通过透明化心脏三维成像捕获靶向细胞群体的心肌损伤反应

摘要

心肌细胞在损伤后的增殖是一个动态过程，需要来自非心肌细胞群体的多种细胞外信号协同作用。通过利用谱系示踪、被动透明化（passive CLARITY）以及三维整体共聚焦显微镜技术，我们可以分析多种细胞类型对心脏修复与再生的影响。

摘要

心血管疾病是全球首要死因，占全球死亡总数的31%。该疾病主要表现为心脏损伤，尤其是急性心肌梗死。心脏在受损后自我修复能力有限，原本健康的心肌组织将被纤维化、无收缩功能的瘢痕组织取代，常常成为心力衰竭的前兆。为了探索再生医学中的新型治疗策略，研究聚焦于具有天然再生能力的脊椎动物。新生小鼠便是其中一种模式生物，其在心脏损伤后可发生显著的心肌再生。为了在新生小鼠中诱导出具有临床相关性的损伤，我们开发了一种手术方法，通过结扎左前降支冠状动脉（LAD），模拟人类心脏因动脉粥样硬化引发的心肌梗死。结合可追踪心肌细胞及非心肌细胞群体变化的技术，该模型为我们提供了识别心脏再生机制的研究平台。过去，研究心脏细胞群体在损伤后的变化主要依赖组织切片和组织学检查等方法，但这些方法仅能进行二维分析，且常在处理过程中损伤组织。此外，这些方法无法追踪细胞谱系的动态变化，仅能提供损伤反应的静态图像。本文中，我们介绍如何利用先进的谱系追踪模型、全器官透明化技术以及三维（3D）整体成像显微技术，阐明心脏修复的机制。通过我们建立的新生小鼠心肌梗死手术、组织透明化及三维全器官成像方案，可解析诱导心肌细胞增殖的复杂通路，揭示心脏再生的新型治疗靶点。

引言

长期以来，心脏被认为是一个有丝分裂后器官，但最近的证据表明，成人心脏中心肌细胞的更新率约为每年1%¹。然而，这种低水平的心肌细胞更替速率不足以弥补损伤后所发生的大量组织丢失。发生心肌梗死的心脏会损失约十亿个心肌细胞，这常常是心力衰竭和猝死的前兆^2,3。全球有超过2600万人受心力衰竭影响，目前仍缺乏能够逆转心脏病造成损害的治疗手段⁴。

为了弥补治疗手段上的这一空白，科学家们开始研究损伤后内源性再生所依赖的进化上保守的机制。研究哺乳动物心脏再生的一个模型是新生小鼠。出生后一周内，新生小鼠在心脏受损后具有强大的再生能力⁵。我们先前已证明，新生小鼠可通过心肌细胞增殖实现心脏再生，该过程可在心尖切除术后被激活⁵。尽管该技术可在新生小鼠中诱导心脏再生，但该手术与人类心脏损伤的临床情况缺乏相关性。为了在新生小鼠模型中模拟人类心脏损伤，我们建立了一种通过冠状动脉闭塞诱导心肌梗死的技术⁶。该技术需要手术结扎左前降支动脉（LAD），该动脉负责向左心室心肌输送40%–50%的血液^6,

方案

所有实验均遵循《实验动物使用与护理指南》进行，并符合威斯康星大学麦迪逊分校医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会的规定。所有方法均在野生型 C57BL/6J (B6) 和来自杰克逊实验室的转基因小鼠品系上实施。

