成像 Dpp 的释放过程 果蝇 翅盘

摘要

配体暴露的时间可能影响其发育后果。本文展示了如何对果蝇（Drosophila）翅盘细胞释放一种名为Dpp的骨形态发生蛋白（BMP）的过程进行成像。

摘要

转化生长因子-β（TGF-β）超家族在多细胞生物的早期胚胎模式形成以及成体结构发育中至关重要。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形态发生蛋白（BMPs）、激活素（Activins）、生长与分化因子以及Nodals。长期以来，人们已知细胞所暴露的配体浓度对其生物学效应具有重要意义，且曾认为远距离浓度梯度决定了胚胎的模式形成。然而，近年来研究发现，细胞暴露于这些配体的时间同样影响其下游的转录效应。一种TGF-β超家族配体必须从其产生的细胞中释放出来，才能发挥发育作用。直到最近，确定这些配体从细胞中释放的时间仍存在困难。本文展示了如何测量果蝇（Drosophila）中一种名为Decapentaplegic（Dpp）的BMP从翅原基或翅盘细胞中的释放。该方法可被修改用于其他系统或信号配体的研究。

引言

骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）在早期胚胎发生以及成体结构的模式形成中至关重要。BMPs 被合成并分泌，作用于靶细胞中生长和细胞分化所需靶基因的转录。Decapentaplegic（Dpp）是果蝇（Drosophila）中 BMP4 的同源物，在胚胎和成体结构（如翅膀）的发育过程中发挥重要作用^1,2,3,4。多个研究团队聚焦于 Dpp 在成体果蝇翅膀模式形成中的作用，原因如下：1）果蝇翅膀由两层透明的上皮细胞构成，具有稳定且易于评估的翅脉模式；2）翅盘结构相对扁平，可在幼虫体外培养，便于成像并量化模式差异；3）翅膀模式的发育对 Dpp 信号通路高度敏感，通路中的微小扰动即可影响翅脉的形成模式。

Dpp 由位于翅盘前/后边界处的细胞产生^5,6,7,8。Dpp 与 I 型和 II 型丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物结合^9,10。当 Dpp 结合后，II 型受体磷酸化 I 型受体，后者进一步磷酸化 Mothers against Dpp（Mad），即 Smad 1/5/8 的同源蛋白。磷酸化的 SMAD 会招募另一个共-Smad 蛋白 Medea，从而使其进入细胞核，在核内调控靶基因，引发下游效应，如细胞增殖或分化^4,11。

最近，Bates 实验室已证明，在翅盘中 Dpp 的异常释放可导致 Mad 磷酸化水平下降、靶基因表达减少以及翅型模式缺陷^12,13。多种离子通道影响黑腹果蝇（Drosophila）翅及其相关结构的发育^14,15。这些离子通道也可能参与 Dpp 的释放过程。在确定形态发生素释放机制的过程中，建立一种能够可视化观察释放事件的方法至关重要。

Aurelio Teleman 博士和 Stephen Cohen 博士构建了一种 Dpp-GFP 融合蛋白，该蛋白能够挽救 Dpp 缺失表型，表明其具有生物学活性，并以生物学相关的方式被释放¹⁶。在此，我们描述了如何利用该 Dpp-GFP 观察 Dpp 的释放事件。这种融合蛋白特别适用于研究，因为 GFP 具有 pH 敏感性，当其处于酸性囊泡中时，荧光会被淬灭¹⁷。因此，当 GFP 标记的蛋白从囊泡释放到接近中性的细胞外环境时，GFP 的荧光强度会增加¹⁷。我们利用 GFP 的 pH 敏感性来检测 Dpp-GFP 是否定位于酸性囊泡中。我们在添加氯化铵前后对表达 Dpp-GFP 的翅成虫盘进行了成像观察，氯化铵可中和细胞内区室的酸性囊泡¹⁸。我们发现，加入氯化铵后，荧光斑点的信号显著增强，表明在添加氯化铵之前，细胞内的 Dpp-GFP 荧光处于被淬灭状态¹⁸。我们得出结论：细胞内的 Dpp-GFP 定位于酸性膜结合区室（如囊泡）中，当加入氯化铵中和细胞内区室的 pH 后，其荧光得以恢复¹⁸。这一特性使得 Dpp-GFP 的活体成像成为一种有效的方法，可用于可视化 Dpp 从酸性区室释放至细胞外环境过程中在黑腹果蝇（Drosophila）翅成虫盘中的动态行为。

