本实验方案的目的是融合两种不同的细胞类型以产生杂交细胞。通过荧光显微镜分析融合后的细胞，可追踪细胞器的来源细胞。该检测方法可用于研究细胞融合引起的扰动如何影响细胞结构与功能。
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本文内容
摘要
摘要
生命在脂质膜内实现空间上的区隔，从而允许细胞和细胞器内部形成独立的分子状态。细胞融合是指两个或多个细胞合并形成单个细胞的过程。本文提供了一种不同类型细胞间融合的实验方案。通过基于流式细胞术的分选富集融合后的杂交细胞，随后利用荧光显微镜观察杂交细胞的结构与功能。通过基因组编辑产生的荧光标记蛋白可在融合细胞内进行成像，从而根据荧光发射信号识别细胞结构，并追溯其来源细胞类型。这一稳健且通用的方法可应用于不同类型的细胞或特定细胞器，有助于回答一系列基础生物学问题中关于细胞结构与功能的研究。
引言
细胞结构的稳态维持对生命至关重要。细胞具有特征性的形态、细胞器数量以及内部生化组成。要理解这些基本特性如何形成，以及在疾病过程中如何发生异常，需要借助实验室工具对其进行干预。
细胞融合是指两个或多个独立细胞的合并。细胞融合可能对真核生物生命的起源至关重要1。在人体中，细胞融合相对罕见，仅发生在特定的发育阶段和组织类型中，例如受精过程、肌肉、骨骼以及胎盘的形成过程中2。本实验方案描述了在体外培养的细胞系中诱导细胞间融合的方法，其中细胞的细胞器被不同地荧光标记，以此作为研究调控细胞结构与功能机制的工具。
体外诱导的细胞间融合是单克隆抗体生产的核心技术3，而单克隆抗体是生物医学研究和疾病治疗的重要工具。细胞融合还被用于探讨多种基础细胞生物学问题，包括细胞周期的主导性4、非整倍性5，6、细胞重编程7，8、受损神经元的修复9、病毒增殖
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方案
1. 差异荧光细胞标记
- 利用 CRISPR Cas9 进行基因标记
- 使用 CRISPR Cas9 基因组编辑技术，在人源癌细胞系中将根丝蛋白（或其它目的基因）与荧光蛋白 meGFP 或 mScarlet-I 进行标记。
注意： 基因组编辑的详细方案在其他文献中有详细描述24,25,26。
- 使用 CRISPR Cas9 基因组编辑技术，在人源癌细胞系中将根丝蛋白（或其它目的基因）与荧光蛋白 meGFP 或 mScarlet-I 进行标记。
- 荧光染料标记
- 在含 10% 胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和 100 µg/mL 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 Cal51 人源癌细胞。
注意： 必须定期检测细胞是否无支原体污染，并确认细胞系的身份。避免使用长期传代的细胞（>15 代）。细胞应保持健康并处于指数生长期。避免细胞密度过低或过高。 - 接种每种细胞类型（rootletin-meGFP、rootletin-mScarlet-I 和未标记的亲本 Cal51 细胞），使每种样本在次日含有约 6 × 106 个细胞，细胞融合度为 70−90%。<....
- 在含 10% 胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和 100 µg/mL 青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 Cal51 人源癌细胞。
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结果
经适当标记的细胞在流式细胞术中可通过高于未标记对照细胞的荧光信号被检测到（图2A设定门控以分选双阳性细胞，直接富集至成像培养皿中，用于后续显微镜分析。融合细胞可被识别为具有明显双荧光阳性的细胞，约占细胞群体的约1%。
融合会通过将两个细胞合并为一个细胞，引起细胞结构的重大重排（图2B）。在显微镜下，异核体被识别为单个细胞内同时含有两种荧光染料信号的细胞（无中间质膜分隔）。此外，融合细胞中的两个细胞核可通过明场/微分干涉差或荧光成像观察到。需要注意的是，除了二倍体融合外，还可能存在三倍体或其他更高倍性的多倍体状态，因此应使用两种颜色的染料信号来确认融合细胞的身份。
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讨论
我们展示了一种简便且经济高效的细胞融合方法，并通过显微镜观察融合后细胞杂合体的结构，整个流程从开始到结束约需两天。该方案的关键步骤包括通过细胞分选富集融合细胞（方案第3部分），以及通过显微镜对融合细胞进行仔细验证（方案第4部分）。这些步骤可确保高效获得真正的异核体细胞。必须严格遵守试剂浓度和孵育时间。例如，若细胞染料浓度过高或孵育时间过长，在流式细胞术或荧光显微镜检测时可能导致信号过强，使检测器饱和，或根据成像条件引发串色干扰。在缺乏流式细胞仪的情况下，其他技术也可用于富集融合细胞，包括双抗生素筛选27和微流控捕获装置28。然而，这些技术要么速度较慢，要么需要更定制化的实验设置。
与其他细胞融合方法相比，本文所述方案各有优缺点。在某些情况下，电融合或基于病毒的融合技术可在融合过程中进行显微成像8,29，因此若需直接观察融合过程本身，这些方法是良好的替代选择。然而，这些不同.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由惠康基金会亨利·惠康研究员项目资助，资助号为 R.M.（https://wellcome.ac.uk/grant number 100090/12/Z）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中未发挥任何作用。我们感谢 Ashok Venkitaraman 和 Paul French 对本项目提供的关键性建议与指导。我们感谢剑桥医学研究所流式细胞术平台的 Chiara Cossetti 和 Gabriela Grondys-Kotarba 提供的出色支持。我们感谢 Liam Cassiday、Thomas Miller 和 Gianmarco Contino 对稿件的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% 甲醛溶液 | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 激光共聚焦 Airyscan 显微镜 | 卡尔·蔡司 | ||
| 8孔成像培养皿 | Ibidi | 80826 | |
| 抗GFP羊驼GFP增强纳米抗体 | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx 细胞分选仪 | BD 生物科学 | ||
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 细胞滤器（70 μm) | 生物膜 | CSS010070 | |
| CellTrace 远红 | 赛默飞世尔科技 | C34572 | |
| CellTrace Violet | 赛默飞世尔科技 | C34571 | |
| 高糖型DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium），含GlutaMAX和丙酮酸钠 | 赛默飞世尔科技 | 31966021 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I 骆驼单域抗体 | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 独立成像培养基 | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| 无酚红DMEM，高糖 | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| 磷酸盐缓冲液（1× PBS） | 8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2HPO4，dH2最多 1 L | ||
| 聚乙二醇 Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| 聚丙烯管 | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | 非离子型表面活性剂 |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | 非离子型去垢剂 |
参考文献
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
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重印与许可
