本方案提供了建立源自致癌物诱导的小鼠膀胱癌的膀胱肿瘤类器官的三维体外培养的详细实验步骤。文中描述了肿瘤类器官的传代、基因工程改造以及原位移植等培养方法。
本文内容
摘要
摘要
长期以来，人们一直鼓励开发先进的肿瘤模型，因为现有的癌症模型存在诸多局限性，例如缺乏三维（3D）肿瘤结构以及与人类癌症的相关性较低。近期，研究人员开发出一种称为肿瘤类器官的3D体外癌症模型，可在培养皿中模拟原发肿瘤的特征。本文详细描述了从化学致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤中建立膀胱肿瘤类器官的实验步骤，包括所获得的3D肿瘤类器官在体外的培养、传代和维持。此外，还介绍了利用慢病毒介导的转导技术对已建立的膀胱肿瘤类器官系进行遗传操作的方案，包括将新的遗传元件高效导入肿瘤类器官的优化条件。最后，阐述了将膀胱肿瘤类器官原位移植至小鼠膀胱壁以进行进一步分析的操作流程。本文所述方法有助于建立膀胱癌的体外模型，从而推动更优治疗策略的开发。
引言
膀胱癌是最常见的泌尿系统癌症，每年约有16.5万名患者因此死亡1。在多种类型的膀胱癌中，肌层浸润性尿路上皮癌具有侵袭性表型，其5年生存率低于50%2。在过去几十年中，针对浸润性尿路上皮肿瘤的新型治疗手段并未得到显著拓展1。
癌细胞系已被广泛用于药物筛选3。尽管许多候选药物在癌细胞系中表现出良好的效果，但在临床试验中却报告了较差的结果4。随着细胞系对体外二维（2D）培养环境的适应性增强，越来越难以在细胞系中重现原发性肿瘤的特征。动物癌症模型或患者来源的肿瘤异种移植模型可用于弥补膀胱癌细胞系中存在的局限性。然而，动物癌症模型耗时且资源消耗大。因此，多年来一直需要更优的疾病模型，一种新型的模型系统——类器官（organoids）——已被开发出来，以克服现有模型的不足5。
类器官是一种多细胞三维结构，能够在体外重现相应体内器官的生理特征。正常类器官和肿瘤类器官可分别来源于多能干细胞或成体干细胞以及原发性肿瘤细胞5,6。近年来，研究人员已从大量不同类型的肿瘤组织中成功建立肿瘤类器官模型7，包括结肠8,9、膀胱10、胰腺11,12、前列腺13、肝脏14和乳腺15等肿瘤组织。这些肿瘤类器官在表型和遗传特征上均能模拟其来源肿瘤。由于其与体内肿瘤组织高度相似，并具备多种实际应用价值，研究人员已将其作为研究癌症发病机制的新型疾病模型。
本文阐述了从小鼠化学诱导的侵袭性尿路上皮肿瘤中建立肿瘤类器官的实验步骤16。采用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）作为致癌剂，在小鼠体内诱导产生侵袭性尿路上皮癌17，并由此类BBN诱导的小鼠膀胱癌组织建立肿瘤类器官，该类器官具有小鼠肌层浸润性膀胱肿瘤的病理学特征16。文中以慢病毒介导的转导技术为例，展示了对肿瘤类器官进行遗传操作的方法，从而构建用于研究膀胱癌分子发病机制的模型系统。此外，还介绍了一种将类器官原位移植至膀胱以探究天然膀胱微环境在膀胱癌发生中作用的研究方法。
方案
所有实验程序均经浦项科技大学机构动物照护与使用委员会（IACUC编号：POSTECH-2019-0055）批准，并在其指导下进行。
1. 膀胱肿瘤类器官的体外培养
- 从小鼠膀胱肿瘤中建立膀胱肿瘤类器官（图1A）。
注意：BBN诱导小鼠膀胱肿瘤的制备方法详见Shin等人的研究17。- 将含0.1% BBN的水置于避光瓶中，供小鼠自由饮用，持续6个月。每周更换含BBN的水两次。
注意：使用8–10周龄、体重约25 g的雄性C57BL/6小鼠。一个笼子中最多可饲养五只小鼠共用同一瓶含BBN的水。 - 6个月后，通过吸入二氧化碳处死小鼠，完整分离膀胱肿瘤组织，并转移至90 mm培养皿中。
- 使用无菌手术剪去除非癌变组织和坏死区域，用冷的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗膀胱肿瘤碎片2–3次。收集碎片并转移至新的90 mm培养皿中。
- 加入1 mL含10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的杜氏改良必需培养基（DMEM）。
- 使用灭菌剃刀刀片将肿瘤组织切碎至尽可能小的块状（0.5–1 mm3）。
- 加入9 mL含10 mM HEPES、250 µg/mL I型胶原酶、250 µg/mL II型胶原酶和250 U/mL热蛋白酶的DMEM。将切碎的肿瘤组织置于摇床培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育1.5–2小时，使组织解离为单细胞悬液。将细胞悬液转移至50 mL离心管中。