1. 通过结扎1日龄新生小鼠左前降支动脉（LAD）诱导冠状动脉闭塞（心肌梗死）⁶

1. 将出生1天的新生幼鼠与母鼠分离，将其放入一个清洁的笼子中，并加入一些原有的筑巢材料。
2. 将笼子的一半置于设定为中等温度的加热垫上。幼鼠应留在笼子未加热的一侧，仅在手术后才将其移至加热侧。
3. 在手术显微镜下建立无菌手术区域。准备已灭菌的手术器械（表1）。
4. 通过低温麻醉幼鼠：用纱布包裹幼鼠以避免皮肤直接接触冰块，然后将其埋入冰床中约3–4分钟。定期通过脚趾夹捏测试小鼠的低温麻醉状态。新生幼鼠对低温耐受性良好，但长时间暴露于低温可能导致冻伤及后续死亡。
5. 麻醉成功后，将小鼠仰卧位放置于手术区域，用胶带固定四肢。使用消毒液对小鼠手术区域进行消毒。
6. 定位胸部下部区域，使用小型解剖剪在皮肤上做横向切口。为扩大肋骨的手术视野，用敷料镊轻轻提起皮肤，并用闭合的小剪刀轻压肋间肌，以分离皮肤与肌肉。
7. 定位第四肋间间隙（图1

结果

通常最具挑战性的两个步骤是将心脏从胸腔中引出以及结扎左前降支冠状动脉（LAD）。为解决这两个步骤中的问题，可调整在第四肋间肌之间进行初次穿刺的位置；如果穿刺和钝性分离的位置距离胸骨过近，心脏可能无法从胸腔中顺利引出（图1A）。

此外，可能需要增加对左侧腹部的压力以促进此过程（图1B）。当将心脏放置在肋间肌上时，也可能出现并发症。我们发现，当钝性分离的范围保持在最小程度并主要沿水平方向进行时，心脏可保持在体腔外而不回缩。这种操作方向还有利于清晰显露和接近前降支冠状动脉（图1C）。

在将缝合针置于LAD后方时，建议深入左心室前壁进行穿刺，因为浅表结扎在最终缝合位置调整时余地较小（图1

讨论

心肌细胞与非心肌细胞群体之间的细胞间相互作用是决定心脏在损伤后发生纤维化还是修复的关键因素。研究发现，多种细胞类型，包括神经¹⁴、心外膜细胞²⁴、腹膜巨噬细胞²⁵、小动脉^12,13以及淋巴管内皮细胞²⁶，均在介导心脏修复过程中发挥重要作用。通过在小鼠中应用Cre-lox和CRISPR-Cas9技术，可在发育、疾病及再生过程中对这些细胞谱系及其他感兴趣的细胞进行遗传谱系追踪。当该技术与器官透明化和先进显微成像方法相结合时，可准确评估非心肌细胞群体的贡献，从而为揭示损伤后心肌再生的细胞与分子靶点提供可能。

该方案的效率取决于在冠状动脉结扎手术期间对左前降支（LAD）结扎的一致性和可重复性。新生小鼠对长时间低温暴露非常敏感；因此，手术不仅需要精确操作，还必须在数分钟内完成。从开始到结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-硫代甘油
6-0 Prolene 缝线	Ethicon	8889H	聚丙烯缝线
丙烯酰胺
硼酸
弯头镊子	Excelta	16-050-146	半弯带齿，4 英寸
敷料镊	Fisherbrand	13-812-39	解剖用，4.5 英寸
玻璃小瓶	Fisherbrand	03-339-26A	12 × 35 mm 带盖小瓶
Histodenz	Sigma-Aldrich		密度梯度介质
虹膜剪	Fine Science Tools	15000-03	2 mm 刃口
大型解剖剪	Fisherbrand	08-951-20	直头，6 英寸
持针器	Fisherbrand	08-966	Mayo-Hegar 型，6 英寸
多聚甲醛
磷酸盐缓冲液
尖头镊	Sigma-Aldrich	Z168777	细尖直头，4.25 英寸
小型解剖剪	Walter Stern Inc	25870-002	30 mm 刃口
叠氮化钠
十二烷基硫酸钠 (SDS)
组织镊	Excelta	16050133	中型组织镊，1×2 齿
VA-044	Wako Chemicals		水溶性偶氮引发剂