在缺乏序列特异性引物的情况下，RNA发夹结构和环状结构可作为逆转录（RT）的引物，从而干扰对重叠反义转录本的研究。我们开发了一种能够鉴定链特异性RNA的技术，并利用该技术研究了HIV-1反义蛋白ASP。
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本文内容
摘要
摘要
在逆转录病毒中，反义转录已在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）中被报道。在HIV-1中，反义蛋白ASP基因位于env基因的负链上，处于-2阅读框，跨越gp120/gp41的连接区域。在正义方向上，ASP开放阅读框的3'端与gp120的高变区V4和V5重叠。由于一种称为逆转录酶自引发（RT-self-priming）的现象，ASP RNA的研究受到阻碍，该现象指RNA二级结构可在无特异性引物的情况下启动逆转录酶，从而产生非特异性的cDNA。通过在逆转录反应中结合使用高变性条件与生物素标记的反向引物，并利用链霉亲和素包被的磁珠对cDNA进行亲和纯化，我们得以选择性扩增来自HIV-1感染者CD4+ T细胞中的ASP RNA。该方法成本相对较低、操作简便、高度可靠且易于重复。因此，该方法不仅为研究HIV-1中的反义转录，也为研究其他生物系统中的反义转录提供了强有力的工具。
引言
反义蛋白（ASP）基因是位于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜（env）基因负链上的一个开放阅读框（ORF），跨越gp120/gp41连接区1近30年来，多项研究报告证实，HIV ASP基因确实能够被转录和翻译2,3,4,5,6,7,8,9尽管ASP反义转录本已被全面表征 体外直到最近，关于患者体内ASP RNA实际生成的信息仍然缺失。
ASP 的序列与 env 相反且互补。这在检测 ASP 转录本时构成了主要障碍。标准的逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法使用基因特异性的反义引物来合成具有正确极性的互补 DNA（cDNA）。然而，该方法无法确定初始 RNA 模板的方向（正义或反义），因为在缺乏引物的情况下，RNA 发夹结构或环状结构可在两个方向上启动逆转录（RT）
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方案
本研究已获得洛桑大学医院（Centre Hospitalier Universitaire Vaudois，CHUV）机构审查委员会的批准。
1. 使用HIV-1HXB2毒株感染外周血单个核细胞（PBMCs）
- 第1天：PBMCs 刺激
- 从健康供体的血沉棕黄层中分离PBMCs。
- 计数PBMCs，并以完全Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（R-10））重悬细胞，使细胞浓度为1×106/mL，同时加入50 U/mL白细胞介素-2（IL-2）和3 µg/mL植物血凝素（PHA）。
- 用移液器吹打混匀，并将细胞分装至两块六孔板中（每孔3 mL细胞悬液）。
- 于37 °C、5% CO2条件下培养3天。
- 第3天：PBMCs 感染
注意：使用步骤1.1.3中两块板中的一块作为阴性对照（不感染这些细胞）。
警告：整个操作过程必须在生物安全三级实验室（P3）中进行。- 将一块板中的PBMCs收集至50 mL离心管中，于300 × g离心1....
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结果
高温RNA变性结合生物素化cDNA亲和纯化可防止PCR过程中PBMCs感染样本中非特异性ASP产物的扩增 体外 以及从患者中分离的CD4+ T细胞中。已有研究表明，RT自引发可在反义RNA的逆转录过程中发生10,14,15,16,17为了防止这一现象，我们开发了一种新方法，该方法采用了Heist等人最初描述的技术。10我们的实验流程包括在逆转录（RT）之前对RNA进行高温变性，并使用生物素标记的引物进行逆转录，随后将生物素标记的cDNA通过链霉亲和素包被的磁珠进行亲和纯化。13通过该方法获得的cDNA可用于下游应用，包括标准PCR或qPCR。
在一.......
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讨论
本报告中，我们描述了一种链特异性逆转录（RT）检测方法，用于检测从 HIV-1 感染个体中分离的 CD4+ T 细胞中的 ASP RNA。逆转录过程中发生的非特异性引物结合会干扰具有正确极性的 RNA 转录本的检测，从而导致结果误判。此前已有多个研究团队开发了多种策略，旨在防止逆转录反应中引物非依赖性的 cDNA 合成。在反向引物的 3' 端添加与 HIV 无关的序列标签，已被证明可有效实现链特异性扩增6,8,9。然而，该方法仅能使错误引发的 cDNA 无法被检测到，而不能完全避免其产生，仍存在其渗入 PCR 反应并导致非特异性 DNA 产物扩增的风险（例如扩增出 env 而非 ASP）。
我们最初尝试通过标准的反义引物进行RT-PCR检测ASP RNA。扩增结果成功，获得了预期分子量的条带，但在无引物的对照组中也出现了相同大小的条带。基于这些结果，我们采用了另一种方法，即使用生物素标记的特异性反.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Patrizia Amelio、Alessandra Noto、Craig Fenwick 和 Matthieu Perreau 始终愿意与我们讨论我们的研究工作，并感谢艾滋病免疫病理学实验室的所有人员提供的宝贵技术支持。我们还要感谢 VSB Associated Inc. 的 John 和 Aaron Weddle 提供出色的美术作品。最后，特别感谢所有患者，没有他们，这项工作将无法完成。本研究未从任何资助机构获得特定资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 循环测序试剂盒 | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP 混合物（100 mM） | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep 人 CD4+ T 细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19052 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1010-500 | |
| 固定/透化溶液试剂盒 | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 流式细胞术抗体 - Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| 人 IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| 菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris lectin, PHA） | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD 可固定黄色死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发） | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| 小鼠抗人 CD28 抗体 | Becton Dickinson | 55725 | |
| 小鼠抗人 CD3 抗体 | Becton Dickinson | 55329 | |
| 引物与探针 | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| 青霉素-链霉素溶液 | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene 感染/转染试剂 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III 逆转录酶 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan 基因表达主混合液 | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| 用于亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒（含 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 细胞） | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase（2 U/µL） | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti 热循环仪 | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
参考文献
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense ....
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