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方法文章

类肠体中增殖细胞与死亡细胞的定量分析

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DOI：

10.3791/60501

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2020年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案采用流式细胞术定量培养的小鼠肠类器官中增殖细胞和死亡细胞的数量。该方法有助于评估药物处理对类器官增殖和存活的影响。

摘要

肠上皮作为一道屏障，可防止管腔内容物（如致病性微生物群和毒素）进入机体其他部分。上皮屏障功能依赖于肠上皮细胞的完整性。虽然上皮细胞的增殖能够维持连续的细胞层以形成屏障，但上皮损伤会导致屏障功能障碍。结果，管腔内容物可通过非限制性途径穿过肠屏障。肠屏障功能障碍与多种肠道疾病相关，例如炎症性肠病。分离的小鼠肠隐窝可在体外培养并维持为类似隐窝-绒毛结构，这类结构被称为肠类器官或“肠体”。肠体是研究肠上皮细胞增殖与细胞死亡的理想模型。在本方案中，我们描述了一种简单的方法，用于定量培养中肠体内的增殖细胞和死亡细胞数量。使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和碘化丙啶对肠体中的增殖细胞和死亡细胞进行标记，随后通过流式细胞术分析增殖细胞和死亡细胞的比例。该方法可用于检测药物处理对肠上皮细胞增殖和细胞存活的影响。

引言

肠道上皮细胞的一个基本功能是防止管腔内容物（如致病菌和毒素）进入机体1,2。为了实现这一功能，肠干细胞持续增殖并分化为多种上皮细胞，包括吸收细胞和分泌细胞，这些细胞通过形成紧密连接构成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要细胞增殖、细胞分化和细胞死亡之间的严格协调4,5。细胞增殖减少或细胞死亡过度均会导致上皮损伤和屏障功能受损1,6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病相关7,8。

已有研究开发出一种用于培养肠隐窝的方法。利用该技术，分离的小鼠肠隐窝可生长形成肠类器官（enteroids），其具有类似隐窝-绒毛的结构，并包含所有类型的肠上皮细胞谱系9,10。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是一种胸腺嘧啶类似物，可在细胞增殖过程中DNA复制时替代胸腺嘧啶（T）。通过EdU染色可快速、准确地标记增殖细胞。碘化丙啶（PI）是溴化乙锭的一种类似物，插入双链DNA后可发出红色荧光。PI可特异性地检测死亡细胞，因为它只能穿过受损的细胞膜进入细胞。

在本实验方案中，我们首先描述如何从小鼠小肠中分离隐窝，并将其在体外培养为肠类器官。随后，我们介绍如何通过EdU和PI掺入结合流式细胞术，分析肠类器官中的增殖细胞和死亡细胞。

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方案

本方案已获得苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心（CAM-SU）动物护理与使用委员会的批准。

