一种非侵入性激光辅助角膜内皮细胞丢失实验模型的建立

摘要

本文介绍了一种使用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光从后弹力层（DM）上分离角膜内皮细胞（CEC）的实验方案，作为大泡性角膜病变（BK）的离体疾病模型。

摘要

Nd:YAG激光已用于无创眼内手术（如后囊切开术）数十年。其切割效应依赖于激光焦点处的光学击穿。在此过程中产生声学激波和空化气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量及焦点位置而变化。本研究将摘除的猪眼置于商用Nd:YAG激光器前方，测试了不同脉冲能量以及角膜后方不同焦点位置的影响。通过双光子显微镜和组织学方法评估所产生的损伤，以确定仅选择性剥离角膜内皮细胞（CEC）并造成最小附带损伤的最佳参数。该方法的优势在于对CEC的精确消融、附带损伤减少，以及最重要的——非接触式治疗。

引言

角膜的透明性对于光线传递至视网膜及其感光细胞至关重要¹。在此方面，相对脱水的状态对于维持角膜基质内胶原纤维的正确排列至关重要。这种稳态由位于后弹力层（Descemet’s membrane, DM）上的角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CEC）维持²。内皮层是角膜最内层，具有重要的屏障和泵功能，对维持角膜透明性至关重要³。与上皮层不同，内皮层无法自我更新⁴。因此，任何由疾病或外伤引起的细胞损伤都会刺激残留的内皮细胞增大并迁移，以覆盖形成的缺损区域，维持角膜功能⁵。然而，当CEC密度降至某一临界阈值以下时，内皮功能失代偿将导致角膜水肿，引起视力模糊、不适甚至剧烈疼痛⁴。尽管已有药物可缓解症状，但目前此类情况的唯一根治性治疗方法仍是角膜移植，该手术可采用全层移植或板层内皮移植的方式进行。后者包括后弹力层内皮角膜移植术（Descemet's membrane endothelial keratoplasty, DMEK）和后弹力层剥除自动内皮角膜移植术（Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK）⁶。然而，保护残存CEC并增强其存活率可能成为一种替代治疗策略，但该策略需要建立合适的疾病模型以评估潜在的治疗药物。

目前的角膜内皮细胞丢失疾病模型主要通过向眼前房注射毒性物质（如苯扎氯铵）或使用侵入性Descemet撕除技术机械刮除细胞，从而破坏内皮层^7,8。尽管这些模型已得到广泛建立，但仍存在诸如引发普遍炎症反应和造成非特异性附带损伤等缺点。因此，这些模型更倾向于代表疾病终末阶段的情况，此时上述手术治疗方案已不可避免。

随着干细胞和基因治疗等细胞治疗策略的进步，在角膜内皮细胞（CEC）丢失的早期阶段应用这些细胞疗法可能具有潜在价值⁹。因此，我们需要一个能更充分地模拟该疾病早期阶段的模型。在这方面，细胞培养模型在过去十年中已有改进，但其有效性仍存在局限，因为体外培养的细胞难以接近模拟角膜内不同类型细胞之间发生的复杂相互作用¹⁰。因此，离体（ex vivo）和在体（in vivo）疾病模型仍然需求迫切，改进现有模型具有重要意义。

自20世纪70年代末引入以来，利用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光通过光致破裂进行的非侵入性眼内手术已成为全球眼科医生的常规操作¹¹。光致破裂依赖于非线性光吸收，导致等离子体形成、声冲击波产生以及在液态环境中施用时产生空化气泡¹²。通常，这些过程有助于实现精确切割组织的预期效果。然而，它们也可能造成不必要的附带损伤，从而限制激光手术的局部局限性¹³。

通过表征冲击波传播和空化过程，对所产生的力学效应的预测已显著改善。我们的目标是在尽可能减少对周围组织损伤的情况下靶向角膜内皮细胞（CEC），从而为CEC丢失的早期阶段提供一种非侵入性、激光辅助的实验疾病模型。为此，必须确定激光脉冲能量的最佳值以及激光聚焦点的最优位置。

方案

所有涉及动物组织的操作均遵循当地动物护理与伦理委员会的指导方针。

1. 器官培养的准备与激光处理

1. 从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼。将其置于含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，并添加 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），于 4 °C 保存。该培养基在本文中简称为完全培养基。
2. 用剪刀去除眼外组织，将眼球在 5% 聚维酮碘眼用溶液中浸泡 5 分钟，随后置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中待用。
3. 使用谱域光学相干断层扫描仪（材料表）筛查眼前节主要病变，如角膜瘢痕、水肿及其他混浊。
4. 将眼球置于配备 Nd:YAG 激光器（材料表）的裂隙灯装置前，激光波长为 1,064 nm，在空气中的聚焦光斑直径为 10 µm。
   注意：为实现最佳定位，使用一个 3D 打印的固定装置，该装置设计用于稳固持握眼球，同时避免施加过大压力（图 1）。
5. 使用 12 倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜各层结构。
6. 设定脉冲能量（例如 1.6 mJ）和聚焦点（例如 0.16 mm），以实现对角膜内皮细胞的选择性消融。
7. 在靠近角膜缘处进行透明角膜穿刺，并注入粘弹剂（材料表），以稳定前房。
8. 使用 8 mm 角膜刀切除经激光处理的中央角膜区域。
9. 将切除的角膜组织置于 12 孔板的孔中，内皮面朝上，加入 3 mL 完全培养基，在 37 °C 条件下孵育最多 3 天。
   注意：在此步骤中，可向培养基中添加潜在的细胞保护剂。

