利用 IBA1 和 TMEM119 进行免疫荧光染色以分析小鼠脑组织中小胶质细胞密度、形态及外周髓系细胞浸润

摘要

本方案详细描述了小鼠脑组织中IBA1和TMEM119的免疫荧光共染色逐步操作流程，以及小胶质细胞密度、分布和形态的分析，同时包括外周髓系细胞浸润的检测。

摘要

本方案用于小鼠脑组织中常驻小胶质细胞与浸润性巨噬细胞的双重可视化。通过联合使用特异性标记小胶质细胞的TMEM119与可清晰显示细胞形态的IBA1，可对细胞密度、分布及形态学变化进行研究。定量分析这些参数对于揭示小胶质细胞——即脑内常驻巨噬细胞——在生理与病理过程中的功能具有重要意义。在正常生理状态下，小胶质细胞呈马赛克样规律分布，胞体较小，并具有分支状突起。然而，当受到环境因素（如创伤、感染、疾病或损伤）刺激时，小胶质细胞的密度、分布和形态会以多种方式发生改变，具体变化取决于刺激类型。此外，本方案所描述的双重染色方法可通过检测IBA1表达且不与TMEM119共定位的细胞，实现对脑内浸润性巨噬细胞的可视化。因此，该方法能够区分小胶质细胞与浸润性巨噬细胞，这对于深入理解二者在健康与疾病状态下对脑内稳态的不同功能贡献至关重要。本方案整合了神经免疫学领域关于特异性标记物鉴定的最新研究成果，既可为经验丰富的神经免疫学研究者提供参考，也可作为希望将神经免疫学技术引入研究项目的研究人员的实用工具。

引言

无论是急性还是慢性，神经炎症都受到小胶质细胞的密切调控，小胶质细胞是大脑中的常驻巨噬细胞。通过免疫染色对小胶质细胞进行可视化观察，对于利用光学显微镜研究神经炎症具有重要价值，该技术具有高度可及性。在稳态条件下，小胶质细胞通常以非重叠、马赛克样的模式分布，其胞体较小，并延伸出分支状突起¹，这些突起有时会相互接触²。在正常生理状态下，小胶质细胞的分支状突起会动态地监测脑实质，与神经元、其他胶质细胞以及血管发生相互作用³。小胶质细胞表达多种受体，使其能够执行免疫学功能，并对脑内环境变化、细胞死亡或组织损伤作出响应。此外，它们还发挥关键的生理功能，尤其是在突触的形成、维持和清除过程中^4,5。

在可用于研究小胶质细胞的多种标志物中，离子化钙结合接头分子1（IBA1）是应用最广泛的标志物之一。IBA1是一种钙结合蛋白，能够极为清晰地显示小胶质细胞的形态，包括细微的远端突起，这一点已通过电子显微镜得到证实⁶。该工具在表征小胶质细胞转化（过去称为"活化"）方面发挥了重要作用，已被广泛应用于大量动物疾病模型的研究^7,8,9。在神经炎症存在的情况下，小胶质细胞的反应包括：小胶质细胞增生（定义为细胞密度增加）、分布模式的改变（有时表现为细胞聚集）、胞体增大，以及突起增粗和缩短，形态趋向于更明显的阿米巴样形状^10,11,12,13。

免疫染色技术受限于针对特定标志物的抗体的可获得性。值得注意的是，IBA1 在小胶质细胞中表达，但也表达于浸润大脑的外周巨噬细胞¹⁴。尽管在该研究领域中，观察大脑内 IBA1 阳性细胞已成为小胶质细胞的标志，但已有报道表明，在多种条件下甚至在健康大脑中均存在一定程度的外周巨噬细胞浸润^15,16,17,18。因此，单独使用 IBA1 无法实现小胶质细胞的选择性可视化。此外，巨噬细胞一旦浸润大脑，便会获得与常驻小胶质细胞相似的分子和形态学特征，从而难以区分¹⁹。这在研究小胶质细胞和浸润性巨噬细胞功能时构成了挑战。