注意：若从小鼠获取的肿瘤体积大于1 cm3，可使用两倍量的热蛋白酶或延长孵育时间。 - 在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，吸除上清液。
- 用5 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液重悬沉淀，以裂解红细胞。室温（RT）孵育3–5分钟，直至红细胞完全裂解。
注意：若未观察到红细胞，可省略裂解步骤。 - 向管中加入20 mL DMEM。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，吸除上清液。
- 用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA和10 µM Y-27632二盐酸盐（Y-27632）重悬沉淀，使其解离为单细胞。将离心管置于37 °C水浴中孵育5分钟。
注意：在显微镜下观察肿瘤组织，确认其已完全解离为单细胞。若仍有细胞团块，需进一步吹打悬液。 - 使用含10%胎牛血清（FBS）的10 mL DMEM中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液通过100 µm细胞筛网过滤至新的50 mL离心管中，以去除未消化的碎片。
- 在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，吸除上清液。
- 使用150 µL冰冷新生长因子减少型基底膜基质（材料表）包被24孔板中的孔板，将24孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育30分钟，使基底膜基质凝固。
注意：使用前需在4 °C条件下解冻并保存基底膜基质，以防其提前凝固。 - 用1 mL DMEM重悬沉淀，并使用血细胞计数板计数细胞。将3–4 × 104个肿瘤细胞转移至冰上的1.5 mL微量离心管中。
- 在4 °C条件下以400 × g离心3分钟，小心弃去上清液。
- 用500 µL预热的类器官培养基（表1）和10 µM Y-27632重悬细胞，将细胞悬液转移至已包被的孔中。将24孔板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）。
- 多余的膀胱肿瘤细胞可用含10% FBS、1%青霉素/链霉素和10%二甲基亚砜（DMSO）的1 mL DMEM重悬，分装至1.5 mL冻存管中。将冻存管放入程序降温盒中，转移至-80 °C冰箱。在-80 °C冰箱中过夜后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
- 每隔2天更换一次培养基，每次加入500 µL预热的类器官培养基（图1B）。
- 将含0.1% BBN的水置于避光瓶中，供小鼠自由饮用，持续6个月。每周更换含BBN的水两次。
- 传代培养膀胱肿瘤类器官。
注意：建议在类器官直径达到100–150 µm时进行传代。- 向含有肿瘤类器官的24孔板中加入500 µL胶原酶/分散酶溶液至类器官培养基中。反复吹打基底膜基质和培养基混合物。在37 °C孵育20分钟，将细胞收集至15 mL离心管中。
注意：在显微镜下检查从基底膜基质中分离出的类器官。若类器官未完全脱离基底膜基质，可延长孵育时间或增加吹打次数。 - 加入5 mL预热的DMEM，于4 °C以400 × g离心3分钟，吸除上清液。
- 用1 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA和10 µM Y-27632重悬沉淀。在37 °C水浴中孵育5分钟。剧烈吹打细胞悬液，然后用含10% FBS的5 mL DMEM中和胰蛋白酶活性。
- 在4 °C条件下以400 × g离心3分钟，吸除上清液。
- 用1 mL预热的类器官培养基重悬沉淀，并计数单个肿瘤细胞的数量。
- 重复步骤1.1.14–1.1.18。
- 向含有肿瘤类器官的24孔板中加入500 µL胶原酶/分散酶溶液至类器官培养基中。反复吹打基底膜基质和培养基混合物。在37 °C孵育20分钟，将细胞收集至15 mL离心管中。
2. 利用慢病毒介导的转导对膀胱肿瘤类器官进行遗传操作（图2A）
- 制备表达GFP的慢病毒颗粒。
- 第0天，将HEK 293T细胞以每10 cm细胞培养皿5–6 × 106个细胞的密度接种于细胞系培养基中（例如含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM）。
