利用激光多普勒血流仪评估大鼠脑血流自动调节功能

摘要

本文展示了如何使用激光多普勒血流仪来评估脑循环在动脉血压降低期间自动调节其血流量的能力。

摘要

在研究机体调节脑血流的机制时，可采用激光多普勒血流仪（LDF）获得微循环血流的相对测量值。本文展示了一种闭颅准备方法，可在不穿透颅骨、不植入腔室或脑窗的情况下评估脑血流。为了评价自身调节机制，可采用分级放血实现可控性血压降低的模型，并同时应用LDF技术。该方法能够实时追踪因循环血容量减少所导致的动脉血压下降过程中脑血流的相对变化。这一范式是研究动脉血压降低期间脑血流自身调节的有价值方法，且通过对实验方案进行少量修改，也可作为出血性休克的实验模型。除了评估自身调节反应外，LDF还可用于在研究调节脑血流的代谢性、肌源性、内皮源性、体液性或神经性机制，以及各种实验干预和病理状态对脑血流影响时，监测皮层血流情况。

引言

脑循环中的自身调节机制在维持大脑稳态和正常功能中起着至关重要的作用。脑血流量的自身调节受到多种因素影响，包括心率、血流速度、灌注压、脑阻力动脉的直径以及微循环阻力，这些因素共同作用，使全脑脑血流量在全身动脉血压的生理范围内保持恒定。当动脉压升高时，这些机制会收缩小动脉和阻力动脉，以防止颅内压出现危险性升高；当动脉血压降低时，局部调控机制则会舒张小动脉，以维持组织灌注和氧气（O₂）的输送。多种病理状态，如高碳酸血症、创伤性或全脑缺氧性脑损伤以及糖尿病性微血管病变^1,2,3,4,5,6，可能破坏大脑调节其血流的能力。例如，慢性高血压会使有效的自身调节范围向更高血压水平偏移^7,8,9，而高盐（HS）饮食不仅会干扰脑微循环中正常的内皮依赖性舒张功能¹⁰，还会在动脉压降低时损害脑循环自身调节机制的舒张能力，从而影响组织灌注的维持¹¹。在喂食高盐饮食的Dahl盐敏感型大鼠中，脑自身调节功能同样受到损害¹²。

当动脉压降低时，脑阻力动脉和微动脉会扩张，最初可使脑血流量恢复至正常水平，尽管灌注压有所下降。随着动脉压进一步降低，脑血流量在较低压力下仍保持恒定（自身调节反应的平台期），直到血管系统无法再通过扩张来维持该压力下的血流量。器官能够维持正常血流量的最低压力称为自身调节的下限（LLA）。当压力低于LLA时，脑血流量显著低于静息状态下的水平，并随着动脉灌注压的每次降低呈线性下降^13,14。LLA上移（如在高血压中所观察到的情况）^7,8,9，可能在动脉灌注压降低的情况下（例如心肌梗死、缺血性卒中或循环性休克）增加缺血性损伤的风险和严重程度。

激光多普勒血流仪（LDF）已被证明是一种极为有价值的手段，可用于评估多种情况下微循环中的血流，包括脑循环中血流的自身调节^11,14,15。除了评估自身调节反应外，LDF 还可用于在研究调节脑血流的代谢性、肌源性、内皮源性、体液性或神经性机制，以及各种实验干预和病理状态对脑血流的影响时，监测皮层血流量^{10,16,17,18,19,20,21}。

激光多普勒流速仪（LDF）通过检测反射激光的偏移来测量运动颗粒（在此情况下为红细胞，RBC）的数量和速度变化。在脑血管自动调节研究中，可通过输注α-肾上腺素能激动剂升高动脉血压（因为脑循环本身对α-肾上腺素能缩血管激动剂不敏感）^12,15，或通过控制性放血减少血容量以降低动脉血压^11,14。本研究采用LDF技术，展示在健康大鼠中，血压分级降低对脑自动调节功能的影响。尽管文献中已有开颅和闭颅方法的描述^22,23,24,25，本文所展示的是闭颅准备方法，可在不穿透颅骨、不安装腔室或脑窗的情况下评估脑血流量。

方案

本研究中所述的所有方案均获得威斯康星医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，所有操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室（OLAW）的法规要求。

1. 实验动物与记录准备

1. 使用8–12周龄、体重250–300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。在这些实验中，给予大鼠标准饮食，其成分为0.4% NaCl、200 g/kg酪蛋白、3 g/kg DL-蛋氨酸、497.77 g/kg蔗糖、150 g/kg玉米淀粉、50 g/kg玉米油、50 g/kg纤维素、2 g/kg酒石酸胆碱、35 g/kg矿物质混合物和10 g/kg维生素混合物。
2. 使用数据采集软件或任何可比的记录方法记录动脉血压和激光多普勒血流（LDF）读数。
3. 将动脉压换能器连接至记录系统的一个通道，将LDF探头连接至记录系统的另一通道。
4. 在测量前，校准激光多普勒探头以设定运动性标准，并确保激光多普勒血流仪提供稳定的输出信号。
5. 准备实验前手术及实验过程中所需的其他设备：解剖显微镜、啮齿类动物呼吸机、呼气末CO₂监测仪、用于固定大鼠头部位置的立体定位仪，以及用于将LDF探头准确定位于软脑膜微循环区域并保持其位置稳定的微操纵器。