尽管小胶质细胞和外周巨噬细胞具有不同的起源（例如，分别起源于胚胎卵黄囊和骨髓^20,21），但越来越多的研究发现表明，这两类细胞群体在大脑中发挥着不同的作用¹⁹。因此，至关重要的是采用能够区分这两类细胞的方法，且避免使用可能影响其密度、分布、形态和功能的侵入性操作（如骨髓嵌合体或连体共生模型）。TMEM119 已被确认为在健康和疾病状态下均具有小胶质细胞特异性的标志物²²。当与 IBA1 联合使用时，该标志物可用于将小胶质细胞与浸润性巨噬细胞区分开来，后者为 TMEM119 阴性而 IBA1 阳性。尽管 TMEM119 的表达具有发育阶段依赖性，但其最早在出生后第3天（P3）和第6天（P6）即开始表达，并持续上升，至出生后第10至14天（P10–P14）达到成年水平²²。而 IBA1 则早在胚胎第10.5天（E10.5）即开始表达²³。因此，本研究所提出的双标染色方案适用于在整个出生后发育阶段对这两类细胞群体进行研究。

本方案提供了一步一步的免疫染色操作流程，可实现小胶质细胞与外周巨噬细胞的区分。同时，本方案还阐述了如何对小胶质细胞的密度、分布和形态进行定量分析，以及对外周巨噬细胞浸润情况进行分析。尽管对小胶质细胞和外周巨噬细胞的研究本身已具有重要意义，但该方案还可进一步实现神经炎症病灶的定位，因此也可作为平台用于识别特定研究区域，以便结合其他互补性（但更耗时耗资源）的技术进行深入研究。

方案

所有实验操作均遵循机构动物伦理委员会的指南，并符合加拿大动物护理委员会和拉瓦尔大学动物护理委员会的规定。

1. 免疫染色

1. 借助脑图谱选择包含目标区域（ROI）（即海马体）的三个小鼠脑切片。将切片放入塑料多孔板中，并用 350 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖（表 1）。
   注意：为获得最佳结果，应使用 4% 多聚甲醛灌注固定脑组织，并用振动切片机切成 50 µm 厚度。对于 24 孔多孔板，每个孔最多可容纳六个切片。建议每个孔的溶液用量为：最多三个切片时使用 350 µL，六个切片时使用 500 µL。若切片数量较多，建议使用 12 孔多孔板。确保每个孔中所加溶液的体积足以完全覆盖组织并使切片自由漂浮。该推荐体积适用于后续实验步骤中使用的全部溶液。
2. 用 350 µL PBS 覆盖样本，并将多孔板置于多功能摇床上，室温（RT）孵育。5 分钟后吸除 PBS，并更换新鲜 PBS，重复洗涤 5 次。
   注意：建议使用移液器进行溶液更换。加入任何溶液时，应将移液器吸头紧贴孔壁缓慢加入，以保护组织完整性。同时，每种新溶液均应使用新的移液器。
3. 吸除 PBS，加入 350 µL pH = 6.0 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（表 1）。
4. 用石蜡膜密封多孔板，置于预热的水浴中，70 °C 漂浮孵育 40 分钟。
5. 让多孔板冷却约 15 分钟。
6. 吸除柠檬酸钠缓冲液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBS 洗涤切片。
7. 吸除 PBS，加入 350 µL 新鲜配制的 0.1% NaBH₄ 溶液（表 1），室温孵育 30 分钟。
8. 吸除 0.1% NaBH₄ 溶液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBS 洗涤切片。
9. 吸除 PBS，加入封闭缓冲液（表 1），在多功能摇床上室温孵育 1 小时。
   注意：请确保配制双倍体积的封闭缓冲液，因为下一步将使用相同的溶液。
10. 吸除封闭缓冲液，替换为含有初级抗体混合液（1:150 小鼠抗 IBA1 抗体 + 1:300 抗 TMEM119 抗体）的封闭缓冲液。用石蜡膜密封多孔板，4 °C 过夜孵育。
11. 次日，将样本在室温复温约 15 分钟。
12. 用含吐温的 PBS（PBST）（表 1）洗涤切片，每次 5 分钟，共洗涤 5 次。
13. 吸除 PBST，加入含有次级抗体混合液的封闭缓冲液（1:300 驴抗小鼠 Alexa 488 标记抗体用于 IBA1；1:300 羊抗兔 Alexa 568 标记抗体用于 TMEM119），室温孵育 1.5 小时。从此步骤开始，所有操作均需避光。
14. 吸除封闭缓冲液，并按照步骤 1.2 的方法用 PBST 洗涤切片 5 次。
15. 吸除 PBST，加入 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）[1:20000]，室温孵育 5 分钟。
16. 吸除 DAPI，用磷酸盐缓冲液（PB）洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
17. 将切片封固于显微镜载玻片上。在避光条件下自然干燥。
18. 干燥后，滴加适量荧光封片介质，加盖盖玻片，避免气泡产生。
    注意：将载玻片置于组织学玻片盒中，避光保存于 4 °C。样本可保存数月。

