脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。
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本文内容
摘要
摘要
脑脊液（CSF）是存在于脑和脊髓中的一种液体，对基础科学和临床医学均具有重要意义。脑脊液蛋白质成分的分析可为神经科学基础研究以及神经系统疾病提供关键信息。需要注意的是，脑脊液中检测到的蛋白质可能来源于鞘内合成，也可能来源于血清的渗出，因此脑脊液蛋白质分析仅能测定这两部分的总和。为了在动物模型及人体中区分蛋白质由血液渗出与鞘内产生的部分，使用常规蛋白质分析工具进行脑脊液蛋白质谱检测时，必须计算白蛋白脑脊液/血清比值（Qalbumin）——这是血脑界面（BBI）完整性的标志物，以及蛋白质指数（Qprotein/Qalbumin）——用于评估鞘内蛋白质合成水平。本实验方案详细描述了从脑脊液和血液采集到比值与指数计算的完整流程，旨在实现对神经系统疾病小鼠模型中鞘内蛋白质合成水平及血脑界面功能障碍的定量测定。
引言
脑脊液（CSF）是一种清澈无色的液体，环绕于脑和脊髓周围，在临床医学和基础科学研究中具有重要意义。脑脊液可维持中枢神经系统（CNS）的电解质环境，调节全身酸碱平衡，为神经元和胶质细胞提供营养，发挥中枢神经系统的淋巴样功能，并在中枢神经系统内运输激素、神经递质、细胞因子及其他神经肽1。因此，由于脑脊液的成分能够反映中枢神经系统的活动状态，这种液体为评估中枢神经系统的生理与病理状态提供了宝贵但间接的途径。
脑脊液已用于诊断影响中枢神经系统的疾病超过一百年，在此期间，它主要被临床医生作为一种诊断工具进行研究。然而，近年来神经生物学家认识到脑脊液在研究中枢神经系统病理生理学方面的潜力。特别是，神经科学领域已引入多种高通量蛋白质分析工具，使得能够对脑脊液的蛋白质组成进行详细研究，期望通过此类分析有助于深入了解中枢神经系统内发生的动态变化。
Luminex 和 Simoa 等多重免疫测定技术的不断发展2,3，使研究人员如今能够以极低的浓度检测数百种蛋白质。此外，这些技术还可使用微量样本，从而推动了小动物（包括小鼠）相关研究的开展；在过去，由于脑脊液样本量有限，难以对其进行详细的成分分析，而如今这一限制已得到克服。
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方案
所有动物实验均采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案。
1. 体液采集
注意：需要同时采集血清和脑脊液。每种液体的采集均需准备两份方案，分别用于存活期和剖检期。
- 采用可存活操作程序采集血清和脑脊液
注意：对于可存活体液采集，应先采集血清再采集脑脊液，因为血清采集为侵入性较小的操作。脑脊液必须在血清采集后一周内获取。- 通过眶后静脉丛采血获取血清
注意：本操作适用于小鼠的可存活采血14。所述方法适用于任何年龄、性别和品系的小鼠。根据IACUC规定，单次采血量不得超过体重的1%，因此建议仅对体重超过15 g的小鼠进行该操作。- 将装有小鼠的笼子从架子上移至合适的工作区域。打开氧气流量计，调节流速至1 L/min，准备麻醉气体设备。
- 将动物放入诱导室并紧密关闭盖子。开启异氟烷蒸发器至3.5%，持续观察动物直至其侧卧不动。
- 将动物从诱导室中取出，通过脚掌反射（即用力捏压脚垫）评估麻醉深度。在进行操作前确保麻醉充分：对用力捏压无反应表明麻醉深度足够。
- 用非优势手的拇指和食指捏住小鼠耳后松弛的皮肤以固定动物。用食指向后牵拉眼球上方皮肤，同时用拇指向后牵拉眼球下方皮肤，使眼球突出。
- 通过眶后静脉丛采血获取血清
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结果
本项代表性实验旨在比较两种具有临床相关性的多发性硬化症（MS）啮齿类动物模型中IgG的鞘内合成情况：PLP139-151诱导的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（R-EAE）和慢性进行性Theiler病毒诱导的小鼠脑脊髓炎脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）。R-EAE模型有助于研究复发-缓解型MS，而TMEV-IDD模型则模拟慢性进行性MS19。
本研究对R-EAE（n = 12）和TMEV-IDD（n = 28）模型中的鞘内IgG合成进行了定量分析。两组均在其疾病高峰期进行分析。另设一组10只小鼠进行假手术处理，作为年龄匹配的对照组（cR-EAE，n = 4；cTMEV-IDD假手术组，n = 6）。
采用市售试剂盒（材料表）提供的磁珠法检测配对的血清和脑脊液样本中的总IgG。总IgG值由IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3亚类数值相加得出。由于当时尚无白蛋白的Luminex检测方法，因此使用商业化的鼠白蛋白ELISA.......
