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方法文章

铜绿假单胞菌小菌落变体的培养及其藻酸盐的定量

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DOI：

10.3791/60466

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2020年2月22日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Progenesis Technologies LLC, Robert C. Byrd Biotechnology Science Center, 3Department of Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于培养铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）小菌落变异体的生长条件。同时，我们还描述了两种独立的方法，用于检测和定量铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）产生的胞外多糖——藻酸盐，这两种方法分别为传统的糖醛酸咔唑测定法和基于藻酸盐特异性单克隆抗体（mAb）的酶联免疫吸附测定（ELISA）。

摘要

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性革兰氏阴性细菌病原体，可过度产生一种胞外多糖——藻酸盐，从而导致一种称为黏液型的独特表型。藻酸盐与囊性纤维化（CF）患者中慢性肺部感染的发生相关，并导致预后不良。深入了解调控藻酸盐生成的信号通路，有助于开发靶向抑制藻酸盐合成的新型治疗策略。另一种与疾病相关的表型是小菌落变异株（SCV）。SCV 的特征是细菌生长缓慢，通常还伴有对抗微生物药物的耐药性增强。本文中，我们首先介绍一种因嘧啶生物合成基因突变而导致的 P. aeruginosa SCV 的遗传定义型培养方法。通过补充含氮碱基（如尿嘧啶或胞嘧啶），可恢复这些突变株的正常生长，表明该菌存在一种能够从环境中摄取游离碱基的补救代谢途径。接着，我们讨论两种测定细菌藻酸盐含量的方法。第一种方法基于将多糖水解为其单体——糖醛酸，随后使用生色试剂咔唑进行衍生化反应；第二种方法则采用基于商品化藻酸盐特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）。这两种方法均需使用标准曲线进行定量分析。我们还证明，免疫学方法对藻酸盐的定量具有特异性，可用于临床标本中藻酸盐含量的检测。

引言

慢性肺部感染 铜绿假单胞菌 是囊性纤维化（CF）患者发病和死亡的重要原因。在幼儿期，患者会定植多种细菌病原体，包括非黏液型分离株 P. aeruginosa1,2小菌落变异型（SCV）分离株以及黏液样分离株的出现是慢性感染开始的标志。SCV分离株具有高度耐药性3 由于其生长速率较慢4，这使得它们在治疗方案及其他慢性感染中成为严重的阻碍因素5 由 P. aeruginosa. Al Ahmar 等人的工作6 揭示了SCV与黏液型表型之间通过从头嘧啶生物合成途径的关联。由于嘧啶合成相关基因发生突变导致嘧啶饥饿，从而在非黏液型参考菌株PAO1及其黏液型衍生菌株PAO581（PAO1mucA25）中均出现了SCV表型。

尽管海藻酸盐的过量产生是囊性纤维化患者慢性肺部感染的重要疾病标志，但海藻酸盐的产量与肺部病理变化之间是否存在直接相关性尚不明确，目前也不清楚海藻酸盐是否可作为治疗预后的生物标志物7。海藻酸盐的产生主要由两个操纵子调控：调控型操纵子（algUmucABCD）8,9 和生物合成操纵子（algD 操纵子）10,11。海藻酸盐的生成受到σ因子AlgU9,12（也称为AlgT）的严格调控，并受抗σ因子MucA降解的调节13。若能实现对患者痰液样本中海藻酸盐原位产生的监测，将有助于开发新的治疗策略。

本文描述了一种可检测因无法从头合成嘧啶而导致的微小菌落变异体（SCV）的生长条件。在培养基中补充嘧啶核苷酸的含氮碱基——尿嘧啶和/或胞嘧啶，可激活补救合成途径，从而恢复突变株的正常生长。这种针对特定SCV突变体的生长方法可用于筛查患者样本中的嘧啶代谢相关突变。此外，我们讨论了两种检测和定量铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）产生并分泌的藻酸盐的方法。第一种是传统方法14,15,16，即使用高浓度酸降解多糖，然后加入比色指示剂以定量样品中的藻酸盐浓度。第二种方法由本实验室建立，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA），利用QED Biosciences公司开发的抗藻酸盐单克隆抗体（mAb）。ELISA方法比尿糖醛酸测定法更具特异性和灵敏度，并且由于避免了高浓度硫酸的使用，操作更安全。ELISA可直接用于患者痰液样本中藻酸盐的检测，因此有望开发为一种监测工具，用于追踪感染不同阶段肺部藻酸盐含量的变化。

