激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

摘要

本方案描述了利用激光显微切割技术从新鲜冷冻的小鼠胚胎切片中分离软骨和骨组织的方法。通过焦宁Y染色可快速可视化软骨和骨组织，并可精确采集，以获得高质量的RNA用于转录组分析。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）是一种从异质组织中分离特定细胞类型或目标区域的有力工具。随着发育进程，骨骼结构的细胞和分子复杂性逐渐增加。组织的异质性，例如软骨与骨组织之间或这些组织与周围组织交界处的差异，是研究软骨和骨骼发育过程中的一个障碍。本实验方案提供了一种快速的组织处理及软骨与骨组织分离方法，可获得高质量的RNA，用于基因表达分析。将小鼠胚胎的新鲜冷冻组织进行切片，并使用短暂的焦油紫染色，使软骨和骨组织呈现出与周围组织不同的颜色以便识别。随后迅速对切片进行脱水处理，并通过激光捕获显微切割技术分离软骨和骨组织。该过程中尽量减少组织接触水溶液的时间，从而保持RNA的完整性。在E16.5时期的小鼠Meckel软骨和下颌骨成功实现了采集，基因表达分析结果显示成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的标志基因存在差异表达。此外，该方法也从多种组织和不同胚胎发育阶段中成功提取出高质量的RNA。本方案详细描述了LCM的样品制备流程，包括新鲜冷冻组织的冷冻包埋、切片、染色和脱水步骤，以及通过激光捕获显微切割精确分离软骨和骨组织，最终获得适用于转录组分析的高质量RNA。

引言

肌肉骨骼系统是一个多组分系统，由肌肉、结缔组织、肌腱、韧带、软骨和骨骼组成，受神经支配并由血管提供血液供应¹。骨骼组织在发育过程中细胞异质性和结构复杂性逐渐增加。软骨和骨骼来源于相同的成骨软骨祖细胞谱系，具有高度相关性。胚胎期的软骨和骨骼在肌肉、神经、血管以及未分化的间充质共同参与下发育形成。某些情况下软骨还被骨骼所包绕，例如下颌骨内的梅克尔软骨（Meckel's cartilage）和髁突软骨。这些组织在解剖结构上相互关联，并在发育过程中通过细胞外信号分子相互作用。在研究软骨和骨骼发育过程中基因表达时，一个主要障碍是骨骼结构本身包含多种组织类型，具有高度异质性。因此，精确分离目标特定组织是成功进行转录分析的关键。

激光捕获显微切割（LCM）是一种用于分离异质组织中特定细胞类型或目标区域的强大工具，具有良好的可重复性，并且灵敏度可达单细胞水平²。该技术可精确定位并捕获目标细胞，适用于转录组学、基因组学和蛋白质组学等多种下游分析^3,4。通过生物分析仪或同等平台可评估所分离RNA、DNA或蛋白质的质量。例如，RNA质量可通过RNA完整性数值（RIN）进行判断⁵。

本文提供了一种利用激光显微切割技术（LCM）对新鲜冷冻组织中的软骨和骨组织进行快速染色与分离的实验方案。我们以小鼠胚胎为例，证明该方案可获得高质量的RNA，适用于后续转录组学分析，例如RNA测序（RNA-seq）。

方案

小鼠组织的获取遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》，研究方案已获西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会批准。

1. 新鲜冷冻样本的制备

1. 解剖感兴趣的胚胎或组织。将样本置于一次性包埋模具中，并用最佳切割温度（OCT）包埋剂包埋。使用枪头或针头调整标本的方向。
2. 将样本在干冰/甲基丁烷浴中迅速冷冻。继续进行下一步操作，或于 -80 °C 保存。
   注意：本实验方案可在此处暂停。

2. 用于激光显微切割的冷冻切片

1. 解冻冷冻切片机，并用70%乙醇清洁内部表面。使用RNase去污染剂处理防卷板和一对镊子。将冷冻切片机设定至所需的切片温度（-18至-22 °C）。准备一个带盖容器并放入干冰，在干冰上铺一张铝箔，用于冷冻切片过程中临时存放切好的样本载玻片。
   注意：干冰极冷，操作时务必小心，每次接触均应佩戴隔热手套。
2. 将新鲜冷冻的样本转移至盛有干冰的容器中。在冷冻切片机样本夹头上涂一层OCT包埋剂，立即轻轻将样本置于OCT上并施加轻微压力。当OCT完全冻结后，将带有样本的夹头固定到冷冻切片机的切片臂上。
3. 将样本在冷冻切片机中静置15分钟，使其温度平衡至切片温度。
4. 对组织进行切片，并以12 μm厚度将切片收集到聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片上。将连续切片在膜上对齐排列。完成一张载玻片后，让切片干燥数分钟，然后将其转移至干冰容器中的铝箔上，直至收集完所有所需载玻片。
5. 将载玻片存放在-80 °C的载玻片盒中。
   注意：切片厚度的选择旨在最大化组织收集量的同时保证组织切片效率，可根据目标组织类型有所不同。本方案可在此暂停。确保载玻片避免RNase污染，避免温度变化。尽管存放长达6个月的载玻片所提取RNA的RIN值仍可能显示高质量，但我们建议尽快使用载玻片。