- 第1天，配制DNA转染溶液，包括含有GFP的转移质粒（8 µg）、慢病毒包装质粒（pCMVR 8.74 10 µg和pMD2.G 3 µg）以及1 mL低血清培养基（材料表）。
- 根据制造商说明书，每1 µg总质粒加入3 µL转染试剂（材料表），用移液器轻轻混匀。室温孵育20分钟，然后加入9 mL含10% FBS的DMEM。
- 吸除含HEK 293T细胞的培养皿中的培养基，小心加入10 mL DNA转染溶液至HEK 293T细胞中，并在37 °C细胞培养箱中孵育。
- 第3天，在荧光显微镜下观察细胞（激发波长488 nm，发射波长512 nm），以评估转染效率。整个细胞群体中应有约90%–100%的细胞表达GFP。
- 收集上清液（含病毒），并用0.45 µm聚醚砜（PES）滤器过滤上清液。
注：请使用低蛋白结合性的滤器，例如PES滤器。 - 为浓缩病毒，将病毒上清液在4 °C条件下，使用摆桶转子于超速离心机中以98,768 × g离心2小时（材料表），然后小心弃去上清液。
- 将沉淀物重悬于2.5 mL冷的类器官培养基中。
- 长期保存时，将250 µL慢病毒培养基分装至冻存管中，使用液氮速冻。将冻存的病毒储备液保存于-80 °C冰箱中。
- 进行慢病毒介导的膀胱肿瘤类器官转导。
- 第2天，在慢病毒介导的转导前12小时，按照上述方法（步骤1.2）对肿瘤类器官进行传代处理。
- 第3天，迅速在37 °C水浴中解冻一份含病毒的分装样品（步骤2.1.9），并加入含有10 µM Y-27632和8 µg/mL六甲溴铵的250 µL类器官培养基。
- 将含肿瘤类器官的24孔板中的培养基更换为500 µL含病毒的培养基，并在培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育12–16小时。
- 第4天，更换为500 µL新鲜类器官培养基。
注：孵育12–16小时后应更换培养基，因为含慢病毒和六甲溴铵的培养基具有细胞毒性。 - 第6天，在转导后第3天，于荧光显微镜下观察肿瘤类器官的GFP信号（图2B）。
- 第10天，在转导后第7天，按照步骤1.2所述方法对类器官进行传代和冻存，以维持基因修饰的肿瘤类器官系。
3. 膀胱类器官的原位移植（图3A）
- 准备膀胱肿瘤类器官用于原位移植。
- 移植前，将膀胱肿瘤类器官按照上述方法（步骤1.2）培养5–7天。
- 在含有肿瘤类器官的24孔板中，向类器官培养基中加入500 µL胶原酶/分散酶。用移液器反复吹打基底膜基质和培养基。在37 °C孵育20分钟，然后将细胞收集至15 mL离心管中。
- 加入5 mL预热的DMEM，于4 °C以400 × g离心3分钟，并吸除上清液。
- 用1 mL DMEM重悬沉淀，将溶液转移至90 mm培养皿中。
- 在显微镜下，使用p200微量移液器挑取10–100个肿瘤类器官，并将其收集到冰上的微量离心管中。
- 于4 °C以400 × g离心3分钟，小心弃去上清液。
- 将细胞沉淀置于冰上保存，直至小鼠准备就绪进行手术。
- 膀胱壁黏膜下移植
注意：本操作步骤改编自Fu等18发表的方案。- 在实验前至少1周准备一只8至10周龄的雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl），使其适应新环境。术前24小时皮下注射恩诺沙星（5 mg/kg）。
- 用肥皂和水清洁实验台面。手术前对所有手术器械进行高压灭菌，并在手术过程中使用无菌器械。
- 将29 G胰岛素注射器、移液器吸头和基底膜基质置于冰上。麻醉给药前皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）。
- 在诱导室中使用4%异氟烷麻醉小鼠。达到全身麻醉后，将小鼠置于仰卧位，并通过面罩吸入2%气化异氟烷维持麻醉。
注意：若麻醉时间超过30分钟，应使用棉签将眼膏涂抹于双眼，以防角膜干燥。 - 使用无菌纱布蘸取聚维酮碘消毒，再用70%乙醇擦拭。每次更换新的纱布或棉签，重复此过程3次。
- 使用一次性无菌手术巾覆盖肛门及手术区域。
- 在解剖显微镜下放大视野，使用无菌手术剪在下腹正中皮肤和肌层做一个小的横向切口（小于1.5 cm）。从腹腔中暴露膀胱，并用浸有生理盐水的棉签支撑固定。
注意：若膀胱充满尿液，可轻压膀胱以适当减压。 - 将类器官沉淀（步骤3.1.7）重悬于80 µL含50%高浓度基底膜基质的类器官培养基中（材料表）。