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方案

1. SCV 生长条件与补救途径的生理激活

  1. SCV的检测
    1. 划线接种 P. aeruginosa 菌株 PAO1，PAO1ΔpyrD，PAO581，和 PAO581ΔpyrD 在预热的 假单胞菌 在PIA平板上分离培养，并于37 °C培养48小时。在生长平板上挑选单个呈现SCV表型的菌落（菌落大小为1−3 mm，而正常菌落大小为3−5 mm）。
    2. 重复步骤 1.1.1 以获得 SCV 的纯分离株。
      注意：由于 SCV 菌落生长缓慢，培养可能需要长达 72 小时。
  2. 补救途径的生理激活
    1. 使用无菌接种环从PIA平板上挑取SCV菌落，并在预先温育的补充有0.1 mM尿嘧啶的PIA平板上划线。于37 °C培养24−48 h。
      注意：本方案中使用的所有PIA平板均在灭菌前向混合物中添加终浓度为20 mL/L的甘油。灭菌后，待培养基温度降至55 °C以下时，在倒平板前向液体培养基中加入终浓度为11.21 mg/L的尿嘧啶（0.1 mM）。该方法有助于鉴定导致微小菌落表型（SCV表型）的嘧啶代谢相关突变 P. aeruginosa如果SCV表型是由上述突变所致，则在添加尿嘧啶的PIA平板上将观察到正常的菌落生长和大小（3−5 mm）。若菌株具有产生藻酸盐的能力，则在补充尿嘧啶后，黏液型表型也会恢复。

