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方法文章

通过链特异性逆转录PCR在患者中检测人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反义蛋白（ASP）RNA转录本

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DOI：

10.3791/60511

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2019年11月27日

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1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

本文内容

摘要

在缺乏序列特异性引物的情况下，RNA发夹结构和环状结构可作为逆转录（RT）的引物，从而干扰对重叠反义转录本的研究。我们开发了一种能够鉴定链特异性RNA的技术，并利用该技术研究了HIV-1反义蛋白ASP。

摘要

在逆转录病毒中，反义转录已在人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）中被报道。在HIV-1中，反义蛋白ASP基因位于env基因的负链上，处于-2阅读框，跨越gp120/gp41的连接区域。在正义方向上，ASP开放阅读框的3'端与gp120的高变区V4和V5重叠。由于一种称为逆转录酶自引发（RT-self-priming）的现象，ASP RNA的研究受到阻碍，该现象指RNA二级结构可在无特异性引物的情况下启动逆转录酶，从而产生非特异性的cDNA。通过在逆转录反应中结合使用高变性条件与生物素标记的反向引物，并利用链霉亲和素包被的磁珠对cDNA进行亲和纯化，我们得以选择性扩增来自HIV-1感染者CD4+ T细胞中的ASP RNA。该方法成本相对较低、操作简便、高度可靠且易于重复。因此，该方法不仅为研究HIV-1中的反义转录，也为研究其他生物系统中的反义转录提供了强有力的工具。

引言

反义蛋白（ASP）基因是位于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜（env）基因负链上的一个开放阅读框（ORF），跨越gp120/gp41连接区1近30年来，多项研究报告证实，HIV ASP基因确实能够被转录和翻译2,3,4,5,6,7,8,9尽管ASP反义转录本已被全面表征 体外直到最近，关于患者体内ASP RNA实际生成的信息仍然缺失。

ASP 的序列与 env 相反且互补。这在检测 ASP 转录本时构成了主要障碍。标准的逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法使用基因特异性的反义引物来合成具有正确极性的互补 DNA（cDNA）。然而，该方法无法确定初始 RNA 模板的方向（正义或反义），因为在缺乏引物的情况下，RNA 发夹结构或环状结构可在两个方向上启动逆转录（RT）10，这一现象称为 RT 自引发。大多数 ASP 研究者通过使用带有与 HIV-1 无关序列的引物来规避 RT 自引发问题11,12。然而，该策略并不能消除该现象的发生，还可能导致非特异性 cDNA 进入后续 PCR 扩增步骤，造成潜在的污染11。

我们近期开发了一种新型的链特异性RT-PCR检测方法，用于反义RNA的研究，并已将其应用于一组六名HIV感染患者中ASP RNA的检测，结果如表1所示。下述实验步骤此前已由Antonio Mancarella等人发表13。在本实验方案中，我们采用双重策略避免非特异性cDNA的产生：首先，通过在高温（94 °C）下变性RNA以消除RNA二级结构；其次，使用生物素标记的ASP特异性引物对ASP RNA进行逆转录，并对生成的cDNA进行亲和纯化。通过该方法，我们仅能扩增目标cDNA，因为其他非特异性的逆转录产物要么在生成前被抑制（RNA高温变性），要么在PCR前被清除（亲和纯化）。