1. 肠道类器官的分离与培养

  1. 肠道隐窝的分离与肠类器官培养
    1. 通过吸入 CO2 处死一只 8 周龄的野生型小鼠。使用组织镊子和精细虹膜剪剪取约 8 cm 的回肠组织。
    2. 使用带有灌胃针头的注射器，以约 40 mL 冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗肠腔，然后用剪刀沿长轴剪开并展平回肠。
    3. 将回肠切成小段（0.5−1.0 cm）。将组织段放入含有 5 mL 无菌冰冻 DPBS 的 15 mL 锥形管中，在冰上振荡 5 分钟。
    4. 使用移液器控制器吸除 DPBS，并加入 10 mL 冷缓冲液 1（含 2 mM EDTA 的 DPBS）。在冰上振荡 30 分钟。
    5. 使用移液器控制器吸除缓冲液 1，并加入 10 mL 冷缓冲液 2（含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖的 DPBS）。手动振摇 2−3 分钟（约 80 次/分钟）。
    6. 振摇后取 20 µL 缓冲液 2 内容物，于显微镜下观察。
    7. 用 70 µm 无菌细胞滤网过滤缓冲液 2 的内容物，用 50 mL 锥形管收集滤液。
    8. 将 20 µL 滤液滴加至载玻片上计数隐窝数量。转移足量步骤 1.1.7 中的缓冲液 2，确保每孔含有约 500 个隐窝。
    9. 在 4 °C 条件下以 150 x g 离心 10 分钟。离心结束后，小心吸除上清液。
    10. 每 500 个隐窝用 50 µL 基底膜基质（如 Matrigel）重悬，轻柔吹打混匀（注意避免产生气泡），然后在 24 孔板的每个孔中央加入 50 µL 基底膜基质与隐窝的混合液。于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。
    11. 聚合 30 分钟后，小心向每孔加入 600 µL 类器官培养基（高级杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM]/F12，2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素 [100 单位/mL]，10 mM Hepes，N2 添加剂 [1:100]，B27 添加剂 [1:50]，并添加表皮生长因子 [EGF；50 ng/mL]、Noggin [100 ng/mL]、R-spondin [500 ng/mL] 和 Y27632 [10 µM]），然后将培养板放回 37 °C 培养箱。每日在显微镜下观察，并每 2−3 天更换一次培养基。
  2. 肠类器官传代
    注：对于长期培养，肠类器官应大约每周传代一次。
    1. 进行传代时，将组织培养板置于冰上。吸除培养基，并向每孔加入 1 mL 冷 DPBS。使用 P1000 枪头反复吹打，直至无可见的基底膜基质块残留。
    2. 将悬液通过 1 mL 胰岛素注射器（27 G）反复吹打一次，转移至 15 mL 锥形管中。在 4 °C 条件下以 150 x g 离心 5 分钟。
    3. 用移液器吸除 DPBS。每孔用 50 µL 基底膜基质重悬沉淀。
    4. 将培养板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。每孔覆盖 600 µL ENR 培养基（类器官培养基，含 50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin 和 500 ng/mL R-spondin），然后将培养板放回培养箱。