本文描述了我们使用 Dpp-GFP 可视化 Dpp 释放事件的方法。利用 UAS-GAL4 系统，可在果蝇（Drosophila）翅成虫盘中以天然表达模式表达 Dpp-GFP¹⁹。该方法曾用于确定 Irk 通道影响 Dpp 的释放¹⁸。我们通过活体成像 z 轴层扫图像验证了该方法：若仅在一个焦平面进行时间序列成像，我们未观察到 Dpp-GFP 斑点在焦平面内移动；同样，在 z 轴层扫成像中也未观察到 Dpp-GFP 斑点的移动。因此我们认为，使用该方法观察到的 Dpp-GFP 斑点代表的是 Dpp 的释放事件，而非细胞内囊泡的运动。这种对 Dpp-GFP 的活体成像方法有望用于检测其他潜在调控因子对 Dpp 动态释放的影响，也可经修改后用于研究其他配体的动态行为。

方案

1. 收集卵以获得用于解剖的幼虫

1. 将30-40只 virgin 雌性 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 果蝇与10-15只雄性 Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu 果蝇杂交。
   注意： 只要平衡染色体带有可在幼虫阶段用于筛选合适后代的幼虫标记，任何包含 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的两种基因型均可使用。
2. 为收集卵，将杂交后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，让其产卵3–4小时，然后移除果蝇。为促进产卵，可在果蝇放入试管前，在培养基表面添加少量由颗粒状酵母与少量水混合制成的酵母糊。同一组杂交果蝇可保留并用于最多7天的卵收集。
   注意： 任何标准的 Drosophila 玉米粉培养基配方均可使用。本文所用配方来自 Hazegh 和 Reis²⁰ 的描述。
3. 将收集卵的试管置于25 °C环境下约144小时，直至幼虫发育至三龄（游走期）阶段。
4. 为筛选适合解剖的幼虫（即同时表达 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的个体），首先选择非 Tb 表型的幼虫。这些幼虫体长正常，而非短而粗。
5. 在非 Tb 幼虫中，会存在表达 CyO-GFP 的幼虫和表达 Dpp-GFP 的幼虫。为筛选出表达 Dpp-GFP 的幼虫，需在荧光体视显微镜下观察。尽管表达 Dpp-GFP 和 CyO-GFP 的幼虫均会显示一定程度的GFP荧光，但Dpp-GFP表达幼虫的荧光局限于翅成虫盘区域，且荧光强度明显弱于CyO-GFP表达幼虫。应选择这些荧光较弱的幼虫用于解剖。

2. 准备幼虫成像与解剖用溶液

1. 进行翅盘活体成像时，配制改良的HL3培养基²¹（70 mM NaCl、5 mM KCl、1.5 mM CaCl₂ 二水合物、4 mM MgCl₂、10 mM NaHCO₃、5 mM 海藻糖二水合物、115 mM 蔗糖、5 mM HEPES）。该培养基可维持翅盘在成像过程中的活性²¹。
2. 使用HEPES将pH值调节至7.1，并用0.22 μm滤膜过滤。该培养基既用于翅盘解剖，也作为活体成像时的封片介质。

3. 准备用于翅盘固定的载玻片

1. 将两段无色双面胶横向贴在载玻片上，两段胶带之间留出约 5 mm 的间隙。胶带长度应足以使其两端与载玻片的边缘对齐。
2. 使用平整的边缘（例如解剖镊子的手柄端）将胶带牢固地压紧在载玻片上，以防止任何介质渗入胶带下方。
3. 在两段胶带之间加入 25 μL 改良 HL3 培养基。翅盘将被置于该液滴中，位于两段胶带之间，使胶带起到支撑作用，防止盖玻片压碎组织（图 1A）。

4. 用于成像的翅盘解剖与封片

1. 在已准备好的改良HL3培养基中解剖幼虫²⁶。
2. 使用两对镊子轻轻将幼虫撕成两半，并弃去幼虫的后半部分。
3. 用一对镊子夹住幼虫前半部分的中部，用另一对闭合的镊子将口钩向内推入幼虫体内，直至幼虫完全翻转。
4. 可通过观察沿幼虫两侧延伸的两条颜色较深的气管主支上的明显弯曲处来最容易地找到翅成虫盘。在翻转的幼虫中，翅成虫盘正位于气管这些弯曲处的下方。
5. 轻柔地取出翅成虫盘，并将其转移至已准备好的载玻片上25 μL的HL3培养基中。务必确保解剖下来的翅成虫盘上不残留任何气管组织，否则会导致成虫盘漂浮，影响成像。
6. 调整翅成虫盘的方向，使其成虫囊的表皮侧朝上，背离载玻片，并保持成虫盘平展（见图1A,B）。
7. 用盖玻片覆盖翅成虫盘及封片胶，再用指甲油密封盖玻片边缘。待指甲油干燥后，立即进行下述成像步骤。