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方案

本研究已获得洛桑大学医院（Centre Hospitalier Universitaire Vaudois，CHUV）机构审查委员会的批准。

1. 使用HIV-1HXB2毒株感染外周血单个核细胞（PBMCs）

  1. 第1天：PBMCs 刺激
    1. 从健康供体的血沉棕黄层中分离PBMCs。
    2. 计数PBMCs，并以完全Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（R-10））重悬细胞，使细胞浓度为1×106/mL，同时加入50 U/mL白细胞介素-2（IL-2）和3 µg/mL植物血凝素（PHA）。
    3. 用移液器吹打混匀，并将细胞分装至两块六孔板中（每孔3 mL细胞悬液）。
    4. 于37 °C、5% CO2条件下培养3天。
  2. 第3天：PBMCs 感染
    注意：使用步骤1.1.3中两块板中的一块作为阴性对照（不感染这些细胞）。
    警告：整个操作过程必须在生物安全三级实验室（P3）中进行。
    1. 将一块板中的PBMCs收集至50 mL离心管中，于300 × g离心10分钟。
    2. 弃去上清液，用2.2 mL含20 U/mL IL-2和2 µg/mL聚凝胺的R-10培养基重悬细胞。
    3. 解冻含有HIV-1HXB2病毒的冻存管，并将1.8 mL病毒悬液（0.376 ng/µL）加入细胞中。
    4. 于37 °C孵育2小时，每30分钟轻轻摇动离心管一次。
    5. 于300 × g离心10分钟。
    6. 弃去上清液，用含50 U/mL IL-2的R-10培养基将细胞重悬至浓度为1×106/mL。
    7. 将细胞悬液转移至24孔板中（每孔1 mL），于37 °C、5% CO2条件下继续培养5天。
    8. 每天收获1孔细胞，转移至1.5 mL离心管中（标记感染天数）。
      注意：离心前，取150 µL细胞悬液转移至流式细胞术管中，用于PBMCs感染质量控制（见步骤1.3）。
    9. 于400 × g离心10分钟，弃去上清液。
    10. 将细胞沉淀在-80 °C冻存，待后续使用。
  3. PBMCs感染：质量控制
    1. 在每次感染时间点，取150 µL感染后的PBMCs，转移至流式细胞术管中。
    2. 加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），于400 × g离心5分钟。
    3. 弃去上清液，加入含1 µL Aqua活/死染料（预先用PBS按1:10稀释）的PBS溶液50 µL。
    4. 于4 °C避光孵育15分钟。
    5. 加入1 mL PBS，于400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    6. 加入250 µL固定/破膜溶液，室温避光孵育20分钟。
    7. 加入1 mL 1×破膜/洗涤缓冲液（10×储备液含FBS和皂苷，用PBS按1:10稀释），于400 × g离心5分钟。
    8. 弃去上清液，加入含HIV Gag p24异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗体（按1:10稀释）的PBS溶液50 µL。
    9. 室温避光孵育20分钟。
    10. 加入1 mL PBS，于400 × g离心5分钟，弃去上清液。
    11. 加入150 µL x CellFIX溶液（10×储备液含10%甲醛、3.55%甲醇、0.93%叠氮化钠，用PBS按1:10稀释），通过流式细胞术分析细胞。

2. 使用抗CD3/CD28抗体刺激人CD4+ T细胞

  1. 从 HIV-1 感染患者和健康供体的外周血单个核细胞（PBMC）中分离 CD4+ T 细胞。
  2. 将抗 CD3 抗体（1:100）和抗 CD28 抗体（1:50）用 PBS 稀释，配制人源抗 CD3/CD28 抗体混合液。
  3. 向适量的 48 孔板孔中每孔加入 200 µL 抗体混合液，37 °C 孵育 2 小时，以完成包被。
  4. 吸除抗体溶液，向已包被抗 CD3/CD28 抗体的孔中每孔加入 1 mL 浓度为 1×106/mL 的 CD4+ T 细胞。
    注意：CD4+ T 细胞刺激时间最长不超过 5 天。

3. 逆转录

注意：为了获得患者特异性的引物，使用HIV-1HXB2 Pan ASP引物扩增从每位患者CD4+T细胞中分离的前病毒DNA。患者特异性引物根据Pan ASP引物内部的前病毒序列设计。本研究中使用的所有引物和探针均列于表2中。

  1. 从细胞中分离总RNA
    1. 通过DNase处理样本，定量RNA并去除DNA污染。
    2. 在50 µL反应体系中进行逆转录（RT）反应。将0.1–1 µg总RNA转移至96孔PCR板的相应孔中。通过向RNA中加入以下组分制备RNA混合液：
      5 µL 生物素标记的ASP反向引物（20 µM）
      2.5 µL 脱氧核苷三磷酸（dNTPs）（10 mM）
      25 µL 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的去离子水（dH2O）。
      通过用5 µL无核酸酶水替代生物素标记的ASP反向引物，制备内源性RT对照。
    3. 将96孔PCR板放入热循环仪中，将RNA混合液在94 °C加热5分钟。
    4. 立即置于冰水中冷却至少1分钟。
    5. 在1.5 mL离心管中加入以下组分制备反应混合液（按总样本数加1计算所需量）：
      10 µL 5x RT缓冲液
      2.5 µL 0.1 M 1,4-二硫苏糖醇（DTT）
      2.5 µL RNase抑制剂（40单位/µL）
      2.5 µL 逆转录酶（200单位/µL）
    6. 将17.5 µL该混合液转移至每个含RNA的孔中。通过用2.5 µL无核酸酶水替代逆转录酶，制备无逆转录酶对照（RT-minus对照）。
    7. 轻轻混匀，并使用热循环仪在55 °C孵育60分钟。
    8. 在70 °C加热15分钟以终止反应。

