膜成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）是一种培养成熟人脂肪细胞的新方法。本文详细介绍了如何从人脂肪组织中分离脂肪细胞，以及如何建立MAAC培养体系。
本文内容
摘要
摘要
白色脂肪组织（WAT）功能失调在胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）的发生发展中起核心作用。为了开发针对T2D的新疗法，需要建立更具生理相关性的体外脂肪细胞模型。本研究介绍了一种分离和培养成熟人脂肪细胞的新技术，称为MAAC（膜状成熟脂肪细胞聚集体培养）。与其他体外脂肪细胞模型相比，MAAC的脂肪生成相关基因表达谱最接近新分离的成熟脂肪细胞。利用MAAC技术，可从瘦型和肥胖患者、不同脂肪组织库中培养脂肪细胞，还可实现与不同类型细胞的共培养，并且重要的是，脂肪细胞可在培养体系中维持长达2周。此外，可在MAAC上开展多种功能性实验，包括葡萄糖摄取、脂质生成和脂解作用。MAAC对多种药理学激动剂具有显著响应，还可用于研究脂肪细胞的表型变化，包括白色脂肪细胞向类棕色脂肪细胞的转分化过程。
引言
全球肥胖症及其相关共病的增加迫切需要开发新的治疗方法。白色脂肪组织（WAT）是全身代谢和能量稳态的重要调节者，在胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）的发生中起核心作用1,2。在长期摄入过多热量的情况下，脂肪细胞会增大以容纳过剩的能量。然而，脂肪细胞的脂质储存能力可能被超过，导致循环中游离脂肪酸水平升高，并增加外周非脂肪组织中的脂质沉积，从而引发脂毒性3,4。
缺乏具有高转化相关性的脂肪细胞体外模型，是开发肥胖症和2型糖尿病（T2D）新疗法面临的关键挑战。离体组织外植模型（ex vivo explant model）通过培养小块脂肪组织实现，但该模型会因缺氧和炎症引发脂肪生成相关基因表达的快速改变5,6。顶壁培养（ceiling cultures, CCs）中，成熟脂肪细胞漂浮并附着于充满培养基的培养瓶顶部，但会迅速去分化为类似成纤维细胞、不含脂质的细胞7,8,9,10。目前最常用的模型是将已定向分化的前体细胞在体外诱导分化为脂肪细胞，然而这些分化后的细胞在形态上与体内成熟的脂肪细胞存在明显差异，表现为体积显著较小且缺乏单房性脂滴。该模型的其他局限性还包括需要使用非生理性的化学诱导剂组合来驱动分化，以及分化效率存在变异性，后者可受多种因素影响11,12,13,14。
我们近期开发了膜式成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）技术，该方法可用于长期培养 freshly isolated 的成熟脂肪细胞，其中脂肪细胞在可渗透膜下进行培养10。对RNA测序数据的无偏分析显示，与脂肪组织外植体和体外分化的脂肪细胞相比，MAAC中的脂肪细胞最接近于 freshly isolated 的成熟脂肪细胞。MAAC可用于培养来源于皮下和内脏脂肪组织的成熟脂肪细胞，也可用于培养来自肥胖和瘦削个体的脂肪细胞。该方法能够研究脂肪细胞的长期表型变化，并支持脂肪细胞与其他细胞类型的共培养。本文中，我们提供了从人脂肪组织中分离成熟脂肪细胞以及建立MAAC系统的详细实验方案。
方案
采集自瑞典哥德堡市萨尔格伦斯卡大学医院接受择期手术的女性患者的腹部脂肪组织匿名样本。所有研究对象在签署书面知情同意书前，均接受了书面和口头的信息告知。本研究已获得瑞典哥德堡地区伦理审查委员会的批准。
注意：方法的概述见图1。
1. 缓冲液、组织培养基和培养板的制备
- 配制5倍浓度的Krebs Ringer（KR）储备液：将35.1 g NaCl、1.75 g KCl、0.82 g KH2PO4和1.48 g MgSO4·7H2O溶解于900 mL水中，加入1.84 g CaCl2·2H2O，加水定容至1 L。用0.22 µm滤膜无菌过滤，4 °C保存。
- 取5倍浓度KR储备液，配制1 L含1倍浓度KR、25 mM HEPES、2 mM葡萄糖和2%牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液（以下简称洗涤缓冲液）。调节pH至7.4。