2. 用于密度和分布分析的成像

1. 借助宽场落射荧光显微镜，使用低倍镜并通过 DAPI 通道定位感兴趣区域（即海马体的 CA1 区）。
2. 使用 20 倍物镜、数值孔径（NA）为 0.5 的条件，结合 DAPI、488 和 568 通道及相应滤光片，以 0.3 µm/像素的分辨率采集图像。拍摄覆盖感兴趣区域的拼接图像；或者拍摄多幅单独图像，后续拼接成一幅更大的图像。
   注意：拼接图像是由多个较小图像组合而成的合成图像，通常用于克服高倍镜视野范围有限的问题。某些软件自带拼接功能，但也可使用其他图像编辑软件手动将各幅图像拼接为一幅完整图像。请务必在文件中添加比例尺信息。对于此类分析，建议每个动物每个感兴趣区域至少采集 300 个小胶质细胞的图像（例如，海马体区域大约对应 10−15 幅图像），每种实验条件至少包含五只动物。图 1A−C 展示了共标记的小胶质细胞图像。
3. 将图像保存为 TIFF 文件。

3. 形态学分析成像

1. 使用共聚焦显微镜或结构照明显微镜，通过 DAPI 通道在低倍镜下定位感兴趣区域（ROI）。
2. 使用 40x 物镜（例如，NA 1.4 油镜），在 ROI 内找到一个 IBA1+/TMEM119+ 细胞。在进行活体成像时，沿 Z 轴移动。一旦随机选定的小胶质细胞信号消失，将该 Z 平面设为 Z 层切的起始位置；然后沿相反方向移动 Z 轴，直至小胶质细胞信号再次消失，并将该点设为 Z 层切的终止位置。
   注：图 2A−C 展示了 IBA1+/TMEM119+ 小胶质细胞的图像。
3. 使用 0.33 µm 的 Z 间距和 0.15 µm/像素的像素尺寸，在三个通道（DAPI、488、568）中创建 Z 层切图像，并将比例尺信息添加到文件中。
   注：推荐的 Z 间距取决于物镜的分辨能力（例如，对于 NA 1.4 油镜的 40x 物镜，推荐值为 0.33 µm）。进行形态学分析时，建议每只动物至少分析 20 个细胞，每种实验条件至少包含五只动物。
4. 将文件保存为 TIFF 格式。