2. 糖醛酸咔唑测定法

  1. 从待测目标菌株的纯培养物中挑取单个菌落。使用无菌牙签挑取该菌落，并将牙签放入含有5 mL培养液的试管中 假单胞菌 增菌培养基（PIB）。在37 °C摇床培养箱中培养24 h。
    注意：以下菌株 PAO581 (PAO1mucA25），PAO581carA，PAO581carB，以及 PAO581pyrD 在PIA平板或添加0.1 mM尿嘧啶的PIA平板上培养以收获藻酸盐用于测定。
  2. 在预热的PIA平板上加入150 µL培养的PIB肉汤（适用于15 mm × 100 mm平板）或450 µL肉汤（适用于15 mm × 150 mm平板）。使用无菌涂布棒将肉汤均匀涂布于平板表面。在37 °C下培养24小时。
    注意：如有过多液体，可将培养板倾斜，用移液器吸去多余液体。本实验方案所用的PIB和PIA培养基均含有20 mL/L甘油，作为细胞的碳源以促进藻酸盐的生成。
  3. 使用移液控制器和无菌50 mL移液管，向菌苔中加入0.85% NaCl，用细胞涂布器刮取平板收集样品。用新的50 mL移液管将样品吸入50 mL收集管中。将样品在涡旋振荡器上高速振荡混匀，随后置于冰上。
    注意：加入的0.85% NaCl体积根据培养皿的大小而定。对于15 mm × 100 mm的培养皿，使用10−30 mL；对于15 mm × 150 mm的培养皿，使用20−50 mL。
  4. 在 600 nm 处测量光密度（OD）600通过将1 mL样品加入一次性比色皿中，并使用分光光度计读取OD值，测定样品的光密度。每个样品重复此步骤2次，以获得三份读数。
  5. 向培养管中加入 3 mL 硫酸/硼酸溶液，置于冰上静置。将收集的样品 350 µL 缓慢加入试管中的酸混合液中，低速涡旋短暂混匀。
    1. 通过将10.099 g氢氧化钾（KOH）粉末加入45 mL水中来配制硼酸盐储备液。加入24.74 g硼酸（H3BO3) 加入混合物中，并加水定容至 100 mL。
    2. 将1 L的瓶子置于装有冰的水槽中，加入500 mL浓硫酸。缓慢加入15 mL配制好的硼酸储备液。待瓶子冷却。
    3. 再加入10 mL硼酸盐储备液，总体积为25 mL。待瓶体冷却后，加水定容至1 L。
      警告：本方法涉及使用高浓度硫酸。应使用适当的个人防护装备以确保安全，并应遵循样品的正确处置规程。
      注意：对于阳性对照，使用已知浓度的 D-甘露糖醛酸和/或通过产藻酸盐细菌菌株收获并纯化的已知细菌藻酸盐样品 P. aeruginosa （例如：PAO581-PAO1）mucA25）。阴性对照使用0.85% NaCl溶液和/或PAO1ΔalgD （框内缺失） algD 一个使细菌完全无法产生藻酸盐的基因）。每个样本可制备多个试管，以增加技术重复次数，便于进行统计分析。每种样本准备3−5个试管。
  6. 向酸/样品混合物中加入100 µL 0.1%乙醇羧基苯并三唑溶液。盖紧管盖，在中等速度下涡旋振荡5秒。置于55 °C干浴中反应30分钟。
  7. 孵育后，取出试管，高速涡旋振荡片刻，室温静置冷却5分钟。
    注意：所呈现的颜色为紫色色调。该颜色在1−2小时内保持稳定，可用于测量。
  8. 读取 OD530 通过将1 mL混合液加入洁净的比色皿中，使用分光光度计在530 nm处测定各样品的OD值。以含0.85% NaCl的试管作为空白对照进行分光光度计调零。
  9. 通过测量OD值绘制标准曲线530 已知浓度的系列稀释液 D-甘露糖醛酸（1,024 µg/mL、512 µg/mL、256 µg/mL、128 µg/mL、64 µg/mL、32 µg/mL、16 µg/mL 和 8 µg/mL）。重复两次。根据这些读数拟合线性方程。
    注意：标准曲线只需进行一次，从中获得的线性方程可用于后续检测。
    1. 使用标准曲线计算每个样品中海藻酸盐的浓度，并将线性方程得到的海藻酸盐浓度除以OD值600 以获得每 OD 的海藻酸盐总量600.