- 在解剖显微镜下，使用29 G胰岛素注射器将类器官悬液注射至膀胱顶部前侧。
- 使用抗菌可吸收缝线缝合腹壁内层，再用4-0尼龙缝线缝合外层。用聚维酮碘和70%乙醇对手术部位进行消毒。
- 将小鼠置于红外线照射器下恢复10–15分钟。密切观察直至其恢复意识和活动能力。
- 术后第一天检查小鼠的一般状况及吻合口有无渗漏。术后连续3天每日皮下注射酮洛芬（5 mg/kg），术后连续10天每日给予恩诺沙星（5 mg/kg）治疗。
- 待切口愈合后（术后10–14天），拆除缝线。在类器官注射后2–3周内监测小鼠膀胱肿瘤的生长情况。
- 若观察到膀胱肿瘤生长，采用二氧化碳吸入法处死小鼠，并完整取出膀胱肿瘤组织。用冷DPBS冲洗组织（图3B）16。
- 为分析膀胱肿瘤组织病理学特征，对石蜡包埋的组织切片进行苏木精-伊红（H和E）染色（图3B）16。
结果
小鼠膀胱肿瘤类器官的体外培养
从一个约1 cm3的BBN诱导肿瘤中解离出的肿瘤细胞数量至少为4 x 105个细胞。当细胞最初接种于基底膜基质中时，可能会观察到非癌细胞和细胞碎片。通过持续传代培养，这些碎片会逐渐被稀释去除。图1B展示了不同时间点培养的类器官图像。如果肿瘤细胞未能形成肿瘤类器官，则可能在解离过程中已死亡。在此情况下，需调整解离步骤中的操作，包括酶消化的孵育时间，以提高细胞活力。
利用慢病毒介导的遗传操作在膀胱肿瘤类器官中表达GFP
膀胱肿瘤类器官在成功感染慢病毒后表现出强烈的GFP信号（图2B）。浓缩后，总共250 µL含病毒的培养基足以感染基底膜基质上的3 x 104个单个肿瘤细胞，并保持90%–100%的感染效率。在慢病毒转导3天后即可检测到膀胱肿瘤类器官中的GFP信号。如果荧光信号较弱，则病毒感染效率可能较低，这可能由多种因素引起，例如病毒滴度低，此时需要相应调整实验步骤。
膀胱肿瘤类器官的原位移植
图3B16展示了来自BBN诱导的膀胱肿瘤类器官获得的膀胱肿瘤同种异体移植物。在原位移植3周后收获膀胱肿瘤同种异体移植物，并通过苏木精和伊红（H&E）染色分析移植后膀胱肿瘤的组织学特征。肿瘤类器官的原位移植可在膀胱内生长2–3周。
图1：小鼠膀胱肿瘤类器官的体外培养。（A）小鼠膀胱肿瘤类器官建立的示意图。（B）膀胱肿瘤类器官在不同时间点培养的代表性图像。小鼠膀胱肿瘤类器官建立后培养了9天。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：利用慢病毒介导的遗传操作在膀胱肿瘤类器官中表达GFP。（A）慢病毒转染及膀胱肿瘤类器官转导的示意图。（B）表达GFP的膀胱肿瘤类器官的代表性图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：膀胱肿瘤类器官的原位移植。（A）膀胱肿瘤类器官移植至裸鼠体内的示意图。（B）接受膀胱肿瘤类器官原位移植的小鼠膀胱及其H和E染色切片的代表性图像。中间图中框选区域的放大视图显示在左侧图中。比例尺 = 500 µm。本图改编自Kim等16的图1—图补充1，根据知识共享署名4.0国际公共许可协议（CC BY 4.0；https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）发布。请点击此处查看该图的放大版本。
| 小鼠膀胱肿瘤类器官培养基 | |
| Advanced DMEM/F-12（基础培养基） | 10 mM HEPES（pH 7.4） |
| 10 mM 烟酰胺 | 0.5x 无血清添加剂 |
| 2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽 | 1% 青霉素/链霉素 |
| 1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸 | 50 ng/mL 小鼠表皮生长因子 |
| 1 µM A 83-01 | |
表1：膀胱肿瘤类器官培养基的成分。
讨论
本实验方案描述了培养和维持由致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤衍生的膀胱肿瘤类器官的实验操作步骤。
在本实验方案中，有若干实验步骤可能需要进行问题排查。首先，初始接种的肿瘤细胞数量是一个关键因素，因为培养中肿瘤细胞数量过少（<2 × 104 个细胞）通常会导致细胞死亡，这主要是由于肿瘤细胞之间缺乏相互作用。相反，若接种时细胞数量过多（>5 × 104 个细胞），则会导致类器官过度拥挤，造成培养物难以处理，并且每个类器官的生长状况较差。强烈建议在实验初期设置多个不同细胞数量的培养板，以优化实验条件。确定合适的初始肿瘤细胞数量对于实现最高的细胞存活率以及成功建立膀胱肿瘤类器官至关重要。此外，在长期培养超过2周且未进行传代的情况下，大多数肿瘤类器官会停止生长，这可能是由于类器官中心区域营养供应不足以及基底膜基质中生长因子耗尽所致。因此，及时对类器官进行传代培养是维持肿瘤类器官培养的关键步骤。
其次，高效价慢病毒颗粒的制备对于肿瘤类器官的高效遗传操作至关重要。为排查与病毒滴度相关的问题，强烈建议每次病毒转导前均测定病毒滴度，因为慢病毒载体产生病毒颗粒的效率往往存在差异。若肿瘤类器官在病毒感染后出现存活率偏低的情况，可能是病毒滴度过高所致。此时强烈建议减少病毒使用量。第三，在将BBN诱导的膀胱肿瘤类器官进行原位移植时，维持膀胱壁的完整性至关重要。若注射过程中穿透膀胱壁层而进入膀胱腔内，则应终止实验并弃用该样本。如条件允许，建议使用超声成像系统监测膀胱肿瘤的生长情况。
当前技术的一个局限性在于这些类器官中缺乏肿瘤微环境或间质。为解决这一问题，强烈建议采用体内系统进行肿瘤类器官的原位移植，以模拟天然的肿瘤微环境。未来有必要开发由肿瘤类器官与其他肿瘤间质成分共同组成的三维体外类器官系统。
本技术的一个重要意义在于，在膀胱肿瘤类器官的原位移植中，仅需10个膀胱肿瘤类器官即可在膀胱内诱导肿瘤生长。与传统肿瘤移植实验需要5 × 105–1 × 106个单个膀胱肿瘤细胞相比，我们的方法效率更高且更可靠。另一个重要区别在于，可利用多种慢病毒载体对类器官进行多样化操作，例如包含短发夹RNA、CRISPR–Cas9系统或目的基因的慢病毒载体。这些工具将为现有的类器官技术提供有力补充。总体而言，本文所介绍的实验方法有助于建立体外肿瘤模型，从而增进对膀胱癌发病机制的理解，而非依赖二维膀胱癌细胞系。
该方法能够建立来源于致癌剂诱导的小鼠膀胱肿瘤的膀胱肿瘤类器官。本文描述了通过慢病毒介导的实验步骤，实现对膀胱肿瘤类器官进行基因改造并使其稳定维持的方法。此外，还包括肿瘤类器官原位移植的操作流程。结合现有的体内癌症模型，该技术将成为研究膀胱肿瘤发生分子机制的有力工具。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会向 K.S. 提供的资助支持：NRF-2017R1A2B4006043、NRF-2017M3C7A1047875、NRF-2017R1A5A1015366、创意经济领先技术开发计划（SF317001A）、POSCO（2018Y060）以及 BK21 Plus 研究奖学金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm 注射器滤器（PES 膜） | Millipore | SLHP033RS | |
| 10 cm 培养皿 | Eppendorf | 0030-702-115 | |
| 90 mm 培养皿 | SPL | 10090 | |
| 100 µm 细胞筛 | Corning | 352360 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | SPL | 50015 | |
| 24 孔板 | Corning | 3526 | |
| 29 G 1/2 胰岛素注射器 | SHINA | B299473538 | |
| 3 mL 注射器 | Norm-ject | N7.A03 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | SPL | 50050 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | 储存液浓度：25 mM |
| 无水乙醇 | Daejung | 4023-2304 | |
| 可吸收缝合线 | Henry Schein | 039010 | |
| 高级 DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
| 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液 | Thermo | A1049201 | |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 储存液浓度：50X |
| BBN（N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺） | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
| 蓝色尼龙 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
| C57BL 小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl（裸鼠） | Charles River | 194 | |
| I 型胶原酶 | Thermo | 17100017 | 储存液浓度：20 mg/mL |
| II 型胶原酶 | Thermo | 17100015 | 储存液浓度：20 mg/mL |
| 胶原酶/分散酶 | Sigma | 10269638001 | 储存液浓度：1 mg/mL |
| Cyrovial 冻存管 | Corning | 430488 | |
| DMEM（杜氏改良伊格尔培养基） | Gibco | 11965-118 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma | D8418 | |
| DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液） | Welgene | LB 001-02 | |
| 恩诺沙星（Baytril） | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
| FBS（胎牛血清） | Millipore | ES009B-KC | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸） | Welgene | BB001-01 | |
| 异氟烷 | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
| 酮洛芬（Anafen） | Merial | DIN: 02150999 | |
| 基质胶生长因子减少型（GFR） 生长因子 减少型（GFR） | Corning | 354230 | 用于板中类器官培养 |
| 高浓度基质胶（HC） | Corning | 354248 | 用于类器官移植 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| LT1 转染试剂 | Mirus Bio | MIR 2300 | |
| 小鼠 EGF（表皮生长因子） | Peprotech | 315-09 | 储存液浓度：100 µg/mL |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A9165 | 储存液浓度：200 mM |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | 储存液浓度：1 M |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | 包装质粒 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | 100X |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | 包膜质粒 |
| 聚凝胺（hexadimethrine bromide） | Sigma | H9286 | 储存液浓度：2 µg/mL |
| pSiCoR | Addgene | 11579 | 慢病毒质粒 |
| 剃刀刀片 | |||
| 生理盐水缓冲液 | JW Pharmaceutical | ||
| SW41Ti 摆动桶转子 | Beckman Coulter | ||
| 嗜热菌蛋白酶（Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus） | Millipore | 58656-2500KUCN | 储存液浓度：250 KU/mL |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco | 25200072 | |
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 331372 | |
| Y-27632 二盐酸盐 | Abmole | M1817 | 储存液浓度：10 mM |
参考文献
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