2. 手术准备

1. 称取大鼠体重，并在诱导室中使用3.5%异氟烷和30% O₂补充气体进行麻醉。
2. 将动物从诱导室中取出，换用面罩给予1.5–3%异氟烷，并辅以30% O₂补充。
3. 将大鼠置于维持在37 °C的循环水毯上，通过夹趾测试检查反射，确保存在回缩反射。双眼涂抹无菌眼膏，防止角膜干燥。
4. 剃除颅顶、腹侧颈部区域及股三角部位的毛发。清除这些区域的松散毛发，并用酒精擦拭清洁。
5. 将大鼠仰卧位放置在带有循环温水泵的加热垫上，以维持动物体温在37 °C，并使用医用胶带暂时将其固定在垫子上。
6. 通过颈部腹侧切口插入气管插管（PE240聚乙烯导管），具体操作如其他文献所述²⁶。
7. 将气管插管连接至呼气末CO₂监测仪和呼吸机，呼吸机提供2.5–3.0%异氟烷（根据动物体型调整）及30% O₂吸入补充。确保设置并监测呼吸频率、吸气时间和每分钟通气量，以在整个实验过程中维持呼气末CO₂浓度约为35 mmHg。
   注意：对于250–300 g的大鼠，通常设定呼吸频率为约48–60次/分钟，潮气量为1.70–2.30 mL，吸气时间为0.50–0.60秒，即可达到上述目标。
8. 用含1 U/mL肝素的等渗NaCl溶液填充两根PE50聚乙烯导管，以防止凝血并保持导管通畅。填充后，使用手术剪将每根导管的开口端斜剪成斜面，以便于插入动脉。
9. 按照其他文献所述方法²⁷对右侧和左侧股动脉进行插管，以便通过一根导管持续监测动脉压，同时从另一根导管抽取血液。
   1. 在解剖显微镜下小心分离动脉与周围组织后，结扎动脉远端，并在动脉中段和近端分别放置两根缝线，但暂不打紧。
   2. 将近端缝线作为提拉结扎线，用于在插入导管切开动脉后（步骤2.11）防止出血。
10. 将一根由回形针弯成的V形金属丝置于动脉下方，用于在导管固定前阻断血管。
11. 在解剖显微镜下，使用Vannas剪刀在股动脉远端结扎处附近做一个小切口。将导管的斜面端插入切口，并推进至股动脉内。收紧中段结扎线以固定导管，确保在移除提拉结扎线或回形针时导管不会因动脉压力而脱出。
12. 中段结扎线打紧后，松开提拉结扎线的张力和/或移除回形针，随后收紧近端结扎线。
13. 使用细缝线（3–0丝线）或外科缝钉关闭切口。或者，根据切口大小，也可在切口处覆盖湿润纱布。

3. 激光多普勒血流测量前的颅骨减薄

1. 导管放置到位后，立即将动物置于胸位，并用立体定位仪固定头部，注意避免移位导管或气管插管。
2. 使用手术剪在覆盖颅骨的皮肤上做一个椭圆形切口。用棉签清除任何结缔组织，确保颅骨清洁干燥。在头皮切口周围放置一小条细长卷起的纸巾，以止住出血。
3. 在解剖显微镜下，使用Dremel工具或牙科钻配合2.15 mm钻头，在顶叶左侧或右侧躯体感觉皮层上方的颅骨区域磨薄一小块骨面（面积约为0.5–1 cm，具体取决于大鼠大小）。
   警告：应缓慢且小心地磨薄颅骨，避免穿透颅骨。操作过程中应大量使用生理盐水，防止局部过热。
4. 当颅骨被磨薄至呈现粉红色外观和/或可见血管时，用矿物油覆盖该区域，并使用显微操作器将激光多普勒探头定位在暴露的脑微循环上方，使探头尖端刚好接触矿物油液面（图1）。
   注意：必须在无外界振动干扰的环境中进行激光多普勒血流（LDF）测量，以避免影响读数；且在整个实验过程中，探头必须牢固固定于同一目标区域。

