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利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

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DOI：

10.3791/60478

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2019年11月15日

 , 
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB 的图像处理技术，对处于有丝分裂前期的细胞进行微管动力学分析的稳健且详细的方法。

摘要

我们描述了一种改进的已建立方法，用于测定活细胞中微管的动力学。该方案基于表达一种基因编码的微管正端标记物（以tdTomato荧光蛋白标记的EB3），并结合高速、高分辨率的活细胞成像技术，使用转盘共聚焦显微镜进行观察。通过抑制有丝分裂细胞中中心体的分离，实现细胞周期同步化并增加微管密度，微管生长的分析则使用开源的U-Track软件完成。由于采用了亮度高且荧光波长红移的荧光蛋白，结合转盘显微镜所需的较低激光功率和更短的曝光时间，显著降低了光毒性以及光诱导伪影的发生概率。这使得在相同样本中可对更多细胞进行成像，同时在标准培养条件下维持细胞处于生长培养基中。由于分析过程以半自动方式进行，结果具有良好的统计稳健性和可重复性。

引言

微管（MTs）是几乎存在于所有真核细胞以及某些细菌中的高度动态结构1。微管与肌动蛋白和中间纤维共同构成细胞骨架2,3。细胞分裂4、分子运输5、鞭毛摆动6、通过初级纤毛感知周围环境7、听觉（动纤毛）8,9、胚胎发育10,11,12、侵袭与转移13,14，甚至记忆形成15,16,17,18 等众多过程主要依赖于微管。若无微管在生长（聚合）与缩短（解聚）之间快速切换的显著能力，上述所有过程均无法实现。这一特性被称为动态不稳定性19。在多种病理状态下，微管的动态性会发生改变20,21,22。因此，明确这一特性的本质有助于理解疾病机制，并进而推动其治疗策略的发展。

已开发出多种用于微管（MT）动态分析的方法，其中大多数基于成像技术23。最初，宽场光学显微镜被用于观察体外微管蛋白聚合物的形成过程24。随着发现能够富集于微管正端的末端结合（EB）蛋白，以及荧光标记蛋白技术的发展，研究人员得以利用宽场和共聚焦荧光显微镜直接观察活细胞中微管的行为25,26,27。其中一种EB蛋白是末端结合蛋白3（EB3）28；通过过表达并追踪与荧光蛋白融合的EB3，可测定微管正端的组装速率29,30。

共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）常用于观察微管（MT）动态。然而，这种成像技术存在较高的光毒性和光漂白风险，而这两种过程对活细胞和弱信号样品的成像极为不利31。为了获得更好的信噪比，激光功率和曝光时间应足够高，但又不能损伤样品，这通常需要以牺牲分辨率来换取成像速度。一种合适的替代CLSM的方法是转盘显微镜32。该成像方式基于使用尼普科夫盘（Nipkow disk）33，其由一个带有针孔阵列的旋转圆盘构成，其工作原理相当于多个共聚焦显微镜同时对同一样品进行成像34。因此，激光光源可同时照射样品中的多个区域，但仍保持共焦特性。尼普科夫盘因而能够以更快的速度、更低的激光功率获得与CLSM相似的图像。日本横河电机（Yokogawa Electric）进一步改进了尼普科夫盘，引入了第二个带有微透镜阵列的圆盘，每个微透镜将光线单独导入对应的针孔，从而进一步降低光毒性和光漂白效应35。因此，转盘激光扫描显微镜已成为活细胞成像的首选方法，能够在高速条件下获得高信噪比的图像31,36，这对于分辨快速生长的微管末端等快速动态信号至关重要。

微管（MT）的动态行为在不同时期存在差异。例如，有丝分裂期的微管比间期的微管更具动态性37,38。类似地，即使在同一细胞周期阶段（如有丝分裂期），微管的生长速率和缩短行为也存在差异39,40。因此，为了避免获取错误数据，对微管动态的测量应限定在细胞周期中的特定狭窄时间窗口内进行。例如，可通过使用二甲基依那斯特隆（dimethyl­enastron, DME）——一种抑制马达蛋白kinesin Eg5的单星孢素类似物——处理细胞，使其停滞在前中期，从而实现对前中期微管动态的测量41，并阻止双极有丝分裂纺锤体的形成42。使用Eg5抑制剂DME或其他单星孢素衍生物将细胞阻滞在前中期，并不会影响微管的动态特性43,44,45，这使得DME成为在固定细胞和活细胞中研究微管动态的有用工具44。