- 配制500 mL胶原酶消化缓冲液，包含1倍浓度HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA和450 mL水（以下简称消化缓冲液）。
注意：胶原酶应在第2.2步称量脂肪组织后，再加入消化缓冲液中。 - 将Medium 199的pH调节至7.4。
- 将上述两种缓冲液和Medium 199均用0.22 µm滤膜瓶过滤无菌化，并预热至37 °C。
注意：为节省时间，可在处理脂肪组织前预先配制好细胞培养基并加入培养板中。对于24孔板格式（图1A），每孔加入0.5−1 mL的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12营养混合物（DMEM/F12）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（penn/strep）和20 nM胰岛素。此时也可根据实验设计，在培养基中加入小分子化合物或其他稳定的药理学试剂。将培养板置于细胞培养孵箱中（37 °C，5% CO2）。
2. 人体皮下脂肪组织的解剖
注意：在整个分离过程中，应在生物安全柜内操作，并使用无菌技术，且 exclusively 使用经高压灭菌和无菌的设备。
- 将人脂肪组织置于直径15 cm的培养皿中，并加入少量199培养基，以在解剖过程中保持组织湿润。
- 取约高尔夫球大小的脂肪组织块进行操作，用镊子夹住较大的纤维化血管，用闭合的剪刀背面轻轻刮擦脂肪组织，从而分离脂肪细胞。弃去大块的纤维化组织。称量修整后的脂肪组织重量。
3. 胶原酶处理
- 将胶原酶以 1 mg/mL 的浓度加入消化缓冲液中（见步骤 1.3）。使用 0.22 µm 无菌滤器对溶液进行无菌过滤。
注意：建议每克脂肪使用 3 mL 消化缓冲液（例如，对于 100 g 脂肪，需准备含 300 mg II 型胶原酶的 300 mL 消化缓冲液）。
注意：II 型胶原酶对眼睛和皮肤有害，可能引起呼吸道刺激。操作胶原酶时应佩戴手套和眼部防护装备，并在通风橱中进行操作。 - 将约 10 g 脂肪组织转移至 15 cm 培养皿中，使用弯头剪刀小心剪碎脂肪，直至形成均匀细腻的混合物，且无大块脂肪组织残留。重复此过程，直至所有脂肪组织均被处理完毕。
注意：每轮剪碎过程约需 2 分钟，脂肪组织应被剪至足够小，以便可用宽口吸头移液。此步骤对获得高质量脂肪细胞至关重要。若组织块过大，则需延长消化时间，从而影响细胞活力。 - 用勺子将剪碎的脂肪转移至 50 mL 锥形管中。每管加入 10 mL 剪碎的组织和 30 mL 消化缓冲液。若剪碎脂肪量少于 10 mL，应按比例调整相应体积。
- 将组织在 37 °C 摇床培养箱中以 150 rpm 持续振荡消化 30−45 分钟。30 分钟后，每隔 5 分钟检查一次消化情况，避免过度消化。
注意：当脂肪组织消化液呈均一状态、无大块组织残留且呈现杏色时，表明消化完成。
4. 细胞悬液的过滤及成熟脂肪细胞的纯化
- 将一个漏斗置于1 L无菌烧瓶上方，并在漏斗内放置一个无菌的250 µm网孔滤膜。将消化后的脂肪溶液倒入滤膜中，以去除未消化的组织。
- 当所有脂肪细胞悬液均通过滤膜后，轻轻挤压滤膜以提高脂肪细胞的回收率。向滤膜中加入约50−100 mL洗涤缓冲液进行冲洗，然后再次挤压滤膜。
- 将从烧瓶中分离得到的脂肪细胞悬液倒入分液漏斗中，并加入洗涤缓冲液直至漏斗几乎完全充满。轻轻倒置漏斗数次，使脂肪细胞悬液与缓冲液充分混匀。
- 静置悬液2−3分钟，直至出现明显的两层分离（图1B），上层为含有成熟脂肪细胞和游离脂质的黄色层，下层为含有缓冲液及脂肪基质血管组分（SVF）的层。
- 打开分液漏斗的活塞，缓慢将下层液体释放至无菌烧瓶中（SVF中的细胞可在200 × g 离心7分钟后沉淀并收集）。保留分液漏斗中含成熟脂肪细胞的上层液体。
- 重复步骤4.3−4.5的洗涤过程三次，以充分洗涤成熟脂肪细胞并彻底去除所有胶原酶。
5. 成熟脂肪细胞的收集
- 打开喷嘴，将纯化后的成熟脂肪细胞悬液收集到50 mL离心管中。
