我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。
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摘要
摘要
细胞外基质（ECM）在调控组织稳态中发挥核心作用，通过与细胞相互对话，调节细胞功能的多个方面。在肥胖状态下，ECM在脂肪组织功能中具有尤为重要的作用，脂肪组织中ECM的沉积和成分改变与小鼠和人类的代谢性疾病相关。目前可用于解析ECM和细胞在决定整体组织表型中各自作用的可操作体外模型十分有限。本文介绍一种新型的人源ECM-脂肪细胞三维体外培养模型，可用于研究ECM和脂肪细胞在调控脂肪组织代谢表型中的特定作用。通过去细胞化人脂肪组织以分离ECM，随后将前脂肪细胞重新接种至ECM中，并在基质内分化为成熟脂肪细胞。该方法构建的ECM-脂肪细胞复合物具有代谢活性，并保留了其来源组织及供体个体的特征。我们已利用该系统证实了人脂肪组织中存在疾病特异性的ECM-脂肪细胞相互作用。该培养模型为解析ECM与脂肪细胞在整体脂肪组织代谢表型形成中的作用提供了工具，同时可用于研究ECM在调控脂肪组织稳态中的功能。
引言
细胞外基质（ECM）不仅为组织提供机械支架，还与 residing 于其中的细胞进行复杂的相互作用，调控维持组织稳态所必需的多种过程，包括细胞增殖、分化、信号传导和代谢1。尽管健康的细胞外基质在维持正常组织功能中起着关键作用，但功能异常的细胞外基质已被证实与多种疾病相关2。
脂肪组织在代谢性疾病的发病机制中起着重要作用。肥胖与脂肪细胞过度肥大、细胞缺氧、脂肪细胞代谢功能障碍以及脂肪组织内质网应激、氧化应激和炎症密切相关。尽管这些复杂的生物学过程尚未被充分阐明，但它们共同导致脂肪组织营养缓冲能力受损，进而引起营养物质从脂肪组织溢出，造成多种组织的毒性损伤以及全身性代谢紊乱3,4,5。目前对脂肪组织功能障碍所涉及的事件顺序和具体机制仍了解有限，但已有研究提示脂肪组织细胞外基质（ECM）的改变在其中发挥了作用。在人类和小鼠的肥胖状态下，脂肪组织中的ECM成分均发生改变，表现为ECM蛋白沉积增加，同时在生化性质和结构上出现定性差异，这些ECM的改变与人类代谢性疾病（包括2型糖尿病和高脂血症）相关6,7....
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方案
脂肪组织取自经机构审查委员会批准接受择期减重手术的人类受试者。
1. 前脂肪细胞的分离与培养试剂准备
- 在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制2%牛血清白蛋白（BSA）。过滤除菌后，于4 °C避光保存。 4 °C.
- 制备II型胶原酶：将2 mg/mL的II型胶原酶溶于含2% BSA的1×PBS中。使用前立即配制。
- 制备红细胞（RBC）裂解液：1.5 M NH₄Cl4Cl, 100 mM NaHCO₃3，去离子水（DI/H2O）。储存于 4 °C. 用去离子水将10倍浓缩的RBC裂解液稀释成1倍工作液2O 立即使用前
- 配制生长培养基：在杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12）中加入15%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌素溶液（ABAM）。过滤除菌后，于4℃保存 4 °C.
- 制备前脂肪细胞冻存液：含10%二甲基亚砜、15%胎牛血清的DMEM/F12培养基。过滤除菌，保存于 4 °C.
- 制备分化培养基：10 mg/L 转铁蛋白， 33 µM 生物素, 0.5 µM 人胰岛素溶液 17 µM D-泛酸半钙盐，100 nM 地塞米松，2 nM 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐（T3） 1 µM ciglitazone, 540 µM 3-异丁基-1....