5. 成像 Dpp 释放

1. 使用共聚焦激光扫描显微镜，配备40倍油镜和488 nm激光，对已安装的翅成虫盘进行成像。Dpp-GFP应表现为沿翅成虫盘中央的一条GFP荧光条带，同时可见少量Dpp-GFP从该中央条带的细胞中释放出的微小点状结构。
2. 以每秒2帧的速度连续采集图像，持续2分钟，以观察Dpp的释放过程。为获得最佳效果，应将激光强度设置为刚好能够清晰成像Dpp释放细胞的水平，以避免图像采集过程中发生过度漂白。图像可作为时间序列采集，并导出为AVI文件（无压缩，每秒3帧），从而获得Dpp释放过程的视频文件。

结果

图2展示了本实验方案的代表性活体成像结果。当实验成功时，可见Dpp-GFP在翅盘中央呈条带状分布，其中细胞核表现为Dpp-GFP区域内的非荧光圆形结构（图2）。Dpp-GFP的释放表现为出现和消失的荧光点状信号。我们观察到Dpp-GFP荧光信号既可在细胞本体内出现和消失，也可在远离细胞本体的位置出现和消失。Dpp信号依赖于由肌动蛋白构成的、类似丝状伪足的结构，称为细胞突（cytonemes），这些结构可从细胞本体延伸至较远位置^22,23。因此，在本研究提供的视频中，远离Dpp产生细胞本体的Dpp-GFP点状信号很可能位于细胞突内或细胞突“突触”样连接处¹⁵。这些点状信号在D/V边界附近最为明显，该边界在Dpp-GFP条带中表现为一条间隙。

图3

讨论

骨形态发生蛋白（BMP）如Dpp在结合细胞膜表面受体复合物后，可在邻近或看似遥远的细胞中引发一系列胞内信号级联反应，从而产生显著影响。Thomas Kornberg博士的实验室已证明，产生Dpp信号的细胞通过基于肌动蛋白的细长丝状伪足样结构——即细胞丝（cytonemes）——与接收信号的细胞直接接触^15,24,25。这些数据表明，在此背景下，发育过程中的细胞间通讯可能类似于神经元突触²⁶。在突触通讯中，神经递质释放的动力学对其对突触后细胞的作用至关重要。类似地，Dpp释放的动力学也对其下游效应具有重要意义¹²。因此，为了理解影响Dpp释放的各种因素，有必要能够在不同遗传背景和条件下测量Dpp释放的动力学过程。

本文介绍了用于成像Dpp释放的优化方法。我们曾尝试使用孔板培养翅盘进行成像，但过深的孔可能导...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酿酒酵母	Red Star
CaCl2 二水合物	Fisher Scientific	C79-500
盖玻片	VWR	484-457
双面胶带	Scotch
果蝇琼脂 II 型	Apex	66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu			该品系即将提供于布卢明顿果蝇品系中心
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu			该品系即将提供于布卢明顿果蝇品系中心
Dumont 镊子 #5	World Precision Instruments	500233	用于解剖的镊子
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
KCl	Fisher Scientific	AC193780010
轻质玉米糖浆	Karo
麦芽提取物	Breiss
MgCl2	Fisher Scientific	AC223210010
显微镜载玻片	Sigma Aldrich	S8400
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
NaHCO3	RPI	S22060-1000.0
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180
丙酸	VWR	U330-09
大豆粉	ADM Specialty Ingredients	062-100
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3
蔗糖	Fisher	S512
对羟基苯甲酸甲酯	Genesee Scientific	20-259
海藻糖二水合物	Chem-Impex International, Inc.	00766
黄玉米粉	Quaker
Zeiss LSM 780 共聚焦显微镜	Zeiss		用于活体成像的显微镜
Zeiss SteREO Discovery.V8 显微镜	Zeiss		用于解剖的显微镜