2. 类器官中EdU阳性细胞的流式细胞术分析

注：图1展示了类肠体中EdU阳性细胞流式细胞术分析的工作流程。

  1. 使用 EdU 孵育类肠器官
    1. 将步骤 1.2.4 中获得的类肠器官培养 5–7 天。以 1:2 的传代比例将类肠器官传代至新的 24 孔板中，每孔加入 600 µL ENR 培养基。在 37 °C 培养箱中孵育类肠器官 4–5 天。
    2. 设置对照组（未处理类肠器官）和实验组（用 5 ng/mL 白细胞介素 22 [IL-22] 处理的类肠器官）。每组至少准备三个重复样本。
    3. 将 EdU 加入 ENR 培养基中，配制浓度为 50 μM 的 EdU 培养基。每孔加入 600 μL EdU 培养基，在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。设置一个未加 EdU 处理的类肠器官孔作为阴性对照，用于背景扣除。
  2. 从基底膜基质中收获类肠器官
    1. 使用移液控制器吸除 EdU 培养基，并用 DPBS 洗涤一次。每孔加入 1 mL DPBS。
    2. 使用 P1000 移液枪头反复吹打，直至无固体基底膜基质块残留。将悬液转移至 15 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
    3. 加入 500 μL 细胞解离酶（材料表），在 37 °C 孵育 15 分钟。使用 P200 移液枪头反复吹打，将类肠器官解离为单细胞。
    4. 加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基 3 mL，使用 P1000 移液枪头反复吹打。
    5. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。用 1 mL DPBS 重悬细胞。
  3. 细胞固定与通透
    1. 将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
    2. 用 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）重悬细胞，在室温（RT）固定 15 分钟，然后在 300 x g 条件下离心 5 分钟。用移液枪头吸除上清液，用 DPBS 洗涤一次，离心后弃去上清液。
    3. 用 1 mL 0.5% 非离子型表面活性剂重悬细胞，在室温孵育 10 分钟。
    4. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。用 DPBS 洗涤一次，离心后弃去上清液。
  4. EdU 检测
    1. 预先配制各组分的储备液：1）Alexa Fluor 叠氮化物工作液，2）1x EdU 反应缓冲液工作液，3）EdU 缓冲液添加剂 10x 储备液。
    2. 将 10x EdU 缓冲液添加剂用去离子水按 1:10 稀释，配制 1x 溶液。该溶液需现配现用。
    3. 根据 表 1 配制反应混合液。
      注：按表中列出的顺序依次加入各成分。反应混合液配制后需在 15 分钟内使用。
    4. 向每个 1.5 mL 离心管中加入 100 μL 反应混合液。重悬细胞，避光，室温孵育 30 分钟。
    5. 在 300 x g 条件下离心 5 分钟，用移液枪头轻轻吸除反应液。
    6. 每管加入 0.5% 非离子型表面活性剂通透液，在室温洗涤一次。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，用移液枪头轻轻吸除上清液，用 1 mL DPBS 重悬细胞。
  5. 通过流式细胞术分析细胞
    1. 用 40 μm 滤网过滤重悬的细胞，用 15 mL 尖底离心管收集滤过细胞。尽快进行上机 FACS 检测。
      注：若条件受限，染色后的细胞样本应避光保存于 4 °C，并在 3 天内完成流式检测。
    2. 根据 EdU 检测试剂盒中 Alexa Fluor 叠氮化物的类型（此处为红色通道）选择合适的检测通道及电压（此处约为 150–350 V）。
    3. 设门策略
      1. 绘制 FSC-A（x 轴）vs. SSC-A（y 轴）伪彩色图，通过调节电压使大多数细胞位于点图的可见范围内。圈选细胞群体（R1），排除左下角的细胞碎片。
      2. 从 R1 细胞群体中，建立 FSC-A（x 轴）vs. FSC-H（y 轴）伪彩色图，设门圈选单细胞群体（R2），以排除细胞团块。
      3. 从 R2 细胞群体中，建立荧光强度（x 轴）vs. 细胞数量（y 轴）图，利用阴性对照设门。荧光信号区域即为阳性细胞区域（R3）。比较实验组与对照组中 EdU 阳性细胞（R3）的比例。

3. 类器官中碘化丙啶阳性细胞的流式细胞术分析

注意：图2展示了类肠体中PI阳性细胞流式细胞术分析的工作流程。

  1. 用PI孵育类肠细胞
    1. 将1.2.4步骤中获得的类肠器官在培养箱中培养5–7天。以1:2的传代比例将类肠器官传代至新的24孔板中，每孔加入600 µL ENR培养基。在37 °C培养箱中孵育4–5天。
    2. 设置对照组（未处理）和实验组（IL-22处理），每组至少设置三个重复。
    3. 将PI加入ENR培养基中，配制浓度为3 μM的含PI培养基（PI培养基）。
    4. 每孔加入600 μL PI培养基，在37 °C培养箱中孵育30分钟。设置一孔不加PI处理的类肠器官作为阴性对照，用于背景扣除。
  2. 按照步骤2.2.1–2.2.5从基底膜基质中收获类肠器官。
  3. 通过流式细胞术分析细胞
    1. 用40 μm细胞筛过滤重悬的细胞，并用15 mL锥形管收集滤过的细胞。
    2. 尽快进行流式细胞仪上机检测。
      注意：若条件受限，染色后的细胞样本应避光保存于4 °C，并在3天内完成流式检测。
    3. 选择合适的检测通道（此处为红色通道）和电压（此处约为150–350 V）进行流式细胞术分析。
    4. 采用与2.5.3节中所述相同的设门策略。

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结果

小肠隐窝被分离后在基底膜基质中以类器官形式进行培养。分离后第2天，类器官开始形成芽状结构。第6天时，类器官已形成多个芽状结构，腔内含有大量碎片（死亡细胞）。此时类器官已准备进行传代（图3）。

大量研究表明，炎症性细胞因子对于维持肠道上皮稳态至关重要。炎症性细胞因子的异常表达与炎症性肠病的发生密切相关11。例如，我们之前的研究表明，IL-22 能促进过渡扩增细胞的增殖，但同时会耗竭 Lgr5+ 干细胞12。

