利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

摘要

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB 的图像处理技术，对处于有丝分裂前期的细胞进行微管动力学分析的稳健且详细的方法。

摘要

我们描述了一种改进的已建立方法，用于测定活细胞中微管的动力学。该方案基于表达一种基因编码的微管正端标记物（以tdTomato荧光蛋白标记的EB3），并结合高速、高分辨率的活细胞成像技术，使用转盘共聚焦显微镜进行观察。通过抑制有丝分裂细胞中中心体的分离，实现细胞周期同步化并增加微管密度，微管生长的分析则使用开源的U-Track软件完成。由于采用了亮度高且荧光波长红移的荧光蛋白，结合转盘显微镜所需的较低激光功率和更短的曝光时间，显著降低了光毒性以及光诱导伪影的发生概率。这使得在相同样本中可对更多细胞进行成像，同时在标准培养条件下维持细胞处于生长培养基中。由于分析过程以半自动方式进行，结果具有良好的统计稳健性和可重复性。

引言

微管（MTs）是几乎存在于所有真核细胞以及某些细菌中的高度动态结构¹。微管与肌动蛋白和中间纤维共同构成细胞骨架^2,3。细胞分裂⁴、分子运输⁵、鞭毛摆动⁶、通过初级纤毛感知周围环境⁷、听觉（动纤毛）^8,9、胚胎发育^10,11,12、侵袭与转移^13,14，甚至记忆形成^15,16,17,18 等众多过程主要依赖于微管....

方案

1. 接种 HeLa 细胞

1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 2 mL 浓度为 5 μg/mL 的纤连蛋白溶液，并向每孔 4 孔板载玻片（#1.5）中加入 450 μL。将载玻片在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 15 分钟。
2. 用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗异步生长的 HeLa 细胞，并在 37 °C 下用胰蛋白酶-EDTA（0.05% : 0.02%；w:v）孵育 5 分钟。按加入胰蛋白酶-EDTA 体积的 3:1（v:v）比例加入含 10% 热灭活胎牛血清（FCS）的 RPMI 1640 培养基以终止酶反应。
   注意：HeLa 细胞在含 10% 热灭活 FCS 的 RPMI 1640 培养基中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养，当细胞融合度达到 80–90% 时，按上述方法常规传代。
3. 使用血球计数板测定细胞浓度。取 50 μL 细胞悬液与台盼蓝按 1:1（v:v）比例混合，重悬后取 10 μL 加入计数室。仅计数四个大方格内未被台盼蓝染色的细胞（具体方法见 Phelan 等⁴⁷）。根据计数结果，使用以下公式计算细胞浓度：
   

结果

按照图1A中所述方案，将pEB3-tdTomato质粒瞬时转染至处于非同步生长状态的HeLa细胞中。转染后48 h，通过DME处理将细胞阻滞在早前期，实现细胞周期同步化（图1B）。该步骤确保微管（MT）动力学的测量始终处于细胞周期的同一阶段。随后，使用U-Track v2.2.0软件对延时成像视频进行进一步处理与分析，具体操作详见其补充文档^50,51,52。尽管加端结合蛋白仅能标记微管的生长期，U-Track v2.2.0可通过连接连续的生长期并重建完整轨迹，推断出暂停和缩短事件的相关信息^26,50。该算法基于Jaqaman等人描述的空间和时间上的全局追踪框架⁵¹。

讨论

本文描述了一种对 Ertych 等人首次建立的方法所进行的改进⁴⁴。在多项其他改进的基础上，我们将微管（MT）动态分析技术与双转盘共聚焦成像相结合。使用双转盘可提高生长中微管的分辨率，同时降低光毒性³⁶。为进一步减少光漂白及激光照射对细胞造成的损伤，我们改用更长波长的荧光报告蛋白。与 EGFP 相比，tdTomato 荧光蛋白具有更高的光稳定性和亮度⁴⁶。最后，由于后续使用 U-Track 软件分析的限制，微管动态的测量仅限于单个 Z 平面。U-Track 软件的设计目的是在 XYZ 轴上检测荧光标记的微管末端^50,51。因此，若采集 Z 轴层扫的时间序列图像并生成最大投影时间序列，则容易产生假阳性结果。在不同 Z 平面上检测到的信号、且并不属于同一条生长中微管的信号，会在最大投影中被合并，从而形成虚假的微管生长轨迹。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基萘星素	Merck	324622
无酚红 DMEM	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
胎牛血清	Biochrom	S0415
牛血浆纤维连接蛋白	Merck	F4759	无菌粉末
GlutaMAX	Gibco	35050-038	稳定的谷氨酰胺替代物
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	质粒 #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
台盼蓝	Merck	T8154-20ML
胰蛋白酶/EDTA 溶液	Biochrom	L2143	0.05%/0.02%，不含钙和镁
µ-slide	Ibidi	80426	4孔载玻片，带 #1.5 盖玻片
Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon	NA
物镜	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100xC 油镜
ACAL 激光交换器	Nikon		激光盒，波长：405、458、488、514、561 和 647 nm
转盘式共聚焦模块	Andor	CSU-W
相机	Andor	iXon Ultra 888
环境培养箱	Okolab		暗室，配备 CO2 供应、温度控制和加湿器
HeLa 细胞	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		转盘式共聚焦显微镜采集软件
MATLAB	Mathworks		计算环境
Prism 8	GraphPad		统计分析与绘图软件