用于喉气管狭窄小鼠的生物相容性载药气管支架设计

摘要

喉气管狭窄由病理性瘢痕沉积引起，导致气管气道严重狭窄，目前缺乏有效的药物治疗方法。利用PLLA-PCL（70%左旋聚乳酸和30%聚己内酯）支架作为局部药物递送系统，可研究旨在减少气管内瘢痕增生的潜在疗法。

摘要

喉气管狭窄（LTS）是一种声门下区和气管的病理性狭窄，可导致胸外气道阻塞及明显的呼吸困难。LTS 通常由气管内异物引起的黏膜损伤所致，进而造成组织损害和异常的局部炎症反应，最终导致病理性瘢痕组织沉积。由于缺乏有效的药物治疗方法，LTS 的治疗主要依赖手术干预。本方法旨在构建一种可微型化并植入LTS小鼠体内的生物相容性支架。我们证实，由70%左旋聚乳酸（PLLA）和30%聚己内酯（PCL）组成的PLLA-PCL材料具有理想的生物力学强度，具备良好的生物相容性，适用于体内植入支架，并能够实现药物缓释。该方法提供了一种药物递送系统，可用于测试多种免疫调节剂在局部抑制炎症和减轻气道纤维化方面的效果。支架的制备耗时28−30小时，且易于重复生产，适合大规模动物实验。在本研究中，我们将雷帕霉素药物包载于支架中，以评估其在减少纤维化和胶原沉积方面的有效性。结果表明，PLLA-PCL支架可稳定释放雷帕霉素，在生理条件下具有良好的机械稳定性，且生物相容性优异，几乎不引发气管内的炎症反应。此外，负载雷帕霉素的PLLA-PCL支架在体内显著减少了气管瘢痕的形成。

引言

喉气管狭窄（LTS）是一种以气管病理性狭窄为特征的疾病，最常见原因是医源性插管后损伤。细菌定植、对气管造口管或气管内管的异物反应以及患者特异性因素共同导致异常的炎症反应。这种不良适应性免疫反应促使胶原蛋白在气管内沉积，造成管腔狭窄，进而引发狭窄^1,2。目前该疾病的治疗主要依赖手术，因此研究人员已开始探索针对导致胶原过度沉积的异常炎症和促纤维化通路的非手术治疗方法。雷帕霉素可抑制mTOR信号复合物，已被证实具有免疫抑制作用以及显著的抗成纤维细胞效应。然而，当雷帕霉素通过全身给药时，常见的副作用（如高脂血症、贫血、血小板减少症）可能较为明显³。本研究方法的目的是开发一种适用于气道局部给药的载体，以减轻这些全身性不良反应。我们的评估重点在于研究该药物递送系统对局部免疫反应的影响，以及其抑制成纤维细胞功能和改变局部免疫微环境的能力。疾病特异性结局包括在体实验中对纤维化标志物的评估。

可生物降解的药物洗脱支架已在多种器官系统的疾病动物模型中得到应用，包括气道⁴。在治疗气道狭窄或塌陷方面，既往研究曾使用药物涂层硅胶支架和镍基支架⁵。本方法选择PLLA-PCL结构，因其在生理条件下持续3周的药物释放特性及良好的机械强度，这已在先前发....

方案

注意：此处描述的所有方法均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会（MO12M354）批准。

1. 在 PLLA-PCL 中制备雷帕霉素

1. 准备两个（带盖）玻璃小瓶，分别装有70:30 PLLA-PCL聚合物溶液（特性粘度1.3−1.8 DL/G；材料表），其中一个玻璃小瓶中含有1.0%雷帕霉素，另一个不含雷帕霉素。
   1. 通过将6 mg雷帕霉素加入装有600 mg 70:30 PLLA-PCL的玻璃小瓶中，制备含1.0%雷帕霉素的聚合物溶液。
   2. 对于不含雷帕霉素的聚合物溶液（对照组），仅向玻璃小瓶中加入600 mg 70:30 PLLA-PCL。
2. 在通风橱内，向每个玻璃小瓶中加入6 mL二氯甲烷。
   警告：二氯甲烷具有腐蚀性，应仅使用玻璃移液管。需采取适当的安全防护措施，包括佩戴护目镜和手套。
3. 向每个玻璃小瓶中加入120 µL甘油（形成2%甘油溶液）。
   注：添加甘油可提高支架结构的柔韧性并降低其刚度。
4. 盖上玻璃小瓶盖子，使含或不含雷帕霉素的70:30 PLLA-PCL聚合物溶液在6−12 h内充分溶解并均质化。
   注：也可将玻璃小瓶置于旋转摇床上，以加快溶解过程。

2. 雷帕霉素释放测试

结果

本研究中使用的载有雷帕霉素的可生物降解PLLA-PCL支架在生理条件下能够以稳定且可预测的方式释放雷帕霉素（图1）。图2显示了围绕22 G套管针成型的PLLA-PCL支架，用于小鼠LTS模型。为了确定雷帕霉素在气管内释放对减轻纤维化是否有效，可通过基因表达分析、流式细胞术、免疫荧光和ELISA检测纤维化相关基因表达的变化以及急性炎症标志物。已证实采用上述方法可成功将微型支架植入小鼠气管。该方法的示意图见图3。图4显示了微型生物相容性支架原位置于气管内的状态，支架上的黑色标记通过半透明的小鼠气管清晰可见。在初步实验中，使用0.8 mm的唾液腺内窥镜确认支架在气管内的位置具有帮助作用。21天后，为确认经口植入的支架有效且未发生移位，重新打开颈部切口以确定支架的位置。如图4B所示，支架的黑色染料标记表明其在气管内保.......

讨论

成功构建和在体内使用载药支架最关键的步骤包括：1）确定实现理想药物释放速率所需的最优PLLA-PCL比例；2）确定应释放药物的适当浓度；3）将支架在血管导管周围塑形以用于体内实验；4）在诱导喉气管狭窄（LTS）后，经口将支架递送至小鼠体内，同时避免造成致命性气道阻塞。

尽管已有多种在气道疾病动物模型中利用支架进行药物递送的方法，但开发一种能够在患病小鼠模型中实现药物递送的生物相容性支架尚属首次。在建立该药物递送方法的过程中，对原有方法进行了多项改进。确定合适的PLLA-PCL配比至关重要，以确保所制备的支架具有足够的机械刚性，能够顺利置入气管，并在生理分泌物存在的情况下仍能稳定留置于气管内。最终选择70:30的PLLA-PCL配比用于支架制备，并采用血管导管作为模具，因为该配比的支架能够以可预测的方式稳定释放雷帕霉素，可在小鼠模型中安全、可靠地置入，且在生理条件下不会发生降解。该方法中一个困难且可能依赖于生产厂家的步骤是围绕血管导管进行支架成型。最初在构建体内支架时，将22 G血管导管插入玻璃移液管的尖端，然后将聚合物溶液注入血管导管与玻璃移液管之间的空隙，从而形成该间隙的铸型。然.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 支架制备
22 号套管针	Jelco	4050
二氯甲烷	Sigma Aldrich	270997-100ML
甘油	Fisher Scientific	56-81-5	亦可从其他供应商处获得。
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
雷帕霉素	LC Laboratories	R-5000
2. 动物手术
金属丝刷	Mill-Rose Company	320101
3. 免疫组织化学染色
抗原修复缓冲液	Abcam	ab93678	亦可从其他供应商处获得；需酸性 pH 条件
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	亦可从其他供应商处获得。
FBS（胎牛血清）	MilliporeSigma	F4135-500ML
山羊抗兔-488 抗体	Lif technology	a11008
山羊抗大鼠-633 抗体	Lif technology	a21094
亲水载玻片	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	亦可从其他供应商处获得。
兔抗 CD3 抗体	Abcam	ab5690
大鼠抗 F4/80 抗体	Biolengend	123101
蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜	Zeiss
4. 定量 PCR
0.5 mm 玻璃珠	OMNI International	19-645
珠磨匀浆器	OMNI International
基因特异性正向/反向引物	基因组资源核心实验室
Nanodrop 2000 分光光度计	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy 小量试剂盒	Qiagen	80404
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Life Technologies