类肠器官经IL-22处理3天后，使用EdU标记合成DNA以指示细胞增殖。经IL-22处理的类肠器官中EdU+细胞数量增加（图4A）。通过流式细胞术分析，IL-22使增殖细胞比例从40.1%上升至83.5%（

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讨论

本方案详细介绍了体外培养肠类器官以及通过流式细胞术定量分析肠类器官中EdU和PI阳性细胞的必要步骤。该策略具有多项优势。首先，采用EdU标记法可检测肠类器官中的增殖细胞。与传统的BrdU检测方法相比，EdU标记法更快、更灵敏且更准确。EdU与胸腺嘧啶（T）非常相似，可在细胞分裂期间的DNA合成过程中取代胸腺嘧啶。与BrdU抗体检测相比，EdU更易于扩散进入细胞，且EdU的检测无需进行DNA变性及抗原-抗体反应。其次，流式细胞术分析能够快速而准确地定量肠类器官中的增殖细胞（EdU+）和死亡细胞（PI+）。

要成功完成整个实验流程，需考虑若干关键环节。首先，必须在适宜条件下培养肠类器官。生长良好的肠类器官应具有大量含有增殖细胞的芽状结构。其次，需及时对肠类器官进行传代消化。腔内积聚的碎片含有死亡细胞，可用碘化丙啶（PI）染色检测，这些碎片会对后续的流式细胞术分析产生不利影响。第三，由于实验步骤较多（如细胞染色、细胞固定、细胞膜破裂和离心等），细胞在操作过程中容易丢失。因此，收集足够数量的肠类器官至关重要。建议在固定前合并2−3孔（24孔板）的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（31971062、31900326 和 31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、南京大学医药生物技术国家重点实验室研究基金（KF-GN-202004）、中国江苏省高校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生科技项目（SYS2019030）以及江苏省研究生科研创新计划（KYCX19-1981）的资助。本工作还得到苏州大学唐仲英学者计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 ml 离心管Corning430791
22 G 灌胃针VWR20068-608
24 孔板Nunc142475
40 mm 无菌细胞筛BD352340
50 ml 离心管Corning430829
70 mm 无菌细胞筛BD352350
Advanced DMEM/F-12GIBCO12634010
Attune NxT 声学聚焦流式细胞仪InvitrogenA24863
B-27 添加剂GIBCO17504044
缓冲液 1DPBS 中含 2 mM EDTA
缓冲液 2DPBS 中含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖
C57/B6 小鼠南京大学南京生物医药研究院
细胞解离酶（TrypLE）Life technologies12605-010
离心机Eppendorf5424
离心机Eppendorf5424R
离心机Eppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒Life technologiesC10639
CO2 培养箱PanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO14190144
D-山梨醇BBISB0491
EDTABBIEB0185
ENR 培养基Minigut 培养基，含 50 ng/ml EGF、100 ng/ml Noggin、500 ng/ml R-spondin
胎牛血清（FBS）Gibco10270-106
精细虹膜剪Tansoole2037454
荧光显微镜OlympusFV1000
GlutaMAX 添加剂GIBCO35050-061
山羊血清Life technologies16210-064
HDMEMHycloneSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut 培养基Advanced DMEM/F12，含 2 mM Glutamax、青霉素/链霉素（100 单位/ml）、10 mM HEPES、N2 添加剂（1:100）、B27 添加剂（1:50）
N2 添加剂R&DAR009
非离子型表面活性剂（Triton X）BBITB0198-500ML
手术剪（12.5 cm）Tansoole2025785
多聚甲醛（PFA）sigma158127-500g
青霉素/链霉素（Penn/Strep）Invitrogen15140-148
相差显微镜NikonTS1000
碘化丙啶SigmaP4170-25MG
重组 EGFPeproTech315-09
重组小鼠 NogginPeproTech250-38
重组小鼠 R-Spondin 1R&D3474-RS-050
重组小鼠 IL-22PeproTech210-22-10
蔗糖BBISB0498
组织镊Tansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049

参考文献

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

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