本文介绍了一种使用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光从后弹力层（DM）上分离角膜内皮细胞（CEC）的实验方案，作为大泡性角膜病变（BK）的离体疾病模型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Nd:YAG激光已用于无创眼内手术（如后囊切开术）数十年。其切割效应依赖于激光焦点处的光学击穿。在此过程中产生声学激波和空化气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量及焦点位置而变化。本研究将摘除的猪眼置于商用Nd:YAG激光器前方，测试了不同脉冲能量以及角膜后方不同焦点位置的影响。通过双光子显微镜和组织学方法评估所产生的损伤，以确定仅选择性剥离角膜内皮细胞（CEC）并造成最小附带损伤的最佳参数。该方法的优势在于对CEC的精确消融、附带损伤减少，以及最重要的——非接触式治疗。
引言
角膜的透明性对于光线传递至视网膜及其感光细胞至关重要1。在此方面，相对脱水的状态对于维持角膜基质内胶原纤维的正确排列至关重要。这种稳态由位于后弹力层（Descemet’s membrane, DM）上的角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CEC）维持2。内皮层是角膜最内层，具有重要的屏障和泵功能，对维持角膜透明性至关重要3。与上皮层不同，内皮层无法自我更新4。因此，任何由疾病或外伤引起的细胞损伤都会刺激残留的内皮细胞增大并迁移，以覆盖形成的缺损区域，维持角膜功能5。然而，当CEC密度降至某一临界阈值以下时，内皮功能失代偿将导致角膜水肿，引起视力模糊、不适甚至剧烈疼痛4。尽管已有药物可缓解症状，但目前此类情况的唯一根治性治疗方法仍是角膜移植，该手术可采用全层移植或板层内皮移植的方式进行。后者包括后弹力层内皮角膜移植术（Descemet's membrane endothelial keratoplasty, DMEK）和后弹力层剥除自动内皮角膜移植术（Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK）6
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物组织的操作均遵循当地动物护理与伦理委员会的指导方针。
1. 器官培养的准备与激光处理
- 从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼。将其置于含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，并添加 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），于 4 °C 保存。该培养基在本文中简称为完全培养基。
- 用剪刀去除眼外组织，将眼球在 5% 聚维酮碘眼用溶液中浸泡 5 分钟，随后置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中待用。
- 使用谱域光学相干断层扫描仪（材料表）筛查眼前节主要病变，如角膜瘢痕、水肿及其他混浊。
- 将眼球置于配备 Nd:YAG 激光器（材料表）的裂隙灯装置前，激光波长为 1,064 nm，在空气中的聚焦光斑直径为 10 µm。
注意：为实现最佳定位，使用一个 3D 打印的固定装置，该装置设计用于稳固持握眼球，同时避免施加过大压力（图 1）。 - 使用 12 倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜各层结构。
- 设定脉冲能量（例如 1.6 mJ）和聚焦点（例如 0.16 mm），以实现对角膜内皮细胞的选择性消融。
- 在靠近角膜缘处进行透明角膜穿刺，并注入粘弹剂（材料表
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
采用本文所述方法，我们使用Nd:YAG激光器对眼睛进行处理，评估了不同脉冲能量（1.0−4.6 mJ）和焦点位置（距角膜后表面距离：0.0−0.2 mm），以确定最佳参数。每种激光参数组合（12 × 21）均进行多次重复实验（n = 3）评估。
除了上述方案外，在固定和H&E染色前，样本还使用双光子显微镜进行了分析。该双光子显微镜采用一种固态、锁模80 MHz Ti:sapphire激光器作为光源，其调谐范围为690−1040 nm，在800 nm处的平均激光输出功率>900 mW。显微镜向样本输送的脉冲宽度约为150 fs。图像使用显微镜物镜（20x/0.95）在730 nm波长和30 mW激光功率下采集。
两名审稿人独立审阅了双光子显微镜和光学显微镜图像，审稿人在不知晓实验条件的情况下，需将图像归入以下三类：（1）无损伤，（2）损伤过大，或（3）损伤程度适中（图2 和 图3）。根据他们的评估.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本初步研究的结果表明，当选择适当的能量剂量和焦点位置参数时，可以使用Nd:YAG激光选择性消融角膜内皮细胞。
由于内皮功能对维持角膜透明性以及防止角膜基质水肿具有重要意义，因此内皮功能障碍模型在抗水肿药物或手术方法的研发中发挥着重要作用。目前已建立多种体外模型用于模拟体内情况10,14,15，但众所周知，体外模型无法完全模拟酶、细胞因子的影响以及细胞间相互作用的效应。相比之下，这种新开发的内皮细胞丢失的离体模型能够在自然环境中监测不同疾病状态及角膜失代偿过程。
由于本模型中的角膜在激光手术后使用角膜环钻切除，角膜的生理状态发生变化，类似于体外情况，区域间的相互作用受到显著阻碍。然而，局部界面仍保持完整，尤其是角膜内细胞与其他细胞之间的通讯得以持续。我们的研究显示，在这些条件下，角膜在体外培养中可维持功能达三天之久，这为观察和评估潜在治疗药物提.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Christine Örün 和 Jan A. M. Sochurek 在实验方法方面提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 巴伦真空环钻 | Katena | K20-2058 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM 3050S | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 中等 - 高葡萄糖培养基 | PAA | E-15009 | |
| 眼固定器 | 自我 | N/A | |
| 倒置显微镜 | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | 默克 | 529568 | |
| Na2HPO4 | 默克 | 1065860500 | |
| Nd:YAG 激光器 | 蔡司医疗技术 | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 10010056 | |
| 猪血清 | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| 光谱域光学相干断层扫描仪 | 海德堡工程公司 | Spectralis | |
| 12孔组织培养板 | Sarstedt | 833921 | |
| 双光子显微镜 | JenLab | DermaInspect | |
| 粘弹性 | OmniVision | Methocel |
参考文献
- DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
- Edelhauser, H. F. The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture. Investigative ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