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结果
制备脂肪组织细胞外基质（ECM）、接种前脂肪细胞并在体外分化为成熟脂肪细胞，会导致组织发生明确的顺序性形态学变化，从而可在整个实验流程中通过肉眼评估各阶段进展（图1）。用于接种ECM的前脂肪细胞通过胶原酶消化从独立的内脏脂肪组织（VAT）样本中分离获得（图2）。在处理过程的各个阶段，对ECM-脂肪细胞构建物进行扫描电子显微镜观察，可显示ECM的去细胞化以及重新接种和分化后含脂滴脂肪细胞的重建（图3）。对去细胞化的ECM进行I型胶原特异性免疫组织化学染色，显示其胶原微结构得以保留；而对活体及固定/切片的三维ECM-脂肪细胞构建物进行油红O染色，则可显示含脂滴的脂肪细胞（图4A）。在ECM中分化的脂肪细胞进行qrtPCR分析，显示相对于在ECM中培养但未分化的前脂肪细胞，脂肪生成相关基因显著上调（
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讨论
细胞外基质-脂肪细胞共培养模型为解析细胞外基质（ECM）与细胞在决定最终组织表型中的各自作用提供了有价值的工具。ECM分离方案具有较好的可重复性，但在去细胞化过程中可能观察到一定的变异性。第3天的脱脂步骤是该方案中的关键环节。在过夜提取结束时，脱脂是否成功可通过极性溶剂溶液变为黄色来判断，同时基质应从完整脂肪组织特有的黄橙色转变为半透明或白色（图1）。如果未出现上述颜色变化，则表明脱脂可能尚未完成。不同供体样本间脱脂效率存在常见差异，但迄今为止，我们未观察到脱脂效率与供体的糖尿病状态、年龄、体重指数（BMI）或其他临床变量之间存在相关性。过大的样本（大于20 g）将无法实现有效脱脂；处理小于<20 g的样本可避免此问题。如果第3天后样本仍未完全脱脂，可用无菌剪刀将样本一分为二，然后转移至新鲜的15–20 mL极性溶剂提取液中，并置于旋转摇床上处理3–5小时。部分样本在重复极性溶剂提取步骤后仍可能无法完全去细胞化。若样本大部分区域已完成去细胞化，则可在实验使用前将残留脂质部分切除。
如果在整个操作过程中未能严格保持无.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Danielle Berger、Marilyn Woodruff、Simone Correa 和 Retha Geiss 在研究协调方面提供的协助。扫描电子显微镜（SEM）由密歇根大学显微技术平台完成。 & 图像分析实验室生物医学研究核心设施。本项目获得以下资助：NIH 基金 R01DK097449（RWO）、R01DK115190（RWO, CNL）、R01DK090262（CNL）、退伍军人事务部杰出奖 I01CX001811（RWO）、密歇根糖尿病研究中心试点与可行性基金（NIH 基金 P30-DK020572）（RWO）、退伍军人事务部 VISN 10 SPARK 试点基金（RWO）。扫描电子显微镜实验由密歇根大学显微技术中心完成。 & 图像分析实验室 生物医学研究核心设施。本文的图4最初发表于Baker等人的研究中， J Clin Endo Metab 2017年；3月1日；102卷（3）：1032-1043。doi: 10.1210/jc.2016-2915，经牛津大学出版社许可转载[https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]。如需重复使用本材料，请访问 http://global.oup.com/academic/rights。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#25200056 | |
| 1.5 mL 冻存管 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#02-682-557 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 货号 89370-094 | |
| 100 µm 尼龙网滤器 | 康宁股份有限公司，美国纽约州康宁市 | Cat#352360 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号 D8375 | |
| 2 nM 3,3’三碘甲状腺原氨酸钠盐（T3） | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯市 | 货号 T6397 | |
| 24孔组织培养板 | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 货号#10861-700 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#I5879 | |
| 96孔组织培养板 | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 货号#10861-666 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液（ABAM） | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#15240062 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 B4639 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen，德国希尔登 | 货号#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 C3974 | |
| 2-[1,2-3H (N)]-脱氧-D-葡萄糖 | PerkinElmer Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Cat#NET328A250UC | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I，II-S 型 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 D4513 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 D4902 | |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#BP231 | 易燃，腐蚀性 |
| EDTA二钠 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | Cat#BP118 | |
| D-泛酸半钙盐 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#21210 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12） | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#11320033 | |
| 乙醇 | Decon Labs, Inc.，宾夕法尼亚州普鲁士王市，美国 | 货号#DSP-MD.43 | 易燃 |
| EVE细胞计数板，NanoEnTek | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | Cat#10027-446 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#10437028 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号 G5882 | 腐蚀性 |
| 六甲基二硅氮烷 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#440191 | 易燃，腐蚀性 |
| 人胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#I9278 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#A415 | 易燃 |
| 异丙肾上腺素 | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号 I5627 | 易燃 |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 P5655 | |
| 来自猪胰腺的脂肪酶，VI-S型 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 L0382 | |
| MgSO₄4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 S3014 | |
| NaHCO₃3 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#A661 | |
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Agar Scientific有限公司，英国埃塞克斯郡斯坦斯特德 | 货号 AGR1180 | |
| 油红O溶液（ORO） | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号 O1391 | |
| Oil Red-O 染色试剂盒 | 美国Master Tech科学公司，洛迪，加利福尼亚州，美国 | 货号#KTORO-G | |
| 四氧化锇 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#201030 | 腐蚀性 |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号#93482 | 腐蚀性 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#SH3025601 | |
| 来自牛胰腺的核糖核酸酶A，III-A型 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 R5125 | |
| RNAEasy 纤维组织小型试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 货号#74704 | |
| 闪烁液 | Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#SX18 | |
| 闪烁计数器 | |||
| 剪刀、镊子、无菌 | |||
| Sorensen 磷酸盐缓冲液 | Thomas Scientific, Inc.，美国新泽西州斯威兹伯勒 | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 培养瓶 | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | Cat#10062-864 | |
| TaqMan 基因表达主混合液 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#4369016 | |
| 温度控制轨道摇床 | |||
| 组织匀浆机，BeadBug 微管匀浆机 | Benchmark Scientific | 货号#D1030 | |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯 | 货号 T3309 | |
| 甘油三酯测定试剂盒 | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号#TR0100 | |
| 0.4% 台盼蓝染色液 | VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 货号 10027-446 | |
| II型胶原酶 | Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel 滤纸，201 级，150 毫米 | Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯 | 货号#WHA5201150 |
参考文献
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P.
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