本方案采用流式细胞术定量培养的小鼠肠类器官中增殖细胞和死亡细胞的数量。该方法有助于评估药物处理对类器官增殖和存活的影响。
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本文内容
摘要
摘要
肠上皮作为一道屏障，可防止管腔内容物（如致病性微生物群和毒素）进入机体其他部分。上皮屏障功能依赖于肠上皮细胞的完整性。虽然上皮细胞的增殖能够维持连续的细胞层以形成屏障，但上皮损伤会导致屏障功能障碍。结果，管腔内容物可通过非限制性途径穿过肠屏障。肠屏障功能障碍与多种肠道疾病相关，例如炎症性肠病。分离的小鼠肠隐窝可在体外培养并维持为类似隐窝-绒毛结构，这类结构被称为肠类器官或“肠体”。肠体是研究肠上皮细胞增殖与细胞死亡的理想模型。在本方案中，我们描述了一种简单的方法，用于定量培养中肠体内的增殖细胞和死亡细胞数量。使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和碘化丙啶对肠体中的增殖细胞和死亡细胞进行标记，随后通过流式细胞术分析增殖细胞和死亡细胞的比例。该方法可用于检测药物处理对肠上皮细胞增殖和细胞存活的影响。
引言
肠道上皮细胞的一个基本功能是防止管腔内容物（如致病菌和毒素）进入机体1,2。为了实现这一功能，肠干细胞持续增殖并分化为多种上皮细胞，包括吸收细胞和分泌细胞，这些细胞通过形成紧密连接构成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要细胞增殖、细胞分化和细胞死亡之间的严格协调4,5。细胞增殖减少或细胞死亡过度均会导致上皮损伤和屏障功能受损1,6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病相关7,8。
已有研究开发出一种用于培养肠隐窝的方法。利用该技术，分离的小鼠肠隐窝可生长形成肠类器官（enteroids），其具有类似隐窝-绒毛的结构，并包含所有类型的肠上皮细胞谱系9,10。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是一种胸腺嘧啶类似物，可在细胞增殖过程中DNA复制时替代胸腺嘧啶（T）....
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方案
本方案已获得苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心（CAM-SU）动物护理与使用委员会的批准。
1. 肠道类器官的分离与培养
- 肠道隐窝的分离与肠类器官培养
- 通过吸入 CO2 处死一只 8 周龄的野生型小鼠。使用组织镊子和精细虹膜剪剪取约 8 cm 的回肠组织。
- 使用带有灌胃针头的注射器，以约 40 mL 冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗肠腔，然后用剪刀沿长轴剪开并展平回肠。
- 将回肠切成小段（0.5−1.0 cm）。将组织段放入含有 5 mL 无菌冰冻 DPBS 的 15 mL 锥形管中，在冰上振荡 5 分钟。
- 使用移液器控制器吸除 DPBS，并加入 10 mL 冷缓冲液 1（含 2 mM EDTA 的 DPBS）。在冰上振荡 30 分钟。
- 使用移液器控制器吸除缓冲液 1，并加入 10 mL 冷缓冲液 2（含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖的 DPBS）。手动振摇 2−3 分钟（约 80 次/分钟）。
- 振摇后取 20 µL 缓冲液 2 内容物，于显微镜下观察。
- 用 70 µm 无菌细胞滤网过滤缓冲液 2 的内容物，用 50 mL 锥形管收集滤液。
- 将 20 µL 滤液滴加至载玻片上计数隐窝数量。转移足量步骤 1.1.7 中的缓冲液 2，确....