- 以50 × g 离心3分钟，轻轻沉淀成熟脂肪细胞。
- 使用18 G针头和注射器移除脂肪细胞悬液下方残留的洗涤缓冲液。
- 用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞上层的游离脂质层（即在分离过程中部分脂肪细胞破裂释放出的少量油脂）。
注意：为降低步骤6.5中脂肪细胞从膜上滴落的风险，当将成熟脂肪细胞接种到膜上时，必须彻底去除脂质层及所有洗涤缓冲液。因此，建议将脂肪细胞分3管收集。最后收集的样品通常含有较多残留脂质，质量相对较低；但通过小心地移液操作，这些样品仍可使用。
6. 成熟脂肪细胞的接种
- 打开含有通透性膜插件的包装（材料表），取出膜组件。将其倒置并放置在无菌表面上，使膜面朝上。
- 用移液器将30 µL密集的成熟脂肪细胞滴加到每张膜上（图1C）。避免枪头接触膜表面。接种细胞时使用宽口移液器吸头，或用剪刀剪去吸头尖端一小段以增大口径。
- 在整个接种过程中，轻柔地反复倒置装有密集脂肪细胞的50 mL离心管，以确保不同大小的脂肪细胞均匀分布。
- 将预装培养基的多孔板从培养箱中取出，移入生物安全柜中，并打开盖子。拿起已接种脂肪细胞的膜插件，从底部捏住，以便在步骤6.5中进行倒置操作。
- 连贯地将带有脂肪细胞的膜插件整体翻转，使接种的脂肪细胞朝下（图1D），然后将插有膜的板缓慢放入含有培养基的孔中（图1E）。
- 盖上板盖，小心地将板转移至组织培养箱中。避免快速移动板，因为脂肪细胞在初期容易脱落。
注意：细胞需要数天时间才能更牢固地附着于膜上。
7. 脂肪细胞的维持及用于分析的收获
- 至少每7天更换一次培养基。通过每个膜插件上的切口孔进行培养基的移除和添加。移除培养基时，可使用注射器和针头、抽吸管或带有P200吸头的移液器。添加培养基时，使用移液器沿孔壁缓慢加入新鲜培养基，以避免扰动脂肪细胞。
注意：脂肪细胞已培养2周，期间在第7天更换一次培养基。然而，不同来源的脂肪组织或不同的实验需求可能需要更频繁地更换培养基。 - 如需收获RNA，按步骤7.1所述移除培养基，然后直接向孔中加入500 µL裂解缓冲液（材料表），以裂解细胞。如需固定细胞用于成像，直接向孔中加入甲醛，使其终浓度为1%。
注意：处理后的细胞可在4 °C下保存。
结果
将成熟脂肪细胞以MAAC形式进行培养，可维持其功能和表型，并可用于研究脂肪细胞对各种药物处理的反应。从皮下脂肪组织分离的MAAC在培养1周后仍保持成熟脂肪细胞特有的单房性脂滴结构（图2A）。在为期1周的培养过程中，分别使用PPARγ激动剂罗格列酮（Rosi）和吡格列酮（Pio），或糖皮质激素受体（GR）激动剂地塞米松（Dex）处理MAAC，以评估不同核激素受体（NHR）激动剂是否可在MAAC中诱导其下游靶基因的预期变化。Rosi和Pio分别使PPARγ响应基因FABP4和LPL的表达水平上调4倍和2−3倍，而地塞米松则无显著影响（图2B）。类似地，地塞米松使GR靶基因APOD和FKBP5的表达分别显著上调13倍和55倍，而PPARγ激动剂则无明显作用。我们先前已证实， freshly isolated human mature white adipocytes 在MAAC培养体系中经Rosi处理后可转分化为类棕色脂肪样表型10。经Rosi或Pio处理7天后，棕色脂肪特异性基因UCP1的表达被强烈诱导，上调达44–65倍，同时棕色脂肪标志物PDK4的表达也增加12–18倍（图2C）。
图1：MAAC装置的示意图。（A）培养基的制备。（B）成熟脂肪细胞的分离与填充。（C）将成熟脂肪细胞接种到膜上。（D）在保持脂肪细胞附着的情况下翻转膜。（E）将膜放入培养基中并更换培养基。该图经 Harms 等人10 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：MAAC在培养一周后仍保持单房室形态，并对多种药理学激动剂产生响应。（A）培养一周后MAAC的代表性4倍和10倍明场图像。平均直径为100 µm、具有大单房室脂滴的脂肪细胞清晰可辨。（B）MAAC在经溶剂对照（Vehc）、罗格列酮（Rosi）、吡格列酮（Pio）或地塞米松（Dex）处理7天后，PPARγ靶基因和糖皮质激素受体（GR）靶基因的mRNA水平。Rosi、Pio和Dex的终浓度均为10 µM。（C）MAAC在经溶剂对照（Vehc）、罗格列酮（Rosi）、吡格列酮（Pio）或地塞米松（Dex）处理7天后，富集于棕色脂肪组织的基因mRNA水平。Rosi、Pio和Dex的终浓度均为10 µM。所有基因表达数据均以TATA结合蛋白（TBP）作为内参进行标准化。统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验。（均值 ± 标准差，n = 3，*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
膜培养成熟脂肪细胞聚集体（MAAC）是一种用于长期培养 freshly isolated 成熟脂肪细胞的新方法。在建立 MAAC 的过程中，实验方案中有几个关键步骤会显著影响成熟脂肪细胞的得率、质量和存活率。在第 3.2 步中应充分重视脂肪组织的剪碎操作，因为该步骤直接影响脂肪细胞暴露于胶原酶的时间。如果脂肪组织块过大，则需要延长消化时间，从而对细胞存活率产生不利影响；相反，如果使用剪刀将组织处理得过于细碎，也可能影响细胞存活率。为了成功进行成熟脂肪细胞的 MAAC 培养，应特别关注以下步骤：为了使脂肪细胞成功接种到膜上，第 5.3 和 5.4 步中必须彻底去除成熟脂肪细胞中的游离脂质和残留洗涤缓冲液。残留的脂质或洗涤缓冲液会降低脂肪细胞的表面张力，增加膜翻转时脂肪细胞从膜上滴落的风险。当脂肪细胞接种并处于培养基中时，细胞主要依靠浮力与膜保持接触，因此在更换培养基时建议采用缓慢而轻柔的操作手法，以避免细胞丢失。更换培养基时，应如第 7.1 步所述从孔底部移除旧培养基，并通过缓慢沿孔壁加样的方式加入新培养基。最后，一个节省时间的建议是在开始脂肪细胞分离前预先准备好含培养基和处理试剂的培养板。特别是对于复杂的实验设计，提前准备培养板可节省大量时间，并确保脂肪细胞在分离后能立即被置于含有相应处理条件的培养基中。
与使用前脂肪细胞分化相比，采用MAAC的一个优势在于所用的MAAC培养基成分非常简单，无需添加非生理性的激素混合物。在此，我们使用富含葡萄糖的培养基（DMEM/F12）、10% FBS、1% 青霉素/链霉素和20 nM胰岛素培养MAAC。重要的是，我们发现胰岛素对于罗格列酮/吡格列酮诱导的UCP110表达是绝对必需的。然而，维持细胞的脂肪生成表型并不需要胰岛素。因此，是否添加胰岛素应根据具体的实验问题来决定。
上述方案已针对人脂肪细胞的分离与培养进行了优化。然而，小鼠及其他生物的脂肪细胞也可作为MAAC进行培养。若需将小鼠脂肪细胞作为MAAC培养，则需额外注意若干事项与预防措施。我们发现，小鼠的成熟脂肪细胞比人类的更为脆弱。因此，应将消化时间缩短至最低限度，以提高细胞活力。我们还发现，来自年轻小鼠（8周龄及以下）的脂肪细胞可获得最稳定且可重复性最佳的结果。最后，小鼠MAAC最多可培养一周时间，但由于其脂肪细胞表型的稳定性似乎低于人类（人类MAAC至少可培养两周），我们建议根据实验需求，将小鼠MAAC的培养时间控制在满足实验目的所需的最短时间。
由于MAAC模型基于使用可渗透膜，该技术的一个优势是能够将成熟脂肪细胞与其他细胞类型进行共培养。我们此前已通过使用MAAC证明了成熟脂肪细胞与巨噬细胞之间可通过该系统进行相互通讯10。这为进一步探索肥胖、胰岛素抵抗与免疫反应之间的关联提供了可能15,16,17。未来的实验可引入其他细胞类型，如肝细胞、前脂肪细胞、内皮细胞或胰腺细胞，以进一步提升MAAC模型的复杂性和转化应用价值，并研究多种细胞类型之间的相互作用。
尽管MAAC在维持脂肪细胞功能和特性方面已显示出优于其他体外脂肪细胞模型的优势，但它也存在一些需要考虑的局限性。与使用前体细胞分化而来的脂肪细胞相比，MAAC模型更为繁琐且耗时较长。带有膜的培养板也比常规细胞培养板更昂贵。重要的是，成熟脂肪细胞每次接种时都需要新鲜分离，无法像前体细胞那样进行扩增或冻存建立细胞库。因此，该方法需要能够获取新鲜的白色脂肪组织样本，同时也因供体之间的个体差异而增加了实验的复杂性。
本文介绍了一种分离人成熟脂肪细胞并建立脂肪细胞球体培养体系（MAAC）的详细实验方案。我们证明了以MAAC形式培养的脂肪细胞在两周内仍保持活性，其脂肪细胞特异性基因表达特征得以维持，并且能够对多种药理学激动剂产生响应。利用MAAC体系可研究脂肪细胞与其他细胞类型之间的相互作用，并评估成熟脂肪细胞在不同刺激条件下发生的长期表型变化。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Xiao-Rong Peng 和 Stefan Hallen 提供资源并优化脂肪细胞的分离，感谢 Martin Uhrbom 提供技术支持，感谢 Daniel Olausson 和 Malin Lönn 协调并提供人脂肪组织。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 经高压灭菌的剪刀 | |||
| 经高压灭菌的勺子 | |||
| 经高压灭菌的镊子 | |||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | 裂解缓冲液 |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| 50 mL 锥形管 | |||
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10270-106 | |
| 滤瓶，0.2 µm 孔径，75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| 滤瓶，0.2 µm 孔径，75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES 缓冲液（1 M） | Gibco | 15630-056 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| 胰岛素（Actrapid Penfill） | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| 筛网滤器（250 µm） | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 针头，18 G，1.20 mm × 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 15140 | |
| 培养皿，150 mm × 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR 主混合液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex 实时荧光定量 PCR 仪 | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini 试剂盒 | QIAGEN | 74106 | |
| 分液漏斗 | VWR | 527-0008 | 用于大规模制备 |
| 分液漏斗 | VWR | 527-0005 | 用于小规模制备 |
| 摇床培养箱（37 °C） | |||
| 注射器，5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 支 |
| 细胞培养箱（37 °C，5% CO2） | |||
| Transwell 小室，24 孔（6.5 mm） | Costar | 3397 | 可渗透膜插件 |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen | 10296010 | 裂解缓冲液 |
| II 型胶原酶 | Worthington | LS004177 |
参考文献
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重印与许可
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