3. 藻酸盐定量的ELISA

  1. 重复步骤 2.1−2.4 以获得用于藻酸盐测定的样品。
    注意：所用菌株为 PAO1、PAO1ΔalgD 和携带 pHERD20T-algU 的 PAO1。
  2. 使用微量移液器将 50 µL 收集的样品加入未经处理的 96 孔板中。向各孔中加入 50 µL 包被缓冲液（碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6）。将板在 37 °C 下孵育 2 小时。
    注意：阳性对照可使用已知浓度的 D-甘露糖醛酸和/或已知稳定产藻酸盐的菌株（例如：PAO581-PAO1mucA25）。阴性对照使用 0.85% NaCl 溶液和/或 PAO1ΔalgD（algD 基因的框内缺失使细菌完全无法产生任何藻酸盐）。每个样品可设置多个孔以增加技术重复次数，便于进行统计分析。每种样品准备 3−5 个孔。
  3. 使用洗瓶用含 0.05% Tween 20 的 1× 磷酸盐缓冲盐水（PBS-T）清洗板孔 2 次，方法为注满孔后将板翻转倒出液体。
  4. 使用微量移液器向各孔中加入 200 µL 封闭缓冲液（含 10% 脱脂奶粉的 PBS-T）。在 4 °C 下孵育过夜。
    注意：用保鲜膜或封口膜包裹板子，以防止冰箱中发生蒸发。
  5. 使用洗瓶用 PBS-T 清洗板孔 2 次，方法为注满孔后将板翻转倒出液体。
  6. 使用微量移液器向各孔中加入 100 µL 稀释的一抗（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体），在 37 °C 下孵育 1−2 小时。
    注意：一抗（小鼠抗藻酸盐单克隆抗体）在抗体稀释液（含 1% 脱脂奶粉的 1× PBS）中稀释至 0.5 µg/mL（将 1 mg/mL 原液按 1:2,000 比例稀释）。
  7. 使用洗瓶用 PBS-T 清洗板孔 3 次，方法为注满孔后将板翻转倒出液体。
  8. 使用微量移液器向各孔中加入 100 µL 稀释的二抗，并在 37 °C 下孵育 1−2 小时。
    注意：所用二抗为 Pierce 羊抗小鼠多聚 HRP 抗体，在抗体稀释液中稀释至 0.25 µg/mL（将 0.5 mg/mL 原液按 1:2,000 比例稀释）。
  9. 使用洗瓶用 PBS-T 清洗板孔 3 次，方法为注满孔后将板翻转倒出液体。
  10. 使用微量移液器加入 100 µL TMB-ELISA 溶液（材料表），在室温下避光孵育 30 分钟。
    注意：阳性反应的颜色为不同程度的蓝色。
  11. 使用微量移液器加入 100 µL 终止液（2 N 硫酸）。
    注意：加入终止液后颜色由蓝色变为黄色。反应终止后颜色在 30 分钟内保持稳定。
  12. 使用酶标仪在 450 nm 处读取吸光度（OD）。
  13. 通过测定已知浓度的 D-甘露糖醛酸系列稀释液（1,024 µg/mL、512 µg/mL、256 µg/mL、128 µg/mL、64 µg/mL、32 µg/mL、16 µg/mL 和 8 µg/mL）的 OD450 值绘制标准曲线。重复测定 2 次。根据这些读数拟合线性方程。
    注意：标准曲线只需制作一次，其获得的线性方程可用于后续检测。
    1. 利用标准曲线计算各样品中藻酸盐的浓度，并将线性方程得出的藻酸盐浓度除以 OD600，得到每单位 OD600 的总藻酸盐量。

4. 藻酸盐测量的统计分析

  1. 在图形化软件表格中，设置一列，输入由标准曲线推导出的线性方程。将 y 轴结果设为海藻酸浓度，x 轴结果设为尿糖酸测定的 OD530 和 ELISA 的 OD450，以获得各样本中的海藻酸浓度。
  2. 为将每个样本中的海藻酸含量标准化为每 5.5 × 108 CFU/mL（1 OD600）的含量，将上述获得的各样本浓度除以其对应的 OD600 值。若每个样本测定了多个 OD600 值，则除以平均 OD600 值。
  3. 使用首选的统计分析软件（例如 GraphPad Prism 7.02）进行统计分析。
  4. 打开软件，在新建表格与图表（New Table & Graph）下选择柱状图（Column），并选择单因素方差分析（one-way ANOVA）数据集。
  5. 用所测试的菌株名称命名每一列，并在下方输入相应的海藻酸浓度。
  6. 输入所有数据后，点击顶部菜单中的分析（Analyze）。这将打开分析设置窗口。选择适当的检验参数，并指明是否需要进行多重比较。
    注意：分析完成后，数据集将生成一个 p 值，用于判断数据的统计学显著性。若 p 值小于设定的 α 值（通常 α 值设定为 p < 0.01），则认为数据具有统计学显著性。
  7. 在图表选项卡下选择柱状图（Bar Graph）类型。系统将根据输入数据表中指定的标题自动绘制图表。如有需要，可通过在相关柱状图之间的连接线上方标注 * 符号来表示数据的统计学显著性。

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结果

图1 显示PAO1和PAO581菌株在有或无框内缺失情况下的平板结果 pyrD pyr 基因（嘧啶生物合成途径中的一个基因），其突变可导致小型菌落变体（SCV）6PAO1 SCV突变株在尿嘧啶补充后恢复了正常生长图1A，B）。此外，PAO581ΔpyrDSCV突变体经相同的尿嘧啶处理后恢复了黏液表型，因为亲本菌株PAO581含有一个额外的 mucA25 突变图1C，D）。糖醛酸咔唑测定的结果如图所示 图26数据代表了在PIA培养基及添加0.1 mM尿嘧啶的PIA培养基上培养的PAO581菌株及其嘧啶从头合成途径调控基因突变...