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结果
小肠隐窝被分离后在基底膜基质中以类器官形式进行培养。分离后第2天，类器官开始形成芽状结构。第6天时，类器官已形成多个芽状结构，腔内含有大量碎片（死亡细胞）。此时类器官已准备进行传代（图3）。
大量研究表明，炎症性细胞因子对于维持肠道上皮稳态至关重要。炎症性细胞因子的异常表达与炎症性肠病的发生密切相关11。例如，我们之前的研究表明，IL-22 能促进过渡扩增细胞的增殖，但同时会耗竭 Lgr5+ 干细胞12。
类肠器官经IL-22处理3天后，使用EdU标记合成DNA以指示细胞增殖。经IL-22处理的类肠器官中EdU+细胞数量增加（图4A）。通过流式细胞术分析，IL-22使增殖细胞比例从40.1%上升至83.5%（
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讨论
本方案详细介绍了体外培养肠类器官以及通过流式细胞术定量分析肠类器官中EdU和PI阳性细胞的必要步骤。该策略具有多项优势。首先，采用EdU标记法可检测肠类器官中的增殖细胞。与传统的BrdU检测方法相比，EdU标记法更快、更灵敏且更准确。EdU与胸腺嘧啶（T）非常相似，可在细胞分裂期间的DNA合成过程中取代胸腺嘧啶。与BrdU抗体检测相比，EdU更易于扩散进入细胞，且EdU的检测无需进行DNA变性及抗原-抗体反应。其次，流式细胞术分析能够快速而准确地定量肠类器官中的增殖细胞（EdU+）和死亡细胞（PI+）。
要成功完成整个实验流程，需考虑若干关键环节。首先，必须在适宜条件下培养肠类器官。生长良好的肠类器官应具有大量含有增殖细胞的芽状结构。其次，需及时对肠类器官进行传代消化。腔内积聚的碎片含有死亡细胞，可用碘化丙啶（PI）染色检测，这些碎片会对后续的流式细胞术分析产生不利影响。第三，由于实验步骤较多（如细胞染色、细胞固定、细胞膜破裂和离心等），细胞在操作过程中容易丢失。因此，收集足够数量的肠类器官至关重要。建议在固定前合并2−3孔（24孔板）的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（31971062、31900326 和 31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、南京大学医药生物技术国家重点实验室研究基金（KF-GN-202004）、中国江苏省高校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生科技项目（SYS2019030）以及江苏省研究生科研创新计划（KYCX19-1981）的资助。本工作还得到苏州大学唐仲英学者计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 离心管 | Corning | 430791 | |
| 22 G 灌胃针 | VWR | 20068-608 | |
| 24 孔板 | Nunc | 142475 | |
| 40 mm 无菌细胞筛 | BD | 352340 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430829 | |
| 70 mm 无菌细胞筛 | BD | 352350 | |
| Advanced DMEM/F-12 | GIBCO | 12634010 | |
| Attune NxT 声学聚焦流式细胞仪 | Invitrogen | A24863 | |
| B-27 添加剂 | GIBCO | 17504044 | |
| 缓冲液 1 | DPBS 中含 2 mM EDTA | ||
| 缓冲液 2 | DPBS 中含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖 | ||
| C57/B6 小鼠 | 南京大学南京生物医药研究院 | ||
| 细胞解离酶（TrypLE） | Life technologies | 12605-010 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒 | Life technologies | C10639 | |
| CO2 培养箱 | Panasonic | MCO-18AC | |
| DPBS | GIBCO | 14190144 | |
| D-山梨醇 | BBI | SB0491 | |
| EDTA | BBI | EB0185 | |
| ENR 培养基 | Minigut 培养基，含 50 ng/ml EGF、100 ng/ml Noggin、500 ng/ml R-spondin | ||
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10270-106 | |
| 精细虹膜剪 | Tansoole | 2037454 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| GlutaMAX 添加剂 | GIBCO | 35050-061 | |
| 山羊血清 | Life technologies | 16210-064 | |
| HDMEM | Hyclone | SH30243.01B | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| Minigut 培养基 | Advanced DMEM/F12，含 2 mM Glutamax、青霉素/链霉素（100 单位/ml）、10 mM HEPES、N2 添加剂（1:100）、B27 添加剂（1:50） | ||
| N2 添加剂 | R&D | AR009 | |
| 非离子型表面活性剂（Triton X） | BBI | TB0198-500ML | |
| 手术剪（12.5 cm） | Tansoole | 2025785 | |
| 多聚甲醛（PFA） | sigma | 158127-500g | |
| 青霉素/链霉素（Penn/Strep） | Invitrogen | 15140-148 | |
| 相差显微镜 | Nikon | TS1000 | |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170-25MG | |
| 重组 EGF | PeproTech | 315-09 | |
| 重组小鼠 Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| 重组小鼠 R-Spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | |
| 重组小鼠 IL-22 | PeproTech | 210-22-10 | |
| 蔗糖 | BBI | SB0498 | |
| 组织镊 | Tansoole | 2026704 | |
| Y-27632 2HC1 | Selleck | S1049 |
参考文献
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regu....
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重印与许可