2. 组织学准备

1. 配制 pH 为 7.4 的 Sorensen 缓冲液，其中包含 19.6 mL 的 133 mM KH₂PO₄ 和 80.4 mL 的 133 mM Na₂HPO₄。
2. 从含有角膜的孔中移除培养基，并在室温（RT）下使用 Sorensen 缓冲液中的无甲醇多聚甲醛（4%）固定组织 20 分钟。
3. 将组织置于含 20% 蔗糖的 PBS 中直至组织下沉（1 小时），随后在含 30% 蔗糖的 PBS 中于室温下过夜。注意避免组织接触气泡和气液界面。将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在 -80 °C 下保存。
4. 使用恒冷切片机在 -27 °C 下切取 10 μm 厚的切片。
   注意：可使用骆驼毛刷辅助引导切片越过刀刃。
5. 在切片后 1 分钟内，通过将载玻片接触组织的方式将切片转移至载玻片上，以避免组织冻干。将载玻片在 -80 °C 下保存。

3. 苏木精和伊红（H&E）染色

1. 将切片在空气中干燥数分钟，以去除水分。
2. 在50 mL离心管中，用过滤的0.1% Mayer苏木精染色10分钟。
3. 在Coplin染色缸中，用流动的冷水ddH₂O冲洗5分钟，然后浸入0.5%伊红溶液10次。
4. 浸入ddH₂O中，直至伊红不再出现条纹状，随后依次浸入50%（10次）和70%（10次）乙醇中。
5. 再依次浸入95%乙醇（30秒）和100%乙醇（60秒）中平衡，然后多次浸入二甲苯中。
6. 最后封片并加盖盖玻片，使用光学显微镜进行成像。

结果

采用本文所述方法，我们使用Nd:YAG激光器对眼睛进行处理，评估了不同脉冲能量（1.0−4.6 mJ）和焦点位置（距角膜后表面距离：0.0−0.2 mm），以确定最佳参数。每种激光参数组合（12 × 21）均进行多次重复实验（n = 3）评估。

除了上述方案外，在固定和H&E染色前，样本还使用双光子显微镜进行了分析。该双光子显微镜采用一种固态、锁模80 MHz Ti:sapphire激光器作为光源，其调谐范围为690−1040 nm，在800 nm处的平均激光输出功率>900 mW。显微镜向样本输送的脉冲宽度约为150 fs。图像使用显微镜物镜（20x/0.95）在730 nm波长和30 mW激光功率下采集。

两名审稿人独立审阅了双光子显微镜和光学显微镜图像，审稿人在不知晓实验条件的情况下，需将图像归入以下三类：（1）无损伤，（2）损伤过大，或（3）损伤程度适中（图2 和 图3）。根据他们的评估...

讨论

本初步研究的结果表明，当选择适当的能量剂量和焦点位置参数时，可以使用Nd:YAG激光选择性消融角膜内皮细胞。

由于内皮功能对维持角膜透明性以及防止角膜基质水肿具有重要意义，因此内皮功能障碍模型在抗水肿药物或手术方法的研发中发挥着重要作用。目前已建立多种体外模型用于模拟体内情况^10,14,15，但众所周知，体外模型无法完全模拟酶、细胞因子的影响以及细胞间相互作用的效应。相比之下，这种新开发的内皮细胞丢失的离体模型能够在自然环境中监测不同疾病状态及角膜失代偿过程。

由于本模型中的角膜在激光手术后使用角膜环钻切除，角膜的生理状态发生变化，类似于体外情况，区域间的相互作用受到显著阻碍。然而，局部界面仍保持完整，尤其是角膜内细胞与其他细胞之间的通讯得以持续。我们的研究显示，在这些条件下，角膜在体外培养中可维持功能达三天之久，这为观察和评估潜在治疗药物提...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巴伦真空环钻	Katena	K20-2058
冷冻切片机	Leica	CM 3050S
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 中等 - 高葡萄糖培养基	PAA	E-15009
眼固定器	自我	N/A
倒置显微镜	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	默克	529568
Na2HPO4	默克	1065860500
Nd:YAG 激光器	蔡司医疗技术	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetek	4583
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010056
猪血清	Sigma-Aldrich	12736C
光谱域光学相干断层扫描仪	海德堡工程公司	Spectralis
12孔组织培养板	Sarstedt	833921
双光子显微镜	JenLab	DermaInspect
粘弹性	OmniVision	Methocel