本方案详细描述了小鼠脑组织中IBA1和TMEM119的免疫荧光共染色逐步操作流程，以及小胶质细胞密度、分布和形态的分析，同时包括外周髓系细胞浸润的检测。
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摘要
摘要
本方案用于小鼠脑组织中常驻小胶质细胞与浸润性巨噬细胞的双重可视化。通过联合使用特异性标记小胶质细胞的TMEM119与可清晰显示细胞形态的IBA1，可对细胞密度、分布及形态学变化进行研究。定量分析这些参数对于揭示小胶质细胞——即脑内常驻巨噬细胞——在生理与病理过程中的功能具有重要意义。在正常生理状态下，小胶质细胞呈马赛克样规律分布，胞体较小，并具有分支状突起。然而，当受到环境因素（如创伤、感染、疾病或损伤）刺激时，小胶质细胞的密度、分布和形态会以多种方式发生改变，具体变化取决于刺激类型。此外，本方案所描述的双重染色方法可通过检测IBA1表达且不与TMEM119共定位的细胞，实现对脑内浸润性巨噬细胞的可视化。因此，该方法能够区分小胶质细胞与浸润性巨噬细胞，这对于深入理解二者在健康与疾病状态下对脑内稳态的不同功能贡献至关重要。本方案整合了神经免疫学领域关于特异性标记物鉴定的最新研究成果，既可为经验丰富的神经免疫学研究者提供参考，也可作为希望将神经免疫学技术引入研究项目的研究人员的实用工具。
引言
无论是急性还是慢性，神经炎症都受到小胶质细胞的密切调控，小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞。通过免疫染色对小胶质细胞进行可视化观察，对于利用光学显微镜研究神经炎症具有重要价值，该技术具有高度可及性。在稳态条件下，小胶质细胞通常以非重叠、马赛克样的模式分布，其胞体较小，并延伸出分支状突起1，这些突起有时会相互接触2。在正常生理状态下，小胶质细胞的分支状突起会动态地监测脑实质，与神经元、其他胶质细胞以及血管发生相互作用3。小胶质细胞表达多种受体，使其能够执行免疫学功能，并对脑内环境变化、细胞死亡或组织损伤作出响应。此外，它们还发挥关键的生理功能，尤其是在突触的形成、维持和清除过程中4,5。
在可用于研究小胶质细胞的多种标志物中，离子化钙结合接头分子1（IBA1）是应用最广泛的标志物之一。IBA1是一种钙结合蛋白，能够极为清晰地显示小胶质细胞的形态，包括细微的远端突起，这一点已通过电子显微镜得到证实6。该工具在表征小胶质细胞转化（过去称为"活化"）方面发挥了重要作用，已被广泛应用于大量动物疾病模型的研究7,....
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方案
所有实验操作均遵循机构动物伦理委员会的指南，并符合加拿大动物护理委员会和拉瓦尔大学动物护理委员会的规定。
1. 免疫染色
- 借助脑图谱选择包含目标区域（ROI）（即海马体）的三个小鼠脑切片。将切片放入塑料多孔板中，并用 350 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖（表 1）。
注意：为获得最佳结果，应使用 4% 多聚甲醛灌注固定脑组织，并用振动切片机切成 50 µm 厚度。对于 24 孔多孔板，每个孔最多可容纳六个切片。建议每个孔的溶液用量为：最多三个切片时使用 350 µL，六个切片时使用 500 µL。若切片数量较多，建议使用 12 孔多孔板。确保每个孔中所加溶液的体积足以完全覆盖组织并使切片自由漂浮。该推荐体积适用于后续实验步骤中使用的全部溶液。 - 用 350 µL PBS 覆盖样本，并将多孔板置于多功能摇床上，室温（RT）孵育。5 分钟后吸除 PBS，并更换新鲜 PBS，重复洗涤 5 次。
注意：建议使用移液器进行溶液更换。加入任何溶液时，应将移液器吸头紧贴孔壁缓慢加入，以保护组织完整性。同时，每种新溶液均应使用新的移液器。 - 吸除 PBS，加入 350 µL pH = 6.0 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（表 1）。
- 用石蜡膜密封多孔板，置于预热的水浴中，70 °C 漂浮孵育 40 分钟。
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结果
图1显示了使用IBA1和TMEM119对背侧海马冠状切片进行的小胶质细胞共标记，图像通过荧光显微镜在20倍放大下获取。成功的染色可清晰呈现小胶质细胞的胞体及其精细突起（图1A−C）。该染色方法可用于评估小胶质细胞的密度与分布情况，并识别小胶质细胞簇（图1I）以及浸润的巨噬细胞（图1F）。
图2展示了IBA1+/TMEM119+小胶质细胞（图2A−C），并以逐步示例展.......
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讨论
该方案可分为两个关键部分：染色质量和分析。如果染色效果不理想，则无法充分显示小胶质细胞，从而影响对细胞密度、分布和形态的测量结果。此外，还可能低估外周髓系细胞的浸润比例。本方案是经过优化的染色流程，但仍存在多种可能导致图像质量不佳的因素。尽管本方案未包含动物灌注步骤，但如果脑组织固定不充分，将会影响染色质量。此外，充分的灌注是必要的，以确保血管内不存在可能干扰研究结果的巨噬细胞。
关于免疫染色，最关键的细节包括缓冲液的质量、封闭步骤、抗体的适当保存以及脑组织样本的处理。缓冲液的正确配制及其储存会直接影响染色的质量。除非另有说明，某些缓冲液可长期保存，但应避免使用任何显示污染迹象的缓冲液。若缓冲液提前数天或数周配制，在使用前应验证每种溶液的pH值。
此外，在免疫染色过程中，背景染色的存在仍然是最常见的问题之一。背景染色会干扰小胶质细胞的分析，尤其是其形态学特征，从而导致结果出现偏差。为防止背景染色，正确执行封闭步骤至关重要。抗体的保存条件也直接影响其有效性，建议严格遵循生产商提供的储存说明，并避免反复冻融。最后，在整个实验过程中.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Nathalie Vernoux在实验方面提供的指导和帮助。我们还要感谢Emmanuel Planel博士和Serge Rivest博士分别提供荧光显微镜和共聚焦显微镜的使用支持。本研究部分资金来自墨西哥科学技术委员会（CONACYT；资助F.G.I）、Famille-Choquette基金会和神经科学专题研究中心（CTRN；资助K.P.）、魁北克健康研究基金会（Fonds de Recherche du Québec - Santé；资助M.B.）、印加研究所（Shastri Indo-Canadian Institute；资助K.B.），以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向M.E.T.提供的发现基金。M.E.T.现任加拿大健康与治疗神经免疫可塑性研究讲席（二级）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 孔多孔培养皿 | Thermo Fisher | 930186 | |
| 牛血清白蛋白 | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI 核酸染料 | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| 细刷 | 美术用品店 | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 冷水鱼皮明胶 | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 1254418 | |
| 带正电荷的载玻片 | VWR | 48311-703 | |
| 单克隆小鼠抗 IBA1 抗体 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| 正常驴血清 (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| 正常山羊血清 (NGS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| 兔单克隆抗 TMEM119 抗体 | Abcam | ab209064 | |
| 25 型往复式摇床 | Precision Scientific | - | |
| 移液管 | |||
| Tris 缓冲盐酸盐 | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
参考文献
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
