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成像 Dpp 的释放过程 果蝇 翅盘

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DOI：

10.3791/60528

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2019年10月30日

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1Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

本文内容

摘要

配体暴露的时间可能影响其发育后果。本文展示了如何对果蝇（Drosophila）翅盘细胞释放一种名为Dpp的骨形态发生蛋白（BMP）的过程进行成像。

摘要

转化生长因子-β（TGF-β）超家族在多细胞生物的早期胚胎模式形成以及成体结构发育中至关重要。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形态发生蛋白（BMPs）、激活素（Activins）、生长与分化因子以及Nodals。长期以来，人们已知细胞所暴露的配体浓度对其生物学效应具有重要意义，且曾认为远距离浓度梯度决定了胚胎的模式形成。然而，近年来研究发现，细胞暴露于这些配体的时间同样影响其下游的转录效应。一种TGF-β超家族配体必须从其产生的细胞中释放出来，才能发挥发育作用。直到最近，确定这些配体从细胞中释放的时间仍存在困难。本文展示了如何测量果蝇（Drosophila）中一种名为Decapentaplegic（Dpp）的BMP从翅原基或翅盘细胞中的释放。该方法可被修改用于其他系统或信号配体的研究。

引言

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）在早期胚胎发生以及成体结构的模式形成中至关重要。BMPs 被合成并分泌，作用于靶细胞中生长和细胞分化所需靶基因的转录。Decapentaplegic（Dpp）是果蝇（Drosophila）中 BMP4 的同源物，在胚胎和成体结构（如翅膀）的发育过程中发挥重要作用1,2,3,4。多个研究团队聚焦于 Dpp 在成体果蝇翅膀模式形成中的作用，原因如下：1）果蝇翅膀由两层透明的上皮细胞构成，具有稳定且易于评估的翅脉模式；2）翅盘结构相对扁平，可在幼虫体外培养，便于成像并量化模式差异；3）翅膀模式的发育对 Dpp 信号通路高度敏感，通路中的微小扰动即可影响翅脉的形成模式。

Dpp 由位于翅盘前/后边界处的细胞产生5,6,7,8。Dpp 与 I 型和 II 型丝氨酸/苏氨酸激酶受体....

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方案

1. 收集卵以获得用于解剖的幼虫

  1. 将30-40只 virgin 雌性 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 果蝇与10-15只雄性 Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu 果蝇杂交。
    注意： 只要平衡染色体带有可在幼虫阶段用于筛选合适后代的幼虫标记，任何包含 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的两种基因型均可使用。
  2. 为收集卵，将杂交后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，让其产卵3–4小时，然后移除果蝇。为促进产卵，可在果蝇放入试管前，在培养基表面添加少量由颗粒状酵母与少量水混合制成的酵母糊。同一组杂交果蝇可保留并用于最多7天的卵收集。
    注意： 任何标准的 Drosophila 玉米粉培养基配方均可使用。本文所用配方来自 Hazegh 和 Reis20 的描述。
  3. 将收集卵的试管置于25 °C环境下约144小时，直至幼虫发育至三龄（游走期）阶段。
  4. 为筛选适合解剖的幼虫（即同时表达 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的个体），首先选择非 Tb 表型的幼虫。这些幼虫体长正常，而非短而粗。
  5. 在非 Tb 幼虫中，会存在表达 CyO-GFP 的幼虫和表达 Dpp-GFP 的幼虫。为筛选出表达 Dpp-GFP 的幼虫，需在荧光体视显....

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结果

图2展示了本实验方案的代表性活体成像结果。当实验成功时，可见Dpp-GFP在翅盘中央呈条带状分布，其中细胞核表现为Dpp-GFP区域内的非荧光圆形结构（图2）。Dpp-GFP的释放表现为出现和消失的荧光点状信号。我们观察到Dpp-GFP荧光信号既可在细胞本体内出现和消失，也可在远离细胞本体的位置出现和消失。Dpp信号依赖于由肌动蛋白构成的、类似丝状伪足的结构，称为细胞突（cytonemes），这些结构可从细胞本体延伸至较远位置22,23。因此，在本研究提供的视频中，远离Dpp产生细胞本体的Dpp-GFP点状信号很可能位于细胞突内或细胞突“突触”样连接处15。这些点状信号在D/V边界附近最为明显，该边界在Dpp-GFP条带中表现为一条间隙。

图3

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讨论

骨形态发生蛋白（BMP）如Dpp在结合细胞膜表面受体复合物后，可在邻近或看似遥远的细胞中引发一系列胞内信号级联反应，从而产生显著影响。Thomas Kornberg博士的实验室已证明，产生Dpp信号的细胞通过基于肌动蛋白的细长丝状伪足样结构——即细胞丝（cytonemes）——与接收信号的细胞直接接触15,24,25。这些数据表明，在此背景下，发育过程中的细胞间通讯可能类似于神经元突触26。在突触通讯中，神经递质释放的动力学对其对突触后细胞的作用至关重要。类似地，Dpp释放的动力学也对其下游效应具有重要意义12。因此，为了理解影响Dpp释放的各种因素，有必要能够在不同遗传背景和条件下测量Dpp释放的动力学过程。

本文介绍了用于成像Dpp释放的优化方法。我们曾尝试使用孔板培养翅盘进行成像，但过深的孔可能导.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Sarala Pradhan博士参与了本实验方案早期版本的工作。在本方案开发过程中，我们感谢美国国家科学基金会植物科学部（NSF-IOS 1354282）提供的经费支持。目前，我们实验室的研究工作得到了美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所（NIH-NIDCR RO1DE025311）的经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酿酒酵母Red Star  
CaCl2 二水合物Fisher ScientificC79-500
盖玻片VWR484-457
双面胶带Scotch
果蝇琼脂 II 型Apex66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu该品系即将提供于布卢明顿果蝇品系中心
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu该品系即将提供于布卢明顿果蝇品系中心
Dumont 镊子 #5World Precision Instruments500233用于解剖的镊子
HEPESSigma AldrichH3375
KClFisher ScientificAC193780010
轻质玉米糖浆Karo
麦芽提取物Breiss
MgCl2Fisher ScientificAC223210010
显微镜载玻片Sigma AldrichS8400
NaClFisher ScientificS271-500
NaHCO3RPIS22060-1000.0
指甲油Electron Microscopy Sciences72180
丙酸VWRU330-09
大豆粉ADM Specialty Ingredients062-100
蔗糖Fisher ScientificS5-3
蔗糖FisherS512
对羟基苯甲酸甲酯Genesee Scientific20-259
海藻糖二水合物Chem-Impex International, Inc.00766
黄玉米粉Quaker
Zeiss LSM 780 共聚焦显微镜Zeiss用于活体成像的显微镜
Zeiss SteREO Discovery.V8 显微镜Zeiss用于解剖的显微镜

参考文献

  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V.

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BMP GFP

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