利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

摘要

我们描述了一种利用一系列同基因型抗生素抗性大肠杆菌（Escherichia coli）进行抗生素去重的平台。通过表达相应抗性基因的大肠杆菌（E. coli）的生长情况，可推断出由细菌或真菌产生的抗生素的种类。该平台具有经济高效且节省时间的优点。

摘要

从天然产物提取物中寻找新抗生素的主要挑战之一是常见化合物的重复发现。为应对这一挑战，需对目标样品进行去重复化（dereplication），即鉴定已知化合物的过程。传统的去重复化方法，如色谱分离联合质谱分析，耗时且资源消耗大。为优化去重复化流程，我们开发了抗生素抗性平台（antibiotic resistance platform, ARP）。ARP 是一个包含约 100 个抗生素抗性基因的文库，这些基因已被分别克隆至 大肠杆菌 该菌株保藏具有多种应用，包括作为一种经济高效且简便的抗生素去重方法。该方法涉及在含有固体培养基的矩形培养皿表面发酵产抗生素微生物，从而使其分泌的次级代谢产物能够通过培养基扩散。经过6天的发酵后，去除微生物生物量，并在培养皿上添加一层薄琼脂覆盖层，以形成平整表面并支持测试菌的生长 E. coli 指示菌株。随后将我们收集的ARP菌株点种到含抗生素的培养皿表面。接着将平板过夜培养，以允许 E. coli 在覆盖层表面生长的菌落中，只有含有对特定抗生素（或类别）具有抗性的菌株才能生长，从而实现对所产生化合物的快速鉴定。该方法已成功用于已知抗生素产生菌的鉴定，并可作为鉴定新型化合物产生菌的有效手段。

引言

自1928年发现青霉素以来，源自环境微生物的天然产物已被证实是抗菌化合物的重要来源¹。大约80%的天然产物类抗生素来源于链霉菌属（Streptomyces）及其他放线菌，其余20%则由真菌物种产生¹。临床上使用的一些最常见抗生素骨架，如β-内酰胺类、四环素类、利福霉素类和氨基糖苷类，最初均从微生物中分离获得²。然而，由于多重耐药（MDR）细菌的出现，目前可用的抗生素在治疗中的有效性已逐渐降低^3,4。其中包括“ESKAPE”病原体（即耐万古霉素肠球菌以及耐β-内酰胺类的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii和肠杆菌属Enterobacter sp.），这些细菌被世界卫生组织等多个主要公共卫生机构认定为具有最高风险的病原体^3,4,

方案

1. 准备 E. coli 从斜面琼脂培养物制备甘油菌种库

1. 将 ARP/MARP E. coli 菌株从溶菌肉汤（LB）琼脂斜面接种到含有 LB 琼脂及相应选择标记物的培养皿中（表 1）。
2. 通过将单个菌落接种至含有相应选择标记物的 3 mL LB 培养基中，为每种 E. coli 菌株制备培养物。在 37 °C 下有氧培养过夜（250 rpm）。
3. 在 1.8 mL 冻存管中加入 800 μL 培养物和 200 μL 无菌的 80% 甘油。通过轻柔倒置混匀 3−4 次，于 -80 °C 保存。

2. ARP/MARP 冻存菌种库板的制备

1. 从第1节制备的甘油菌种中，将 ARP/MARP 菌株划线接种至含有 LB 琼脂及相应选择标记物的新培养皿中，在 37 °C 下过夜培养。
2. 采用无菌操作技术，从无菌储液中吸取 500 μL 阳离子调节的 Mueller Hinton 肉汤（MHB），加入无菌的 96 孔深孔板的每个孔中。
3. 使用步骤 2.1 中准备的平板，用接种棒根据 ARP/MARP 图谱（补充图 1 和 补充图 2）对 96 孔深孔板进行接种。确保向每孔中加入相应选择标记物。在深孔板表....

结果

当使用ARP和/或MARP对一组感兴趣的产抗生素菌株进行去重时，获得了以下结果。

ARP/MARP 去重复化工作流程的示意图见图1，文库板布局图见补充图1和补充图2。图2展示了一个阳性去重复化结果，其中环境提取物WAC 8921被鉴定为氯霉素产生菌。图3显示了ARP完全无生长的情况，表明样品中可能存在一种未被ARP/MARP文库板覆盖的未知抗生素或较为罕见的抗生素。图4展示了一种仅在MARPs中出现的独特生长模式，这是由于同时使用了野生型E. coli BW25113以及一种高通透性且外排缺陷的突变株E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC。该结果提示存在一种具有抗菌活性的化合物，但无法穿透完整的.......

讨论

上述方案既可用于发现新的抗菌化合物，也可用于发现能与现有抗生素联合使用以恢复其活性的增效剂。该平台利用耐药机制与其相应抗生素之间高度的底物特异性，对粗天然产物提取物中的化合物进行去重。尽管制备去重平板所需时间较长（约2周），但去重过程本身仅需一次过夜培养即可完成，相较于从粗提物中分离和表征化合物所需的时间，这一过程非常快速。此外，该平台无需昂贵或高度专业化的设备，因而具有良好的可及性和成本效益。

该平台的另一个主要优势在于其灵活性。ARP 可扩展以包含涵盖更多抗生素类别的耐药基因。通过监测文献中新型耐药酶的出现，并利用基本的分子克隆技术将这些基因添加到 E. coli 文库中，即可实现这一目标。此外，去重模板可根据用户在进行去重时所需的广谱或窄谱底物特异性程度进行定制。可使用 E. coli 文库中的任意基因组合构建新型文库平板，从而检测具有不同特征的化合物。例如，可开发表达 β-内酰胺酶的 E. coli 模板，以实现对 β-内酰胺类抗生素及其不同亚类的高特异性去重。

尽.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Bio Shop	AGR003.5
用于低温储存的 AlumaSeal CS 薄膜	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
氨苄青霉素钠盐	Bio Shop	AMP201.100
BBL 水解酪蛋白II肉汤（阳离子调节型）	Becton Dickinson	212322
BBL 植物蛋白胨（Soytone）	Becton Dickinson	211906
碳酸钙	Bio Shop	CAR303.500
酪蛋白氨基酸	Bio Basic	3060
棉签	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure 1.8 mL 混合色冻存管	Sarstedt	72.379.992
D-葡萄糖	Bio Shop	GLU501.5
一次性培养管，16 mm × 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
无水乙醇	Commercial Alcohols	P016EAAN
实心玻璃珠	Fisher Scientific	11-312C
甘油	Bio Shop	GLY001.4
盐酸	Fisher Scientific	A144-212
即时封口灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-54
七水合硫酸亚铁	Sigma-Aldrich	F7002-250G
硫酸卡那霉素	Bio Shop	KAN201.50
LB 肉汤（Lennox 型）	Bio Shop	LBL405.500
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore 膜滤器，0.45 µm 孔径	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 英尺卷装，亲水性，白色，无衬
96 孔圆底微量培养板	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray 单孔培养皿	Thermo Fisher Scientific	264728	带盖，无菌，未处理
带卡扣的 92 mm × 16 mm 培养皿	Sarstedt	82.1473.001
点样工具	ETH Zurich	-	定制订单
氯化钾	Fisher Scientific	P217-500
马铃薯淀粉	Bulk Barn	279
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-10
硝酸钠	Fisher Scientific	S343-500
木制涂布棒	Dukal Corporation	9000
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2