4. ASP 生物素化 cDNA 的亲和纯化

注意：不要纯化不含逆转录酶的反应产物。

  1. 配制1 L含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和2 M NaCl的2×洗涤/结合缓冲液。过滤该溶液。
    1. 使用PCR级水配制50 mL 1×洗涤/结合缓冲液。
    2. 每个反应使用10 µL链霉亲和素偶联磁珠。根据反应数量，将适量体积的磁珠转移至1.5 mL离心管中。
    3. 加入等体积的2×洗涤/结合缓冲液洗涤磁珠，并涡旋振荡15秒。
    4. 将离心管放入磁力分离架中，在室温下孵育3分钟。
    5. 小心移除上清液，避免扰动磁珠，并加入与初始磁珠体积相等的2×洗涤/结合缓冲液。
    6. 涡旋振荡30秒，将10 µL磁珠悬浮液转移至相应数量的1.5 mL离心管中。
    7. 将离心管置于磁力分离架中，在室温下孵育3分钟。
    8. 弃去上清液，加入50 µL 2×洗涤/结合缓冲液。
    9. 向含有磁珠的相应离心管中加入50 µL生物素标记的cDNA。
    10. 在室温下轻轻旋转孵育30分钟。
    11. 将离心管置于磁力分离架中，在室温下放置3分钟，使磁珠与上清液分离。
    12. 加入200 µL 1×洗涤/结合缓冲液洗涤磁珠。将离心管置于磁力分离架中，在室温下放置3分钟，弃去上清液。重复此步骤两次。
    13. 将磁珠重悬于10 µL PCR级水中。

5. 标准PCR

注意：标准 PCR 的目的是扩增 ASP 基因的完整开放阅读框（ORF）。随后将扩增产物克隆至 pCR2.1 质粒中，用于建立标准曲线，以通过实时 PCR 对 ASP RNA 进行定量（参见实时 PCR 部分）。

  1. 在总体积为 50 µL 的体系中进行标准 PCR。配制适当体积的 PCR 预混液（样本数加 1）。每个样本向 1.5 mL 离心管中加入以下组分：
    1 µL 10 µM ASP 引物（正向和反向）
    1 µL 10 mM dNTPs
    氯化镁（MgCl2）（浓度取决于所用引物）
    加 dH2O 至终体积为 49 µL
    1. 充分混匀，短暂离心，将 49 µL PCR 预混液转移至 96 孔 PCR 板的各孔中。
    2. 将用于 ASP cDNA 亲和纯化的磁珠溶液在涡旋振荡器上小心振荡 15 秒。
    3. 向对应孔中加入 1 µL 磁珠，并按照以下程序运行 PCR：95 °C 预变性 2 分钟，40 个循环（95 °C 变性 30 秒，55 °C 退火 30 秒，68 °C 延伸 40 秒），最后 68 °C 延伸 7 分钟。
    4. 将 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳分离，切下目标条带，并将扩增产物克隆至 pCR2.1 质粒中。
    5. 对每个克隆进行测序并分析其序列。

6. 实时定量 PCR（qPCR）

注意：使用第3步“逆转录”中所述的方法设计患者特异性引物和探针。进行qPCR时，需包含ASP质粒稀释液以制作标准曲线。含有患者特异性插入片段的质粒构建方法见第5步“标准PCR”开头的注释。

  1. 使用1:10的ASP质粒系列稀释液制备标准曲线，起始浓度为3 × 106 拷贝/µL，稀释至3 拷贝/µL。
    1. 第一轮PCR（预扩增）。 在总体积为25 µL的体系中进行反应。配制适量的PCR预混液（样本数加1个）。对每个样本，将以下组分加入1.5 mL离心管中：
      0.5 µL ASP或env引物混合液（终浓度均为0.2 µM）（正向和反向）
      0.5 µL dNTPs混合液（终浓度均为0.2 mM）
      MgCl2（浓度取决于引物对）
      加dH2O至终体积24 µL
    2. 将24 µL PCR预混液转移至96孔PCR板中相应数量的孔内。
    3. 轻轻涡旋含有cDNA磁珠的离心管，持续15秒。
    4. 向对应的孔中加入1 µL磁珠。对质粒稀释液同样操作。
    5. 使用以下程序运行PCR：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸40秒，共18个循环；最后68 °C延伸7分钟。
    6. 用PCR级水将第一轮PCR产物按1:5比例稀释。
    7. 第二轮qPCR。 在总体积为20 µL的体系中进行反应。配制适量的qPCR预混液（样本数加1个）。对每个样本，将以下组分加入1.5 mL离心管中：
      1.8 µL 10 µM引物（正向和反向）
      1 µL 5 µM探针
      6.2 µL dH2O
    8. 将19 µL qPCR预混液加入96孔qPCR板中相应数量的孔内，然后向各孔加入1 µL稀释后的第一轮PCR产物。对质粒稀释液同样操作。
    9. 使用以下程序运行qPCR：95 °C预变性10分钟；95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟，共40个循环。

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结果

高温RNA变性结合生物素化cDNA亲和纯化可防止PCR过程中PBMCs感染样本中非特异性ASP产物的扩增 体外 以及从患者中分离的CD4+ T细胞中。已有研究表明，RT自引发可在反义RNA的逆转录过程中发生10,14,15,16,17为了防止这一现象，我们开发了一种新方法，该方法采用了Heist等人最初描述的技术。10我们的实验流程包括在逆转录（RT）之前对RNA进行高温变性，并使用生物素标记的引物进行逆转录，随后将生物素标记的cDNA通过链霉亲和素包被的磁珠进行亲和纯化。13通过该方法获得的cDNA可用于下游应用，包括标准PCR或qPCR。

在一...

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讨论

本报告中，我们描述了一种链特异性逆转录（RT）检测方法，用于检测从 HIV-1 感染个体中分离的 CD4+ T 细胞中的 ASP RNA。逆转录过程中发生的非特异性引物结合会干扰具有正确极性的 RNA 转录本的检测，从而导致结果误判。此前已有多个研究团队开发了多种策略，旨在防止逆转录反应中引物非依赖性的 cDNA 合成。在反向引物的 3' 端添加与 HIV 无关的序列标签，已被证明可有效实现链特异性扩增6,8,9。然而，该方法仅能使错误引发的 cDNA 无法被检测到，而不能完全避免其产生，仍存在其渗入 PCR 反应并导致非特异性 DNA 产物扩增的风险（例如扩增出 env 而非 ASP）。

我们最初尝试通过标准的反义引物进行RT-PCR检测ASP RNA。扩增结果成功，获得了预期分子量的条带，但在无引物的对照组中也出现了相同大小的条带。基于这些结果，我们采用了另一种方法，即使用生物素标记的特异性反...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 Patrizia Amelio、Alessandra Noto、Craig Fenwick 和 Matthieu Perreau 始终愿意与我们讨论我们的研究工作，并感谢艾滋病免疫病理学实验室的所有人员提供的宝贵技术支持。我们还要感谢 VSB Associated Inc. 的 John 和 Aaron Weddle 提供出色的美术作品。最后，特别感谢所有患者，没有他们，这项工作将无法完成。本研究未从任何资助机构获得特定资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 循环测序试剂盒Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP 混合物（100 mM）Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠Invitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep 人 CD4+ T 细胞分离试剂盒Stemcell Technologies19052
胎牛血清BiowestS1010-500
固定/透化溶液试剂盒Becton Dickinson554714
HIV Gag p24 流式细胞术抗体 - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
人 IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris lectin, PHA）Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD 可固定黄色死细胞染色试剂盒（适用于 405 nm 激发）Invitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
小鼠抗人 CD28 抗体Becton Dickinson55725
小鼠抗人 CD3 抗体Becton Dickinson55329
引物与探针Integrated DNA Technologies (IDT)
青霉素-链霉素溶液BioConcept4-01F00-H
Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶Invitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene 感染/转染试剂Sigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基Gibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III 逆转录酶Invitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan 基因表达主混合液Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4369016
用于亚克隆的 TOPO TA 克隆试剂盒（含 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 细胞）Invitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase（2 U/µL）Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti 热循环仪Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786

参考文献

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