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讨论
定量评估脑脊液（CSF）蛋白质浓度升高的方法是表征中枢神经系统（CNS）生理与病理状态的有用工具。然而，除了可靠地定量脑脊液中的蛋白质水平外，脑脊液蛋白质的检测还需要以能够区分血液来源与中枢神经系统来源蛋白组分为基础的结果表达方式。迄今为止，常用的蛋白质定量检测方法即使借助高通量工具，仍无法区分这两种蛋白质组分。因此，已有研究提出对蛋白质测量值进行特定校正，以区分在中枢神经系统内合成的蛋白质与来源于血液的蛋白质。此类校正可补偿个体间血清浓度及血脑屏障完整性的差异。总体而言，这些校正基于脑脊液/血清蛋白商（Qprotein）的计算，从而降低因个体血清蛋白浓度差异所导致的变异性。通过将Qprotein与脑脊液/血清白蛋白商（Qalbumin）相关联，可进一步减少因个体屏障功能差异引起的Qprotein变异。这两种校正的结合通常被称为蛋白指数，其计算方式为Qprotein/Qalbumin比值4,6
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢达特茅斯比较医学与研究中心（CCMR）工作人员在本研究中对实验小鼠的精心照料。本研究由博恩斯坦研究基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 胰岛素注射器 | BD | 329650 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 329622 | |
| 25 号针头 | BD | 305122 | |
| 3 mL 注射器 | BD | 309582 | |
| 30 号胰岛素针头 | BD | 305106 | |
| 吸水垫 | 任何合适的品牌 | ||
| 乙酰丙嗪（Acepromazine） | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex 手持式磁力洗涤仪 | BioRad | 171020100 | 磁铁 |
| BioPlex MAGPIX 多重检测仪 | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro 平底板 | BioRad | 171025001 | |
| 生物素化检测抗体 | 任何合适的来源 | 该抗体必须针对目标蛋白的物种。 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A4503 | |
| 盐酸丁丙诺啡（Buprenorphine hydrochloride） | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| 毛细管 | Sutter Instrument | B100-75-10 | 外径：1.0 mm，内径：0.75 mm，硼硅酸盐玻璃，10 cm；在本生灯上拉制以缩小内径。 |
| 离心管，0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| 离心管，0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| 离心管，1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| 双醋氯己定（Chlorhexidine diacetate） | Nolvasan | E004272 | |
| 一次性移液器吸头 | 任何合适的品牌 | ||
| 耳杆 | KOPF Instruments | 1921 或 1922 | |
| 乙醇 | Kopter | V1001 | |
| 冷冻机 | VWR | VWR32086A | |
| 纱布 | Medline | NON25212 | |
| 加热垫 | Sunbeam | XL 加大号 SoftTouch，4 档加热并带自动关闭功能，青绿色，12 英寸 × 24 英寸 | |
| 诱导室 | VETEQUIP | ||
| 异氟烷（Isoflurane） | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| 氯胺酮（Ketamine，KetaVed） | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex 微球（抗体偶联） | BioRad | 抗体偶联磁珠 | |
| 微孔板振荡器 | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| 微型牵开器 | Carfill Quality | ACD-010 | 钝头，1 mm |
| Microsoft Office（Excel） | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP 小鼠免疫球蛋白同种型磁珠检测试剂盒 | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | 商品化试剂盒，用于通过 Luminex 技术定量检测小鼠体液中一组免疫球蛋白同种型及亚类。 |
| 小鼠白蛋白捕获 ELISA 试剂盒 | Novus Biological | NBP2-60484 | 商品化试剂盒，用于通过 ELISA 技术定量检测小鼠体液中的白蛋白。 |
| 多通道移液器 | Eppendorf | 3125000060 | |
| 非无菌棉签 | MediChoice | WOD1002 | 需经高压灭菌以达到无菌 |
| 氧气 | AIRGAS | OX USPEA | |
| 巴斯德移液管 | Fisher | 13-678-20A | 5& 3/4" |
| PDS 缝线带一次性针头，6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 反向切割，18" |
| PE-链霉亲和素（PE-Streptavidin） | BD Biosciences | 554061 | |
| 移液器 | Eppendorf | Research seriers | |
| 聚乙烯管 | |||
| 冷冻离心机 | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| 天平 | Uline | H2716 | |
| 手术刀 | Feather | EF7281 | |
| 剃毛器 | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| 标准蛋白 | 任何合适的来源 | 最佳参考标准是目标蛋白的纯化品，且浓度已知。 | |
| 立体定位仪 | KOPF Instruments | Model 900LS | 标准配件 |
| 无菌 1× PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| 无菌生理盐水 | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9% 氯化钠注射液 USP |
| 弯头手术镊，7 号（2 把） | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14094-11 | 不锈钢，25 倍 |
| 蒸发器 + 流量计 | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| 涡旋振荡器 | Fisher | 02-215-414 | |
| 保温垫 | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| 水浴超声仪 | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| 赛拉嗪（Xylazine） | Patterson Vet Supply Inc |
参考文献
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M.
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重印与许可