4. 密度与分布分析

1. 安装最近邻距离（NND）插件后打开 FIJI/ImageJ，并打开 20 倍图像。
   注意：使用搜索引擎搜索关键词“Nearest Neighbor Distances Calculation with ImageJ”以查找安装说明。该插件作者为 Yuxiong Mao。
2. 若需根据图像上标注的比例尺手动设置尺度，选择直线工具（图 3E），将光标置于比例尺边缘，按住 Shift 键的同时，在图像上尽可能贴近比例尺画一条线（图 3I），然后选择 分析 | 设置尺度，并输入正确的信息（图 3J）。
   注意：比例尺有时包含在文件的元数据中，可自动设置。
3. 在菜单栏中选择 图像 | 颜色 | 合成图像，以创建所有通道的合成图像。
   注意：在图像采集过程中，FIJI/ImageJ 会自动以 RGB 格式创建合成图像。
4. 在菜单栏中选择 分析 | 设置测量值。勾选 面积、质心 和 周长。在 重定向至 选项卡中，点击并选择已打开的文件（图 3K）。
5. 进入 图像 | 颜色 | 通道工具 以打开通道工具。
   注意：此菜单允许禁用特定颜色。DAPI 通道有助于识别感兴趣区域（ROI）并确认细胞位置，可将其关闭以简化计数过程。
6. 使用自由手绘选择工具在 ROI 周围绘制大致轮廓（图 3D）。
7. 通过双击工具栏上的椭圆工具启用选择画笔工具，并确保勾选了 启用选择画笔 选项（图 3G）。该工具将用于更精确地描绘 ROI。选择 200−400 之间的合适画笔尺寸。
8. 使用选择画笔调整 ROI 轮廓至最佳匹配。按键盘上的 T 键将其添加至 ROI 管理器（图 3L）。
9. 选择 分析 | 测量 或按下 M 键，结果窗口将弹出。将结果显示复制并粘贴到数据表中，然后保存与面积相关的信息（即 ROI 的面积；图 3R）。
10. 复制 ROI 面积后，点击结果窗口并按下 Backspace 键清除其中的信息。
11. 进入 ROI 管理器窗口（图 3L），右键单击 ROI 轮廓，将其名称更改为与图像名称一致，然后保存。
12. 双击工具栏上的画笔工具，选择黑色和尺寸为 10 的画笔。确保取消勾选 绘制覆盖层 选项（图 3H）。
13. 在 TMEM119 通道中，为每个 TMEM119+ 小胶质细胞的胞体中心仔细放置一个黑点。对 TMEM119 阴性细胞（标记浸润性巨噬细胞）的细胞中心放置白点。对 ROI 内所有细胞重复此操作。
    注意：所有点（黑点和白点）必须位于同一通道中。可通过观察图像窗口标签的颜色（红色、蓝色或绿色）来确认通道身份。
14. 选择 图像 | 颜色 | 拆分通道。每个通道将显示为独立窗口。随后识别包含点注释的通道，并关闭其余两个窗口。
15. 重定向新拆分的通道图像。进入 分析 | 设置测量值。在 重定向至 选项卡中，点击并选择拆分后的通道图像（图 3K）。
16. 选择 图像 | 类型 | 8 位。进入 图像 | 调整 并选择 阈值（图 3O）。调整阈值时，将第二根滑条完全向左滑动（两个滑条的阈值均设为 0）。
    注意：此操作将仅保留图像上的黑点，且其显示为白色。
17. 在 ROI 管理器窗口中选择 ROI。选择 分析 | 分析粒子（图 3N）。在 大小（inchˆ2） 栏中输入 1−20。保持像素单位未勾选，勾选 显示、汇总并添加至管理器，然后点击 确定。汇总窗口将弹出并显示点的数量（图 3P）。将信息复制并粘贴至数据表中。
18. 选择 插件 | NND。NND 窗口将弹出（图 3Q）。将所有信息复制粘贴至数据表中。每个数值代表一个小胶质细胞与其最近邻小胶质细胞之间的距离。
19. 返回阈值窗口，将第一根滑条完全向右滑动（两个滑条的阈值均设为 255），使所有白点可见并显示为白色（图 3M）。
20. 选择 分析 | 分析粒子。提供点数的汇总窗口将弹出（图 3P）。将信息复制并粘贴至数据表中。
21. 进入 ROI 管理器，选择所有点，右键单击并以图像名称保存。这将把所有点保存为一个 zip 文件（图 3L）。选择 文件 | 另存为，并以可识别所分析图像的名称保存文件。
22. 通过将 IBA1+/TMEM119+ 双阳性细胞数量除以 ROI 面积，计算小胶质细胞密度（每张图像）。
    注意：每张图像的数值可在每只动物内取平均值。数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。
23. 通过获取每张图像中所有 TMEM119+ 细胞 NND 值的平均值，确定 NND。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。
24. 使用公式计算间距指数：NND² × 密度。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。该测量值的单位为任意单位。
25. 通过识别 NND 小于 12 µm 的细胞来量化小胶质细胞簇。
    注意：此处选择 12 µm，因其近似两个直接相邻且突起相互接触的小胶质细胞之间的距离。若满足此条件的细胞超过三个，请返回图像确认这些细胞属于单个簇还是多个簇。
26. 确认簇的数量后，将簇数记录在数据表中。
    注意：可通过将簇数除以 ROI 面积，获得每只动物的细胞密度（个/mm²）。数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。
27. 为确定外周髓系细胞浸润百分比，计算每只动物中 IBA1+/TMEM119- 细胞占总髓系细胞数（TMEM119+/IBA1+ + TMEM119-/IBA1+）的百分比。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± SEM。

