌病原体，包括非黏液型分离株 P. aeruginosa^1,2小菌落变异型（SCV）分离株以及黏液样分离株的出现是慢性感染开始的标志。SCV分离株具有高度耐药性³ 由于其生长速率较慢⁴，这使得它们在治疗方案及其他慢性感染中成为严重的阻碍因素⁵ 由 P. aeruginosa. Al Ahmar 等人的工作⁶ 揭示了SCV与黏液型表型之间通过从头嘧啶生物合成途径的关联。由于嘧啶合成相关基因发生突变导致嘧啶饥饿，从而在非黏液型参考菌株PAO1及其黏液型衍生菌株PAO581（PAO1mucA25）中均出现了SCV表型。

尽管海藻酸盐的过量产生是囊性纤维化患者慢性肺部感染的重要疾病标志，但海藻酸盐的产量与肺部病理变化之间是否存在直接相关性尚不明确，目前也不清楚海藻酸盐是否可作为治疗预后的生物标志物⁷。海藻酸盐的产生主要由两个操纵子调控：调控型操纵子（algUmucABCD<....

方案

1. SCV 生长条件与补救途径的生理激活

1. SCV的检测
   1. 划线接种 P. aeruginosa 菌株 PAO1，PAO1ΔpyrD，PAO581，和 PAO581ΔpyrD 在预热的 假单胞菌 在PIA平板上分离培养，并于37 °C培养48小时。在生长平板上挑选单个呈现SCV表型的菌落（菌落大小为1−3 mm，而正常菌落大小为3−5 mm）。
   2. 重复步骤 1.1.1 以获得 SCV 的纯分离株。
      注意：由于 SCV 菌落生长缓慢，培养可能需要长达 72 小时。
2. 补救途径的生理激活
   1. 使用无菌接种环从PIA平板上挑取SCV菌落，并在预先温育的补充有0.1 mM尿嘧啶的PIA平板上划线。于37 °C培养24−48 h。
      注意：本方案中使用的所有PIA平板均在灭菌前向混合物中添加终浓度为20 mL/L的甘油。灭菌后，待培养基温度降至55 °C以下时，在倒平板前向液体培养基中加入终浓度为11.21 mg/L的尿嘧啶（0.1 mM）。该方法有助于鉴定导致微小菌落表型（SCV表型）的嘧啶代谢相关突变 P. aeruginosa如果SCV表型是由上述突变所致，则在添加尿嘧啶的PIA平板上将观察到正常的菌落生长和大小（3−5 mm）。若菌株具有产生藻酸盐的能力，则在补充尿嘧啶后，黏液型表型也....

结果

图1 显示PAO1和PAO581菌株在有或无框内缺失情况下的平板结果 pyrD pyr 基因（嘧啶生物合成途径中的一个基因），其突变可导致小型菌落变体（SCV）⁶PAO1 SCV突变株在尿嘧啶补充后恢复了正常生长图1A，B）。此外，PAO581ΔpyrDSCV突变体经相同的尿嘧啶处理后恢复了黏液表型，因为亲本菌株PAO581含有一个额外的 mucA25 突变图1C，D）。糖醛酸咔唑测定的结果如图所示 图2⁶数据代表了在PIA培养基及添加0.1 mM尿嘧啶的PIA培养基上培养的PAO581菌株及其嘧啶从头合成途径调控基因突变.......

讨论

SCV 和藻酸盐都是与多种慢性感染相关的重要的疾病标志物。因此，培养 SCV 以及研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）对藻酸盐的调控和生成能力，对于发现这些慢性疾病的新疗法至关重要。

由于与其它P. aeruginosa菌株相比生长速度缓慢⁴，SCV菌株的培养历来十分困难，而这一特性也有助于其产生抗菌药物耐药性³。我们的研究鉴定出一种特定类型的P. aeruginosa SCV，其成因是新生嘧啶生物合成途径中的基因突变。本文讨论了在培养基中添加核苷酸尿嘧啶后，此类SCV可恢复为正常生长表型的培养条件。然而，当在培养基中添加UMP/UTP时，其生长缺陷并未得到恢复（数据未显示）。介导这种选择性吸收的孔蛋白（porin）仍需进一步研究。在培养基中补充尿嘧啶有助于缓解由嘧啶饥饿所诱导的细胞应激（图1）。类似地，采用与添加尿嘧啶相同的方法向培养基中添加游离胞嘧啶，也可缓解嘧.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法超敏TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028	通过 Fisher Scientific 购买
绝对乙醇（200 证明）	Fisher Scientific	BP2818-4	分子生物学级
Accu Block 数字干浴器	Labnet	NC0205808	通过 Fisher Scientific 购买
96 孔检测板	CoStar	2021-12-20
台式涡旋混合器 Genie 2	Scientific Industries	G560
硼酸	Research Products International Corp.	10043-35-3
培养箱	VWR	1540
咔唑	Sigma	C-5132
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液	Sigma	C3041
离心管（50 mL）	Fisher Scientific	05-539-13	通过 Fisher Scientific 购买
培养试管	Fisher Scientific	14-956-6D	通过 Fisher Scientific 购买
聚苯乙烯比色皿（1.5 mL）	Fisher Scientific	14955127	通过 Fisher Scientific 购买
胞嘧啶	Acros Organics	71-30-7
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
D-甘露糖醛酸钠	Sigma Aldrich	SMB00280
FMC 藻酸盐	FMC	2133
甘油	Fisher Scientific	BP906-5	用于分子生物学
小鼠抗藻酸盐单克隆抗体	QED Biosciences	N/A	批号 # :15725/15726
磷酸盐缓冲液粉末（PBS）	Sigma	P3813
Pierce 山羊抗小鼠多聚 HRP 抗体	Thermo Scientific	32230	通过 Fisher Scientific 购买
氢氧化钾	Fisher Scientific	1310-58-3	通过 Fisher Scientific 购买
Prism 7	GraphPad
Pseudomonas 分离琼脂（PIA）	Difco	292710	通过 Fisher Scientific 购买
Pseudomonas 分离肉汤（PIB）	Alpha Biosciences	P16-115	通过 Fisher Scientific 购买
圆形牙签	Diamond		任意品牌
海藻藻酸盐（Protanal CR 8133）	FMC Corporation
脱脂奶粉	Difco	232100	通过 Fisher Scientific 购买
SmartSpec Plus 分光光度计	BioRad	170-2525	或首选供应商
氯化钠（NaCl）	Sigma	S-5886
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	i3x	或首选供应商
无菌培养皿 100 mm × 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	通过 Fisher Scientific 购买
硫酸	Fisher Scientific	A298-212	技术级
硫酸（2 N - 终止液）	R&D Systems	DY994
Tween 20	Sigma	P2287
尿嘧啶	Acros Organics	66-22-8