本文提供了一种通过核转染子孢子或第二代裂殖子实现鸡艾美球虫（Eimeria）寄生虫稳定转染的方法。表达外源抗原基因的基因修饰艾美球虫可作为疫苗递送载体。
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本文内容
摘要
摘要
转染是一种将遗传物质（如DNA和双链RNA）导入细胞以修饰目的基因的技术过程。目前，转基因技术已成为研究中不可或缺的工具 艾美球虫，家禽和家畜球虫病的致病原。本方案详细描述了艾美耳球虫的稳定转染技术：孢子子或第二代裂殖子的纯化与核转染，以及转染后寄生虫的体内扩增。利用本方案，我们成功实现了多种艾美耳球虫物种的转染 艾美球虫综上所述，核转染是促进艾美球虫寄生虫遗传操作的一种有用工具。
引言
Eimeria spp. 引起球虫病，导致畜牧业和家禽业遭受重大经济损失。尽管抗球虫药物以及一定程度上的减毒抗球虫疫苗已广泛用于球虫病的防控，但仍存在耐药性、药物残留以及疫苗株恢复毒力后扩散等缺陷1。随着分子生物学的发展，转染技术已成为研究 Eimeria 基因功能、开发新型疫苗以及筛选新药物靶点的重要工具。
近几十年来，转染技术已成功应用于顶复门寄生虫，如Plasmodium和Toxoplasma gondii2,3,4,5,6。一项利用β-半乳糖苷酶（β-gal）作为报告基因的研究，首次在E. tenella中实现了Eimeria属的转染实验7。随后，对E. tenella8,9、E. mitis<....
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方案
所有动物实验所用的鸡均按照中国农业大学机构动物护理和使用委员会指南进行饲养和管理，并遵循涉及动物的生物医学研究国际指导原则。实验经北京市实验动物管理委员会批准。
1. Eimeria 属（例如 E. tenella）孢子化子孢子的提取与纯化
- 孢子囊的释放
- 将 1 × 107 个孢子化的卵囊在重铬酸钾溶液（2.5%，m/v）中以 2,300 × g 离心 5 分钟。用 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤三次。
- 用 1 mL PBS 重悬沉淀物，并转移至 15 mL 离心管中。加入等体积的玻璃珠（直径范围为 1 mm × 1 mm），使用涡旋混合器振荡卵囊悬液以释放孢子囊。
- 每隔一分钟在显微镜下观察孢子囊的释放情况。当超过 90% 的卵囊破裂时，停止涡旋。
注：大多数卵囊（如 E. tenella、E. necatrix 和 E. acervulina）使用涡旋混合器处理 1 分钟后即可破裂。 - 将孢子囊悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中，以 1,600 × g 离心 5 分钟。
- 用 1 mL 50% 密度梯度溶液重悬沉淀物，合并至 1.5 mL 离心管中，以 10,000 ×
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结果
该方案已用于转染艾美耳球虫寄生虫。在本研究中，2nd 裂殖体和裂殖子的产生 E. necatrix 被展示在 图2A 和 图2B，而 图2C 和 图2D 显示了孢子囊和孢子子 E. tenella 使用密度梯度溶液后，卵囊的 E. necatrix (图3A）和 E. tenella (图3B子孢子转染后产生的第一代卵囊转染效.......
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讨论
20世纪90年代，人们开发出了一种用于顶复门寄生虫的转染系统，并将其应用于艾美耳球虫的研究。近年来，已成功实现对E. tenella8,9和E. nieschulzi15的稳定转染。我们通过转染第二代裂殖子实现了E. necatrix的稳定转染11。通过翅静脉接种转染后的E. acervulina子孢子，解决了E. acervulina子孢子无法通过泄殖腔途径接种的问题（Zhang等，未发表数据）。本文中，我们描述了一种详细的转染操作流程，以帮助研究人员对艾美耳球虫进行核转染。
既往研究表明，通过剖腹手术将转染后的子孢子注入兔肠腔，可实现对E. magna16和E. intestinalis
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致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（2017YFD0501200）和国家自然科学基金（31572507、31772728 和 31873007）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ATP二钠盐 | Sigma | A26209 | |
| 纤维素DE-52 | Solarbio | C8350 | |
| 恒流泵 | SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD. | HL-2B | |
| DMEM | MACGENE | CM15019 | |
| 玻璃珠 | Sigma | Z250473-1PAK | |
| 葡萄糖 | Sigma | No. V900116 | |
| 甘氨酸 | Biotopped | G6200 | |
| HBSS | MACGENE | CC016 | |
| KH2PO4 | Sigma | No. V900041 | |
| 低速离心机 | BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD. | DT5-2 | |
| 磁力搅拌器 | SCILOGEX | MS-H280-Pro | |
| MgCl2 | Sigma | 449164 | |
| MoFlo细胞分选仪 | BeckMan Coulter, US | 201309995 | |
| NaHCO3 | Sigma | 144-55-8 | |
| 核转染装置 | LONZA/amaxa | 90900012 (Nucleofector II) | |
| PBS | Solarbio | P1010 | |
| Percoll（密度梯度储备液） | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| 牛磺脱氧胆酸钠水合物 | Sigma | T0875 | |
| Sorvall Legend Micro 17 微型离心机 | ThermoFisher Scientific | 75002430 | |
| DMEM的组成：每升含4.5 g葡萄糖、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和25 mM HEPES。 | |||
| 胰蛋白酶 | Solarbio | T8150 | |
| 涡旋混合器 | Beijing North TZ-Biotech Develop.co. | HQ-60-II | |
| 水浴恒温器 | Grant Instruments (Cambridge), Ltd. | GD120,GM0815010 |
参考文献
- Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).
- Kim, K., Soldati, D., Boothroyd, J. C.
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重印与许可