4. 评估脑血管自身调节功能

1. 固定好激光多普勒血流探头后，需等待 30–45 分钟的平衡期，然后再开始实验。平衡期结束后，每 30 秒测量一次平均动脉压（MAP）和激光脑血流量（LCBF），持续 2 分钟，取平均值作为出血前血压和 LCBF 的基线值。
2. 为评估动脉压降低时脑血管的自身调节功能，需通过股动脉逐次抽取 1.5 mL 血液，并在每次抽血后测量 LCBF 和 MAP¹¹。为保持导管通畅，每次抽血后应注入与导管容积相近的肝素溶液（100 U/mL 生理盐水），以维持导管通畅。
   注意：在注入肝素溶液以维持导管通畅时，应尽可能使肝素溶液的体积与导管容积相匹配，以防止动物接受过多肝素而导致不必要的出血。
3. 每次抽血后，让大鼠平衡 2 分钟，随后每 30 秒记录一次 MAP 和 LCBF，持续 2 分钟。重复抽血操作，直至动物的 MAP 达到约 20 mmHg。
4. 通过确定从出血前 MAP 到 LLA 之间的血压范围（见下文步骤 4.5 和 5.3），来确定有效的自身调节范围。
5. 通过以下方法确定 LLA：找出在每次抽血后 LCBF 仍能恢复至出血前对照值 20% 范围内的最低血压值，如先前所述^11,28；或通过确定自身调节平台期与 LLA 以下阶段回归线的交点来确定 LLA，其中 LCBF 随每次连续抽血而下降（见下文步骤 5.3）。
   注意：不同实验室在定义 LLA 和自身调节平台的标准上可能存在差异（例如 Takada 等人²⁸ 与 Jones 等人²⁹），同时降低动脉血压的操作方法也可能不同（例如抽取特定体积血液 vs. 控制性出血以达到特定动脉压水平）¹¹。
6. 实验结束时，根据 IACUC 批准的方法，在动物处于外科麻醉深度下建立双侧气胸以实施安乐死。
7. 动物安乐死后在组织中测得的 LDF 值将作为实验系统的零血流基线值。

5. 统计分析

1. 进行线性回归分析，以评估激光多普勒血流（LDF）值与其相应动脉压之间的相关性。使用动物安乐死后获得的基线LDF读数，以确保测量的血流速率未受到非特异性LDF信号的影响。
2. 通过自调节平台区上方和下方的回归线交点计算低限自动调节（LLA）。采用此方法计算LLA时，需合并两条回归方程，并求解所得方程中的动脉压值。
3. 在比较不同实验组时，使用线性回归分析计算每只动物在LLA以上和以下的LDF与动脉压关系的斜率，并将各实验组动物的斜率结果以均值±标准误（SEM）的形式进行汇总。

结果

图2总结了在10只雄性Sprague-Dawley大鼠（饲喂标准实验室饲料）中进行的实验结果。在这些实验中，前三次抽血后，平均局部脑血流量（LCBF）维持在出血前水平的20%以内，直到平均动脉压降至LLA水平。当压力低于LLA后继续抽血，导致LCBF进行性下降，表明脑循环已无法产生足够的血管扩张，以在较低灌注压下维持脑血流量恒定。

图3总结了脑血流自动调节的平台期（平均动脉压 >65 mmHg）和失代偿期（平均动脉压 <65 mmHg）中平均动脉压与局部脑血流量（LCBF）之间的关系。在高于或等于下限自动调节阈值（LLA）的压力下，LCBF与动脉压之间无显著相关性（r² = 0.0246；p = 0.3534），表明在自动调节曲线的平台范围内，LCBF独立于动脉压。在低于LLA的压力下，LCBF与动脉压的关系呈负斜率，且两者显著相关（r² = 0.7907；p = 8.7 × 10^–25...

讨论

使用激光多普勒血流仪（LDF）评估组织血流反应。 如上所述，激光多普勒血流信号与微循环中运动颗粒（此处为红细胞，RBC）的数量和流速成正比。采用电磁血流计和放射性微球等既定方法评估的全器官血流量，与不同器官的激光多普勒血流读数具有良好的相关性。³⁰ 且通常与评估灌注动脉制备物中活性张力调节的研究结果一致^{10,31,32,33,34} 以及原位微循环制备^35,36.

在进行脑血流自身调节研究时（可能也包括其他血管床的自身调节研究），需要考虑的一个因素是麻醉对自身调节反...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 编织黑色丝线缝合线	中西部兽医	193.73000.2
动脉压传感器	Merit Medical	041516504A
自动化数据采集系统（WINDAQ） && BIOPAC 系统	DATAQ Instruments
血压显示单元	斯托尔廷	50115
循环温水泵	盖玛工业公司	T型泵
呼气末二氧化碳监测仪	斯托尔廷	Capstar-100
肝素钠	中西部兽医	191.46720.3
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
激光多普勒血流仪	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
激光多普勒血流灌注运动标准	Perimed	PF1001
聚乙烯导管（PE240）（用于气管插管）	VWR	63018-828
聚乙烯导管（PE50）（用于股动脉导管）	VWR	63019-048
啮齿类动物呼吸机	Cwe/Stoelting	SAR-830/P
生理盐水	中西部兽医会议	193.74504.3
斯普拉格-道利远交系大鼠	可变的	N/A	大鼠从多家公司订购
标准大鼠饲料	Dyets, Inc.	113755
立体定位仪	Cwe/Stoelting	经典实验室标准