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讨论

SCV 和藻酸盐都是与多种慢性感染相关的重要的疾病标志物。因此，培养 SCV 以及研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）对藻酸盐的调控和生成能力，对于发现这些慢性疾病的新疗法至关重要。

由于与其它P. aeruginosa菌株相比生长速度缓慢4，SCV菌株的培养历来十分困难，而这一特性也有助于其产生抗菌药物耐药性3。我们的研究鉴定出一种特定类型的P. aeruginosa SCV，其成因是新生嘧啶生物合成途径中的基因突变。本文讨论了在培养基中添加核苷酸尿嘧啶后，此类SCV可恢复为正常生长表型的培养条件。然而，当在培养基中添加UMP/UTP时，其生长缺陷并未得到恢复（数据未显示）。介导这种选择性吸收的孔蛋白（porin）仍需进一步研究。在培养基中补充尿嘧啶有助于缓解由嘧啶饥饿所诱导的细胞应激（图1）。类似地，采用与添加尿嘧啶相同的方法向培养基中添加游离胞嘧啶，也可缓解嘧...

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披露

作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金R44GM113545和P20GM103434的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一步法超敏TMB-ELISAThermo Scientific34028通过 Fisher Scientific 购买
绝对乙醇（200 证明）Fisher ScientificBP2818-4分子生物学级
Accu Block 数字干浴器LabnetNC0205808通过 Fisher Scientific 购买
96 孔检测板CoStar2021-12-20
台式涡旋混合器 Genie 2Scientific IndustriesG560
硼酸Research Products International Corp.10043-35-3
培养箱VWR1540
咔唑SigmaC-5132
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液SigmaC3041
离心管（50 mL）Fisher Scientific05-539-13通过 Fisher Scientific 购买
培养试管Fisher Scientific14-956-6D通过 Fisher Scientific 购买
聚苯乙烯比色皿（1.5 mL）Fisher Scientific14955127通过 Fisher Scientific 购买
胞嘧啶Acros Organics71-30-7
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
D-甘露糖醛酸钠Sigma AldrichSMB00280
FMC 藻酸盐FMC2133
甘油Fisher ScientificBP906-5用于分子生物学
小鼠抗藻酸盐单克隆抗体QED BiosciencesN/A批号 # :15725/15726
磷酸盐缓冲液粉末（PBS）SigmaP3813
Pierce 山羊抗小鼠多聚 HRP 抗体Thermo Scientific32230通过 Fisher Scientific 购买
氢氧化钾Fisher Scientific1310-58-3通过 Fisher Scientific 购买
Prism 7GraphPad
Pseudomonas 分离琼脂（PIA）Difco292710通过 Fisher Scientific 购买
Pseudomonas 分离肉汤（PIB）Alpha BiosciencesP16-115通过 Fisher Scientific 购买
圆形牙签Diamond任意品牌
海藻藻酸盐（Protanal CR 8133）FMC Corporation
脱脂奶粉Difco232100通过 Fisher Scientific 购买
SmartSpec Plus 分光光度计BioRad170-2525或首选供应商
氯化钠（NaCl）SigmaS-5886
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪Molecular Devicesi3x或首选供应商
无菌培养皿 100 mm × 15 mmFisher ScientificFB0875713通过 Fisher Scientific 购买
硫酸Fisher ScientificA298-212技术级
硫酸（2 N - 终止液）R&D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
尿嘧啶Acros Organics66-22-8

参考文献

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