5. 形态学分析

1. 打开 FIJI/ImageJ。
2. 使用 Image J 或 FIJI 打开 40x 图像。选择后将弹出一个窗口，询问是否以堆栈形式打开图像。点击 确定。接着选择 图像 | 堆栈 | Z 投影，以打开 Z-投影窗口。包含从第一层到最后一层的所有切片。确保在 投影类型 下选择 最大强度投影，然后点击 确定。
3. 点击显示 Z 投影结果的新窗口。选择 图像 | 颜色 | 拆分通道。在 IBA1 通道的图像上进行轮廓追踪。
   注意：在小胶质细胞形态学分析过程中，其他通道（TMEM119 和 DAPI）可保持打开状态，并根据需要参考。
4. 在菜单栏中选择 分析 | 设置测量值。勾选 面积、质心 和 周长。在 重定向至 选项卡中，选择已打开的文件（图 3K）。
5. 按照步骤 4.2 中所述设置比例尺。
6. 为测量 IBA1 通道中的胞体大小，使用自由手绘选择工具在胞体周围绘制大致轮廓（图 3D）。
7. 通过在工具栏上双击椭圆工具，然后勾选 启用选择画笔框，以启用选择画笔工具（图 3G）。选择 10−20 之间的画笔尺寸（图 3B）。
8. 使用选择画笔工具，调整轮廓以最佳贴合胞体。在此步骤中放大图像可提高精确度（图 2I）。
9. 按下 T 键，将胞体轮廓添加至 ROI 管理器（图 3L）。
10. 选择 分析 | 测量，或按下 M 键。将弹出结果窗口。将结果复制并粘贴至数据表中（图 3R）。
11. 为保存有关胞体面积的信息，请进入 ROI 管理器窗口，右键点击该 ROI，将其名称更改为与图像名称一致，并注明该轮廓用于胞体，然后保存文件。
12. 为测量 IBA1 通道中的分支区域面积，使用多边形选择工具点击小胶质细胞突起的末端，以开始创建多边形（图 3C）。
13. 沿着小胶质细胞突起的末端，通过在每个突起末端处点击，围绕小胶质细胞绘制一个多边形，以最准确地表示小胶质细胞分支所覆盖的区域（图 2D−H）。
    注意：确保多边形连接所有小胶质细胞突起的末端。构成多边形的线条不得相交。在围绕突起末端点击时，需注意避免截断任何部分的突起。有时添加额外的点有助于绕过突起。构成多边形的点数与远端突起的数量无直接关联，因此对本研究不具意义。
14. 通过点击多边形的起始点来闭合多边形。
15. 按下 T 键，将轮廓添加至 ROI 管理器（图 3L）。选择 分析 | 测量，或按下 M 键。将弹出结果窗口。将结果复制并粘贴至数据表中（图 3R）。
16. 为保存有关分支区域面积的信息，请进入 ROI 管理器窗口，右键点击该 ROI，将其名称更改为与图像名称一致，并注明用于分支区域，然后保存文件。
17. 通过计算每只动物所有胞体面积的平均值，确定胞体面积。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。
18. 通过计算每只动物所有分支区域面积的平均值，确定分支区域面积。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。
19. 对每个小胶质细胞，使用公式“胞体面积 / 分支区域面积”计算形态学指数，并按每只动物取平均值。
    注意：数据可表示为所有动物的均值 ± 标准误（SEM）。