3. 激光显微切割样品制备

1. 准备染色和脱水用溶液。
   1. 在冰上放置三个50 mL离心管，每个管中加入45 mL 80%乙醇。将其标记为#1、#2和#3。使用无RNase/DNase水稀释乙醇。
   2. 在冰上放置一个50 mL离心管，其中加入45 mL 95%乙醇。
   3. 在冰上放置一个50 mL离心管，其中加入45 mL 100%乙醇。
   4. 在室温下将45 mL二甲苯放入一个50 mL离心管中。
      注意：二甲苯应在通风橱中使用。
2. 将PEN膜载玻片短暂地贴于戴手套的手上进行解冻，然后在50 mL离心管中用45 mL 80%乙醇（#1和#2）振荡洗涤两次，每次30秒，以去除OCT包埋剂。
   注意：在染色前必须彻底去除OCT，以防止染色过程中松脱的OCT遮蔽组织切片。可使用镊子辅助去除未能通过振荡洗脱的OCT。
3. 将载玻片平放在铝箔纸上。用移液器将0.8 mL 0.1%焦宁紫乙醇溶液（溶于50%乙醇）滴加到载玻片上，染色30秒。随后在45 mL 80%乙醇（#3）中清洗载玻片30秒，再依次通过50 mL离心管中的45 mL 95%乙醇、100%乙醇和二甲苯各30秒进行脱水。
4. 将载玻片竖立在精细擦拭纸上静置5分钟，以沥干二甲苯并干燥组织切片。
   注意：载玻片在进行激光显微切割（LCM）前必须完全干燥。

4. 激光捕获显微切割

注意：进行激光显微切割（LCM）时，请佩戴无粉腈手套。

1. 打开LCM显微镜、激光器和计算机。登录计算机并启动软件。将钥匙转到“开”位置以启动激光器。当绿色指示灯（Laser）亮起时，按下红色按钮以激活激光器，此时指示灯（Laser）变为红色，表示激光器已准备就绪，可供使用。
   注意： 激光器需要大约10分钟预热。
2. 设置收集管。
   1. 将0.5 mL聚合酶链式反应（PCR）管的管盖插入收集器中。
      注意： 根据所需PCR管（0.2或0.5 mL）选择匹配的收集器。
   2. 用移液器吸取 50 µL 裂解缓冲液（由所列 RNA 提取试剂盒提供） 材料表) 加入0.5 mL收集管的管盖中。
   3. 将收集装置插入显微镜。
   4. 在 更换收集装置 窗口，单击 移动到参考点 单击按钮，将收集器移至参考点（RP）。调节焦距，清晰观察参考点。点击箭头，将参考点移至视野中央。
3. 加载样本载玻片。
   1. 点击左侧 卸载 点击工具栏中的按钮以降低载物台。
   2. 将载玻片放入持片架中，组织切面朝下。
      注意： 这种方向可确保捕获的组织切片在重力作用下落入收集管的管盖中。
   3. 将载物台插回显微镜载物台。
4. 设置激光参数。
   1. 选择 对照 选项 激光 菜单或点击 激光 图标。
   2. 根据需要调整这些参数： 功率激光的功率； 孔径激光的宽度；以及 速度切割速度 绘制与切割 模式。
      注意： 在非目标区域测试激光。较高的功率或较大的孔径虽更利于切割，但会对细胞造成更大损伤。调整功率、孔径和速度的组合，以实现高效切割并尽量减少组织损伤。例如，对12 μm切片上的软骨组织，可设置功率为40，孔径为5，速度为7。
5. 选择并切割感兴趣的区域。
   1. 从5倍物镜开始，找到感兴趣的区域，然后切换到最能清晰显示该区域的物镜（5倍、10倍或40倍）。
      注意： 经过焦油紫染色后，软骨呈品红色，矿化组织呈棕色或黑色，可与其他组织区分。图像可使用以下方法保存 另存图像为 来自 文件 菜单
   2. 通过点击收集器上的标记，选择用于收集的试管（A、B、C、D）。
   3. 选择 移动与切割 或 绘制与切割在 移动与切割 模式下，使用鼠标或触摸屏笔手动绘制自由形状来切割样本。 绘制与切割 模式下，可使用鼠标或触摸屏笔自由绘制形状，以便后续裁剪。点击 开始剪切 按钮以启动激光切割。
   4. 切割完成后，带有 PEN 膜的目标组织在重力作用下落入收集管的管盖中。如有需要，重复步骤 4.5 以汇集多个目标区域。
      注意： 如果组织因切割不完全而未能落入收集管的管盖中，则可能需要重复切割或增加功率或光圈。矿化的骨组织（棕色或黑色）无法被激光直接切割。
6. 卸下收集器，小心关闭PCR管。将显微切割的组织置于干冰中。继续下一步操作，或于-80 °C保存。
   注意： 此处可暂停本方案。对下一个样本重复步骤 4.2 至 4.6。

5. 显微切割组织的裂解与RNA提取

1. 在室温下解冻显微切割的组织。短暂离心，并在 42 °C 下孵育样品 30 分钟。
2. 孵育结束后，将裂解缓冲液离心至 0.5 mL PCR 管中。使用RNA提取试剂盒（参见材料表）并按照制造商说明书进行DNase处理和RNA提取。

结果

采用E16.5阶段的新鲜冷冻小鼠组织冠状切片，以展示通过激光显微切割（LCM）分离和收集麦克尔软骨（MC）、髁突软骨及下颌骨的方法。在E16.5阶段处死小鼠胚胎，将其解剖后置于OCT包埋剂中，并在干冰与甲基-2-丁烷混合液中迅速冷冻，随后储存在-80 °C条件下。

为了展示软骨和骨的焦油紫染色，进行了冠状面冷冻切片，并将样本收集到显微镜载玻片上。切片按照上述方案（步骤3.2–3.4）进行洗涤、染色和脱水。载玻片经空气干燥后，使用永久封片剂封片。所观察的所有软骨均被染成洋红色（MC，髁突软骨、鼻中隔软骨、肋软骨、蝶骨前体软骨、桡骨和尺骨软骨原基），所有矿化组织均被染成棕色或黑色（图1A–E）。在多个解剖部位，软骨和骨均可与其他组织清晰区分。

对于激光显微切割（LCM），在 E16.5 时期的胚胎头部被冠状切片，使用 PEN 膜载玻片进行 12 μm 厚度的切片，每张载玻片收集 6–8 张连续切片，并在 -80 °C 下保存。去除 OCT...

讨论

激光捕获显微切割（LCM）能够从异质性组织中分离出富集或均一的细胞群体。其优势包括能够在细胞的体内环境中快速且精确地捕获细胞，而潜在的缺点则包括操作耗时、成本较高，并且依赖于操作者识别特定样本中不同亚群的能力³⁰。本实验方案详细描述了小鼠胚胎软骨和骨组织的LCM操作，重点介绍了一种使用焦宁Y（cresyl violet）染色的快速方法，以可视化软骨和骨组织，实现精确的组织采集，同时保持高完整性的RNA，适用于后续的RNA-seq分析。该方案的一个局限性在于所使用的LCM系统无法直接切割矿化组织（例如，图2C中黑色显示的下颌组织）；因此，必须对整个骨区域进行手动解剖。值得注意的是，通过LCM分离的微解剖骨化区域并非完全均一，其中至少包含成骨细胞、骨细胞和破骨细胞等亚群（Table 1）。尽管如此，LCM的富集仍具有重要价值，因为我们的前期研究已表明，即使在微解剖获得的骨组织中，RNA-seq仍可检测到特定亚群（如破骨细胞）的转录变化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-甲基丁烷	ThermoFisher Scientific	O3551-4
生物分析仪	Agilent	G2939BA
离心管	ThermoFisher Scientific	339653	50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管
醋酸克雷斯紫	Sigma-Aldrich	C5042
冷冻切片机	Leica Biosystems	CM3050 S
精密任务擦拭纸	ThermoFisher Scientific	06-666
一次性包埋模具	ThermoFisher Scientific	1220
蒸馏水	Invitrogen	10977-015	无DNase/RNase
无水乙醇（200度）	ThermoFisher Scientific	BP2818	分子生物学级
玻璃PEN膜载玻片	Leica Microsystems	11505158
激光显微切割系统	Leica Microsystems	Leica LMD6500
显微镜盖玻片	ThermoFisher Scientific	12-545FP
显微镜载玻片	ThermoFisher Scientific	12-550-15
OCT包埋剂	Electron Microscopy Sciences	102094-106
带平盖PCR管，0.5 mL	Axygen	PCR-05-C	激光显微切割收集管
永久封片介质	Vector Laboratories	H-5000
RNA提取试剂盒	ThermoFisher Scientific	KIT0204
RNase去污染剂	Sigma-Aldrich	R2020	用于表面清洁的RNase去污染剂
二甲苯	Sigma-Aldrich	214736