本文结合了 Ertych 等人44所描述的分裂前期细胞中微管（MT）动态分析方法与双转盘共聚焦成像技术。该方法能够在单个焦平面上以更高的成像速率检测分裂前期细胞的微管动态，同时避免光漂白并最大限度地减少光毒性。此外，我们采用串联二聚体番茄荧光蛋白（tdTomato）作为荧光报告分子，其亮度和光稳定性优于绿色荧光蛋白（EGFP），且可由较低能量的光激发46。因此，tdTomato 激发所需的激光功率更低，光毒性更小。综上所述，我们通过降低光毒性、提高分辨率以及优化微管动态分析所需的后期处理步骤，进一步改进了该方法。此外，通过将该方法与其他同步化技术相结合，我们为未来的方法学改进奠定了基础。

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方案

1. 接种 HeLa 细胞

  1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 2 mL 浓度为 5 μg/mL 的纤连蛋白溶液，并向每孔 4 孔板载玻片（#1.5）中加入 450 μL。将载玻片在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 15 分钟。
  2. 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗异步生长的 HeLa 细胞，并在 37 °C 下用胰蛋白酶-EDTA（0.05% : 0.02%；w:v）孵育 5 分钟。按加入胰蛋白酶-EDTA 体积的 3:1（v:v）比例加入含 10% 热灭活胎牛血清（FCS）的 RPMI 1640 培养基以终止酶反应。
    注意：HeLa 细胞在含 10% 热灭活 FCS 的 RPMI 1640 培养基中，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养，当细胞融合度达到 80–90% 时，按上述方法常规传代。
  3. 使用血球计数板测定细胞浓度。取 50 μL 细胞悬液与台盼蓝按 1:1（v:v）比例混合，重悬后取 10 μL 加入计数室。仅计数四个大方格内未被台盼蓝染色的细胞（具体方法见 Phelan 等47）。根据计数结果，使用以下公式计算细胞浓度：
    figure-protocol-1
  4. 在 300 x g 条件下离心 2 分钟使细胞沉淀。用新鲜 RPMI 1640 培养基重悬，调整细胞密度至 1 x 106 个细胞/mL。
  5. 从板载玻片中移除纤连蛋白溶液，用 DPBS 洗涤各孔两次，每孔接种 50,000 个细胞。
  6. 将接种细胞的板载玻片放回培养箱，在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养 24 小时。

2. 在 HeLa 细胞中表达 pEB3-tdTomato

  1. 准备一个1.5 mL的微量离心管。每个管中，将2 μg的pEB3-tdTomato48用转染缓冲液（水溶液中的合成产物）稀释至终体积为396 μL。
  2. 向第一个管中加入4 μL转染试剂（非脂质类，含聚乙烯亚胺），立即涡旋混合10秒。
  3. 短暂离心收集管壁液体，室温（RT）孵育10分钟。
  4. 从培养箱中取出HeLa细胞，逐滴加入100 μL转染混合物至4孔板盖玻片的每个孔中，然后将细胞放回培养箱。
  5. 在37 °C和5% CO2条件下孵育4小时后，向细胞中补充新鲜培养基，并在37 °C和5% CO2条件下继续孵育至少24小时。
    注意：每种细胞类型的转染条件均需优化。EB3-tdTomato的表达水平应足够低，以便识别单个微管生长末端。或者，实验中可使用稳定表达EB3-tdTomato的细胞系；这将减少不同制备样品之间以及同一制备样品内不同细胞间EB3-tdTomato表达水平的变异性49。

3. 表达 pEB3-tdTomato 的 HeLa 细胞的同步化与活细胞成像

  1. 在不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制 2.5 μM 的二甲基萘星（DME）溶液，该培养基需添加 10% 胎牛血清（FCS）和 2 mM L-谷氨酰胺，或使用其他替代的谷氨酰胺来源。
  2. 将腔室盖玻片中的生长培养基更换为 500 μL 含 2.5 μM DME 的生长培养基，并将细胞在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。
  3. DME 孵育 3.5 小时后，将细胞转移至显微镜下，将腔室盖玻片安装到带有遮光板的环境培养箱中，以在 37 °C 和 5% CO2 条件下进行成像，并继续孵育直至总孵育时间达到 4 小时。
    注意： 实验过程中维持 37 °C 的恒定温度至关重要，避免温度波动。
  4. 在配备 100 倍、1.49 数值孔径（N.A.）油浸物镜、双转盘共聚焦系统以及可靠自动对焦系统的倒置显微镜上进行延时成像。按以下方式设定成像参数：
    注意： 我们使用的是电子倍增电荷耦合器件相机（EM-CCD）。
    1. 对 EB3-tdTomato 进行激发时，使用 561 nm 激光线，曝光时间为 200 ms。通过四通道带通（405、488、561、640 nm）二向色镜和 600/52 nm 发射滤光片收集发射光。
      注意： 可针对每个成像细胞调整激光功率，以防止图像饱和。本研究所提供的所有延时视频中，激光功率均设定为 5.3 mW。
    2. 选择一个处于前期的细胞，并在 Z 平面上聚焦至单极有丝分裂纺锤体的中心位置。以每 0.5 秒采集一帧的频率，连续采集 1 分钟的图像，不进行像素合并，且两次曝光之间无照明。

4. 使用 U-Track v2.2.0 分析微管动力学

  1. 为分析微管（MT）动态，需要使用数值计算环境软件（例如 MATLAB）。
    注意：掌握该软件的基本知识即可满足分析需求。开发者网站上提供全面的帮助文档和教程（https://uk.mathworks.com/products/­matlab/­getting-started.html）。
  2. 下载（https://github.com/DanuserLab/u-track）并按照“Readme_u-track.pdf”文件中提供的详细说明安装开源软件 U-Track v2.2.050,51,52。
  3. 启动数值分析软件，并将 U-Track v2.2.0 文件夹及其子文件夹添加至软件的搜索路径中。
  4. 在命令窗口中调用“movieSelectorGUI”。这将打开一个对话窗口，可从中导入显微镜图像采集软件生成的原始文件（补充图1、图2、图3、图4）。
    注意：U-Track 软件兼容其他图像数据格式。它使用 Bio-Formats，可识别多种生命科学数据格式53。
  5. 图像的尺寸将自动从元数据中读取。手动输入物镜的数值孔径（本例中为 1.49）以及成像所用的时间间隔（0.5 s）（补充图1B）。此外，也可提供激发波长、荧光染料和曝光时间等信息，但这些参数对后续分析并非关键。
  6. 所有图像加载完成后，选择“另存为电影列表”将输入的时间序列保存为电影列表。在对话窗口右侧选择“U-Track”选项，然后点击“继续”（补充图1C）。
    注意：这些参数针对 HeLa 细胞进行了优化。若更换为其他细胞系，应重新定义参数。也可使用软件开发者推荐的设置。各参数的详细说明及其定义方法可在该软件前一版本 plusTipTracker 附带的技术报告中找到50。
  7. 在弹出窗口中选择“微管正端”，然后点击“确定”（补充图1C）。新出现的对话窗口允许设定分析三个步骤的参数（补充图1D），即检测、追踪和轨迹分析。
  8. 在步骤1中选择“设置”，并在下拉菜单中选择“彗星检测”作为检测方法（补充图2B）。
    1. 在新出现的对话窗口中，按以下方式设定高斯差滤波器和分水岭分割的参数（补充图2C）：检测所用的掩模处理 = 无；低通高斯标准差 = 1 像素；高通高斯标准差 = 3 像素；最小阈值 = 3 个标准差；阈值步长 = 0.25 个标准差。选择“将设置应用于所有电影”和“应用”。
  9. 在步骤2中，链接、间隙闭合、合并与分裂以及卡尔曼滤波功能的参数分为三步设定，分别以粉红色、绿色和蓝色高亮显示（补充图3B）。对于这些步骤，选择“微管正端动态”，然后通过“设置”选项分别定义 补充图3C–E 中所示的参数。
    1. 对于维度问题，在下拉菜单中选择“2”。最大闭合间隙 = 5 帧；第一步生成的轨迹段最小长度 = 3 帧。与之前相同，选择“将设置应用于所有电影”并点击“应用”。
  10. 在分析的第3步中，对检测到的微管轨迹进行分类（补充图4）。选择“微管动态分类”作为轨迹分析方法，并通过“设置”按钮定义 补充图4B,C 中所示的参数。之后，勾选“将设置应用于所有电影”并点击“应用”。
  11. 所有参数设定完成后，在“控制面板–U-Track”窗口（补充图1D）中勾选“将选中/取消选中应用于所有电影”和“运行所有电影”，然后点击“运行”。这将启动对时间序列的微管分析。
  12. 电影处理完成后，会显示消息“您的电影已成功处理”。点击“确定”，然后点击“保存”。
  13. 现在可以安全退出数值分析软件。电影处理结果将以 m 文件形式存储在原始文件所在文件夹的子文件夹结构中。

5. 微管动力学的统计分析

  1. 将 m 文件导入首选的统计分析程序中。
    注意： 在本例中，我们首先将文件导入标准电子表格中，以便读取。m 文件包含有关不同参数（例如生长速度、微管动态性）的统计信息（中位数、均值和标准差）。参数的详细列表见随软件前一版本提供的技术报告，plusTipTracker50,52。生成的 m 文件也可导入其他数据处理软件中。
  2. 选择“生长速度均值”参数，并将其导入表格中用于统计分析和绘图。将其他参数（例如“动态性”）的信息输入新表格中，或输入同一分组表格的新列中并进行绘图。

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结果

按照图1A中所述方案，将pEB3-tdTomato质粒瞬时转染至处于非同步生长状态的HeLa细胞中。转染后48 h，通过DME处理将细胞阻滞在早前期，实现细胞周期同步化（图1B）。该步骤确保微管（MT）动力学的测量始终处于细胞周期的同一阶段。随后，使用U-Track v2.2.0软件对延时成像视频进行进一步处理与分析，具体操作详见其补充文档50,51,52。尽管加端结合蛋白仅能标记微管的生长期，U-Track v2.2.0可通过连接连续的生长期并重建完整轨迹，推断出暂停和缩短事件的相关信息26,50。该算法基于Jaqaman等人描述的空间和时间上的全局追踪框架51。

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讨论

本文描述了一种对 Ertych 等人首次建立的方法所进行的改进44。在多项其他改进的基础上，我们将微管（MT）动态分析技术与双转盘共聚焦成像相结合。使用双转盘可提高生长中微管的分辨率，同时降低光毒性36。为进一步减少光漂白及激光照射对细胞造成的损伤，我们改用更长波长的荧光报告蛋白。与 EGFP 相比，tdTomato 荧光蛋白具有更高的光稳定性和亮度46。最后，由于后续使用 U-Track 软件分析的限制，微管动态的测量仅限于单个 Z 平面。U-Track 软件的设计目的是在 XYZ 轴上检测荧光标记的微管末端50,51。因此，若采集 Z 轴层扫的时间序列图像并生成最大投影时间序列，则容易产生假阳性结果。在不同 Z 平面上检测到的信号、且并不属于同一条生长中微管的信号，会在最大投影中被合并，从而形成虚假的微管生长轨迹。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢马克斯·普朗克实验医学研究所光学显微镜中心的成员提供的专业建议和支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二甲基萘星素Merck324622
无酚红 DMEMGibco31053-28
DPBSGibco14190-094
胎牛血清BiochromS0415
牛血浆纤维连接蛋白MerckF4759无菌粉末
GlutaMAXGibco35050-038稳定的谷氨酰胺替代物
jetPRIMEPolyplus114-15
EB3-TdTomatoAddgene质粒 #50708
RPMI 1640Gibco61870-010
台盼蓝MerckT8154-20ML
胰蛋白酶/EDTA 溶液BiochromL21430.05%/0.02%，不含钙和镁
µ-slideIbidi804264孔载玻片，带 #1.5 盖玻片
Eclipse Ti 倒置显微镜NikonNA
物镜NikonMRD01991CFI Apo TIRF 100xC 油镜
ACAL 激光交换器Nikon激光盒，波长：405、458、488、514、561 和 647 nm
转盘式共聚焦模块AndorCSU-W
相机AndoriXon Ultra 888
环境培养箱Okolab暗室，配备 CO2 供应、温度控制和加湿器
HeLa 细胞DSMZACC-57
NIS Elements v4Nikon转盘式共聚焦显微镜采集软件
MATLABMathworks计算环境
Prism 8GraphPad统计分析与绘图软件

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