结果

图1显示了使用IBA1和TMEM119对背侧海马冠状切片进行的小胶质细胞共标记，图像通过荧光显微镜在20倍放大下获取。成功的染色可清晰呈现小胶质细胞的胞体及其精细突起（图1A−C）。该染色方法可用于确定小胶质细胞的密度与分布，并识别小胶质细胞簇（图1I）以及浸润的巨噬细胞（图1F）。

图2展示了IBA1+/TMEM119+小胶质细胞（图2A−C），并以逐步示例展示了...

讨论

该方案可分为两个关键部分：染色质量和分析。如果染色效果不理想，则无法充分显示小胶质细胞，从而影响对细胞密度、分布和形态的测量结果。此外，还可能低估外周髓系细胞的浸润比例。本方案是经过优化的染色流程，但仍存在多种可能导致图像质量不佳的因素。尽管本方案未包含动物灌注步骤，但如果脑组织固定不充分，将会影响染色质量。此外，充分的灌注是必要的，以确保血管内不存在可能干扰研究结果的巨噬细胞。

关于免疫染色，最关键的细节包括缓冲液的质量、封闭步骤、抗体的适当保存以及脑组织样本的处理。缓冲液的正确配制及其储存会直接影响染色的质量。除非另有说明，某些缓冲液可长期保存，但应避免使用任何显示污染迹象的缓冲液。若缓冲液提前数天或数周配制，在使用前应验证每种溶液的pH值。

此外，在免疫染色过程中，背景染色的存在仍然是最常见的问题之一。背景染色会干扰小胶质细胞的分析，尤其是其形态学特征，从而导致结果出现偏差。为防止背景染色，正确执行封闭步骤至关重要。抗体的保存条件也直接影响其有效性，建议严格遵循生产商提供的储存说明，并避免反复冻融。最后，在整个实验过程中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠	Invitrogen/Thermofisher	A21202
Alexa Fluor 568 山羊抗兔	Invitrogen/Thermofisher	A11011
Biolite 24 孔多孔培养皿	Thermo Fisher	930186
牛血清白蛋白	EMD Millipore Corporation	2930
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C0759-500G
DAPI 核酸染料	Invitrogen/Thermofisher	MP 01306
细刷	美术用品店
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
冷水鱼皮明胶	Sigma-Aldrich	G7765
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	1254418
带正电荷的载玻片	VWR	48311-703
单克隆小鼠抗 IBA1 抗体	Millipore	MABN92
Na2H2PO4·H2O	BioShop Canada Inc.	SPM306, SPM400
Na2HPO4	BioShop Canada Inc.	SPD307, SPD600
NaBH4	Sigma-Aldrich	480886
NaCl	Fisher Scientific	S642500
正常驴血清 (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	017-000-121
正常山羊血清 (NGS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	005-000-121
Parafilm-M	Parafilm	PM-999
兔单克隆抗 TMEM119 抗体	Abcam	ab209064
25 型往复式摇床	Precision Scientific	-
移液管
Tris 缓冲盐酸盐	BioShop Canada Inc.	TRS002/TRS004
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML