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方法文章

利用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）与细胞周期标志物结合在质谱流式细胞平台中确定细胞周期时相

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DOI：

10.3791/60556

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2021年10月22日

 , 
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

本文内容

摘要

本方案将细胞周期检测方法适配于质谱流式细胞技术平台。利用质谱流式细胞技术的多参数检测能力，通过直接测量碘的掺入可识别处于S期的细胞，同时借助细胞内周期标志物，能够在多种实验条件下对各细胞周期时相进行表征。

摘要

细胞周期时相的调控是细胞增殖与稳态维持的重要方面。细胞周期调控机制的失调是包括癌症在内的多种疾病的特征之一。对细胞周期的研究需要能够明确界定处于细胞周期各个阶段的细胞数量，并清晰区分各细胞周期时相。质谱流式细胞术（MCM）的出现，通过直接检测元素同位素，为高通量单细胞分析提供了巨大潜力；而建立一种利用MCM测量细胞周期状态的方法，进一步拓展了MCM的应用价值。本文描述了一种在MCM系统中直接检测5-碘-2′-脱氧尿嘧啶核苷（IdU）的方法，其原理类似于5-溴-2′-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）。该基于IdU的MCM方法具有多项优势：第一，IdU在DNA合成过程中可快速掺入，因此仅需10–15分钟的孵育即可可靠地检测处于S期的细胞；第二，IdU的检测无需使用二抗或DNA降解步骤；第三，IdU染色可轻松与细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）以及磷酸化组蛋白H3（pHH3）的检测相结合，从而共同实现对五个细胞周期时相的清晰划分。将这些细胞周期标志物与MCM所能实现的高参数数量相结合，可同时兼容多种其他检测指标。

引言

质谱流式细胞术利用质谱技术的高分辨率和定量特性，可实现约40个参数的检测。该技术采用金属标记抗体，取代传统荧光素偶联抗体，从而提供更多的检测通道，并显著减少信号溢出。1,2与流式细胞术相比，质谱流式细胞术（MCM）在细胞周期分析方面具有优势和局限性。MCM 的主要优势在于其能够通过大量参数，同时检测高度异质性样本中多种免疫表型不同的T细胞类型的细胞周期状态。MCM 已成功应用于检测人类骨髓中正常造血过程中的细胞周期状态。3 端粒酶缺陷的转基因小鼠模型4急性髓系白血病（AML）的细胞周期状态分析表明，细胞周期与已知的临床治疗反应相关，为体内功能特征提供了深入见解，有助于指导治疗方案的选择5质谱流式细胞周期分析的第二个优势在于能够同时检测大量其他功能性标志物，这些标志物可能与细胞周期状态相关。近期研究已通过使用碘脱氧尿苷（IdU）以及针对BRU和rRNA的金属标记抗体，实现了蛋白质和RNA合成水平与细胞周期状态之间的关联分析。6这种高度参数化的分析需要在连续分化过程中的多个细胞群体中测量细胞周期状态，而使用当前的流式细胞术技术几乎无法实现。质谱流式细胞术（MCM）的主要缺点是缺乏与荧光流式细胞术中常用的DNA或RNA染料（如DAPI、Hoechst、Pyronin Y等）相类似的染色剂。荧光染料能够相对精确地测量DNA和RNA含量，这种精确性之所以实现，是因为这些染料在插入核苷酸碱基之间时其荧光特性会发生改变。因此，MCM分析无法以同等精度直接测定DNA或RNA含量。相反，质谱流式细胞术的细胞周期分析依赖于对与细胞周期状态相关的蛋白质的检测，例如周期蛋白B1（cyclin B1）、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）和磷酸化组蛋白H3（pHH3），并结合对S期细胞中碘脱氧尿苷（IdU）掺入后所含碘原子的直接测量。这两种测量方法在正常细胞增殖过程中结果高度一致，但在细胞周期进程受到干扰时可能出现差异。

测定各细胞周期时相中的细胞数量，对于理解正常细胞周期发育以及细胞周期紊乱（常见于癌症和免疫系统疾病）具有重要意义。质谱流式细胞术（MCM）利用金属标记抗体可对细胞外和细胞内因子进行可靠检测；然而，由于基于铱的DNA嵌入染料无法区分2N与4N DNA，导致S期的检测受到限制。为明确界定细胞周期各时相，Behbehani开发了一种利用质量为127的碘脱氧尿嘧啶核苷（IdU）的方法，该质量处于质谱流式细胞仪的检测范围内，可直接测定处于S期的细胞3。这种直接检测方法避免了使用二抗或DNA变性试剂（如酸或DNase）的需要。结合细胞内周期标志物，该方法可在实验模型中实现对细胞周期分布的高分辨率分析。

本方案将常规流式细胞术用于MCM的细胞周期检测进行了改进。我们的方法提供了一种便捷且简单的手段，可将细胞周期参数纳入实验分析。体外样本的IdU掺入仅需在37 °C孵育10至15分钟，时间短于大多数BrdU染色方案，后者通常建议孵育数小时3,7。掺入IdU或BrdU的样本可使用蛋白质组稳定剂进行固定，随后可在-80 °C冰箱中长期保存。这使得大量IdU染色样本能够被归档并进行批次分析，且不会降低样本质量。

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方案

1. IdU 储存液的制备

  1. 将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）溶于DMSO中，配制成50 mM的溶液。经无菌过滤后，分装至10–50 µL离心管中，于-80 °C保存。
  2. 从冷冻箱中取出IdU，在室温下解冻。用RPMI-1640培养基稀释IdU，制备终浓度为1 mM的工作液。通过反复吹打或涡旋混匀。
    1. 通常将浓缩的IdU稀释至细胞培养所用的培养基中（例如DMEM、IMDM等），或将其稀释于PBS中，以便直接加入外周血或骨髓穿刺样本。此预稀释步骤有助于DMSO与目标细胞所处的水相培养基充分混合。
      注意：孵育过程中IdU的终浓度应为10 µM；可将1 mM的溶液以每1 mL培养基加入10 µL的比例添加。

2. IdU 孵育与样品保存

  1. 将样品置于37 °C、加湿的培养箱中孵育。从培养箱中取出样品，并转移至生物安全柜中。
  2. 向每1 mL样品中加入10 µL的1 mM IdU。
    1. 对于6孔板，向每孔中的3 mL培养基中加入30 µL的1 mM IdU。IdU也可直接用于骨髓穿刺液以及小鼠研究4。
  3. 将样品重新放回37 °C培养箱中孵育10–15分钟。在IdU孵育期间，保持细胞处于最佳生长条件下，以获得最准确的S期测量结果。
  4. IdU孵育结束后，取出样品并转移至锥形管中。
  5. 在室温下以400 × g 离心10分钟。
  6. 吸除上清液，并用200 µL PBS重悬细胞。
    1. 如需要，可在该步骤进行活/死细胞染色（使用顺铂）以在固定和冷冻前标记死细胞。
      注意：铑标记的活/死细胞染色在甲醇透化后效果不佳，因此不推荐用于细胞周期分析。
  7. 向PBS中加入18.75 µL的16%多聚甲醛（PFA），使终浓度为1.5% PFA。室温孵育10分钟。然后在室温下以400 × g 离心10分钟。
  8. 吸除PBS/PFA溶液，并将样品重悬于500 µL细胞染色缓冲液（CSM；含0.5% BSA和0.02%叠氮化钠的1× PBS）中，加入10% DMSO，再进行冷冻。
    1. 若使用商用蛋白质组稳定剂，向重悬于200 µL PBS中的样品中加入280 µL蛋白质组稳定剂（1:1.4）。室温孵育10分钟后，直接放入-80 °C保存。
      注意：研究表明，IdU在37 °C孵育10–15分钟内即可有效掺入。IdU孵育时间超过10–15分钟会逐渐降低S期和G2期细胞群的分辨率，因为被IdU标记的细胞会离开S期并进入G2期或M期。我们还观察到，长时间孵育IdU可能导致细胞死亡及细胞周期假象。后续的细胞处理和抗体染色步骤足以洗去未掺入S期细胞中的残余IdU。使用本实验方案时，我们未观察到显著的碘背景信号；然而，在极少数临床样本中曾观察到碘污染，可能来源于医疗操作（如CT扫描中的碘造影剂）或含碘药物。若发现大量IdU背景信号，不应上机检测，以避免对质谱流式细胞仪检测器造成损害。

3. 质谱流式细胞术样本染色

  1. 从 -80 °C 取出样本，待其解冻后再进行表面染色。
    1. 若使用 SmartTube 固定方法，需在 0-4 °C 下解冻样本，以避免样本升温过程中发生额外固定。
  2. 样本解冻后，将约 100 万至 200 万个细胞转移至 5 mL FACS 管中。
  3. 以 600 × g 离心 5 分钟，并用细胞染色缓冲液（CSM）充满 FACS 管以洗涤细胞，重复此步骤一次。
    1. 若已知细胞易发生聚集，可在 CSM 洗涤液中加入 400 U/mL 肝素以防止细胞间接触，但此步骤并非严格必需。
  4. 加入 FC 封闭剂，每 100 µL 细胞悬液中加入 5 µL 封闭剂，在室温下孵育 10 分钟。
  5. 配制用于染色细胞表面或细胞外部分的抗体混合物。每次检测中，每 100–200 万个细胞的总染色体积为 100 µL。染色混合物中的 CSM 和肝素应根据鸡尾酒配方和 FACS 管中的总体积进行相应调整。
    注意：此步骤中加入 CSM 可减少非特异性染色伪影8。该染色混合物的具体组成完全取决于研究目标和细胞表面表型（例如，T 细胞相关研究将使用 CD45、CD3、CD4、CD8 等表面标记组合）。有关样本处理与染色的详细方案，可参见 Behbehani 和 McCarthy 等人的文献9,10。
  6. 将表面染色混合物加入细胞中，在室温下持续振荡孵育 30–60 分钟。
  7. 染色完成后，用 CSM 充满 FACS 管，并以 600 × g 离心 5 分钟。
  8. 再用 CSM 洗涤两次，每次以 600 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。
  9. 通过加入含 10% CSM 和 1.5% PFA 的 1 mL PBS 来固定细胞外抗体。
  10. 用 CSM 充满含有 PBS/CSM/PFA 混合液的 FACS 管，以 600 × g 离心 5 分钟后吸除上清液。
  11. 加入 -20 °C 的甲醇。
  12. 涡旋震荡样本 1–2 分钟，以获得单细胞悬液，并确认所有细胞团块均已重新悬浮。
  13. 在样本缓慢涡旋过程中，使用带滤芯吸头的 1000 µL 移液器迅速加入 1 mL 冰冷甲醇。
  14. 将 FACS 管置于光源前检查，确保无可见团块；出现浑浊属正常现象。任何残留团块将导致样本无法用于后续 MCM 分析。
  15. 将样本在 -20 °C 下保存 10–20 分钟。
  16. 在此期间配制细胞内染色混合物。该混合物的具体组成取决于研究目标。若进行细胞周期分析，应在染色混合物中包含 CyclinB1、pRb、Ki67 和 pHH3，也可根据需要添加其他细胞内标记物。
  17. 在 -20 °C 孵育 10–20 分钟后，取出样本，加入 1.5 mL PBS，并用 CSM 补足体积。
  18. 以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。
  19. 再用 CSM 洗涤两次，每次以 600 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。
  20. 最后一次 CSM 洗涤后，离心样本并保留约 50 µL 残余液体。
  21. 向样本中加入已配制的抗体混合物（通常加入 50 µL 抗体染色鸡尾酒，使最终染色体积达到 100 µL），在振荡平台上室温孵育 30 至 60 分钟。
  22. 染色完成后加入 CSM，并以 600 × g 离心 5 分钟。
  23. 吸除 CSM，再次用 CSM 洗涤，以 600 × g 离心 5 分钟，吸除 CSM 后加入 PBS。
  24. 完成细胞内染色后，将细胞置于一种嵌入剂溶液中，该溶液可将抗体固定于细胞并染色每个细胞的 DNA，从而实现细胞识别。嵌入剂溶液中含有非同位素纯的铱嵌入剂（五甲基环戊二烯基-Ir(III)-二吡啶并菲嗪），由厂家储备液加入，终浓度为 500 µM。将铱储备液按 1:4000 比例稀释于含 1.5% PFA 的 PBS 溶液中。每百万细胞加入 100–200 µL 铱嵌入剂溶液，以实现均匀染色并避免过度染色。
    注意：该嵌入剂溶液中的铱用于单细胞门控识别，不应作为活/死细胞染色使用。如需进行活/死细胞染色，应在固定前完成，具体操作参见 McCarthy 等人文献9。
  25. 将样本置于嵌入剂溶液中，于 4 °C 冰箱中保存，最长可保存两周，之后进行 CyTOF 检测。

4. 质谱流式细胞仪操作

注意：质谱流式细胞术的操作可能因仪器型号而异。操作前务必查阅CyTOF用户手册。此外，目前JoVE已有两篇关于仪器启动和维护的文章9,11。

  1. 在操作质谱流式细胞仪之前，检查雾化器是否存在堵塞、裂纹或其他异常情况。
  2. 将雾化器连接至细胞仪，并开始预热程序。未安装雾化器时，不得启动质谱流式细胞仪。
  3. 质谱流式细胞仪完成预热后，用水冲洗样品管路。喷雾室需升温至约 200 °C 后，方可进行调谐或样品分析。
  4. 用水冲洗 5–10 分钟。5–10 分钟后，加载调谐液并选择调谐管理器。调谐液是含有固定浓度金属的溶液，用于在样品采集前优化质谱流式细胞仪性能。
  5. 在调谐管理器中，当调谐液达到稳定的信号记录状态时，选择 预览，以启动自动调谐过程。
  6. 调谐完成后，将水加载至进样器，并在样品处理期间让水持续流经样品管路。有关质谱流式细胞仪日常操作与调谐的详细方案，请参见 Leipold11。
  7. 有时自动调谐无法使仪器达到最佳性能，可重复调谐步骤以纠正此问题。
  8. 在样品采集前，先用 CSM 洗涤一次，再用纯去离子水洗涤两次。用水洗涤对于去除 PBS/CSM 中残留的盐分至关重要。
  9. 使用制造商提供的平衡微珠（即负载已知金属浓度的聚苯乙烯微珠）检查灵敏度和样品流速。
  10. 将采集模式从调谐模式切换至事件捕获模式。将采集时间上限设为 120 秒。在点击 记录 前，等待 45 秒。
  11. 质谱流式细胞仪将在 120 秒后自动停止样品采集。使用雨滴图查看器检查 Eu151 和 Eu153 的信号强度。
  12. 用纯去离子水按 1:20 的比例稀释平衡微珠。
  13. 在样品采集前检查实验管理器。使用实验管理器为通道命名，并添加需要记录的通道。
    1. 若使用 IdU，需确保已添加 127-I 通道。
    2. 请注意，必须在样品采集前将质谱流式细胞仪设置为检测所需参数（例如 IdU）。若未提前选择通道，则无法采集未选通道的数据，且数据不可恢复。
  14. 使用 1:20 的纯去离子水与平衡微珠混合液，将细胞稀释至浓度约为 1–2 × 106/mL。将细胞通过装有滤膜的 FACS 管过滤，以去除任何残留的细胞团块。
  15. 加载样品并更改采集时间。
  16. 按下 预览，等待每秒事件数稳定。
    1. 每秒事件数不得超过 400 个，否则将产生大量双联体和碎片。我们通常采集至少 20,000 至 50,000 个细胞事件，但最佳数量取决于实验设计。对多达 200 万个细胞进行染色，通常可获得 300,000 至 400,000 个细胞事件。请注意，并非所有事件均为细胞（事件计数中还包括碎片和微珠事件）。
  17. 样品采集完成后，加载清洗液，启动样品进样并运行 5–10 分钟。5–10 分钟后停止样品进样，再用水运行 10–20 分钟。清洗液为低浓度氢氟酸溶液，旨在清除样品管路中残留的金属。
  18. 关闭质谱流式细胞仪并取下雾化器。雾化器温度较高，操作时需小心。

5. 数据分析

  1. 为了去除微珠并校正样本采集过程中的信号漂移，使用 Fluidigm 软件或 Finck 开发的应用程序对 FCS 文件进行归一化处理12。
  2. 将 FCS 文件上传至 Cytobank 或其他流式细胞术分析软件。FCS 文件可在任何兼容软件中使用，但本实验方案中的所有设门及后续分析均在 Cytobank 中完成13。
  3. 在绘制细胞周期门之前，需排除双联体或细胞碎片，以避免其对下游分析造成干扰。可通过事件长度（Event Length）与 191-Ir 的双变量图进行排除（图 1a）。细胞会形成一个明显且明亮的 Irhigh 单一群体，可用于排除双联体和碎片。此即为单细胞门（singlet gate）。该设门方法通常可去除约 50–60% 的双联体事件，因此可能需要额外策略以进一步清除残留的双联体事件。
    1. 调整事件长度的标度（最小值和最大值），使细胞群体更加突出，便于单细胞设门。
    2. 通过高斯参数（Gaussian parameters）残差（Residual）和偏移量（Offset）进一步去除双联体和碎片。残差较高而偏移量较低的信号也代表碎片和双联体，围绕该群体设门可进一步清除双联体和碎片（图 1b,c）。
  4. S 期设门——S 期是最容易绘制但也是最重要的门。使用 IdU 与 pRb、Ki67 或 cyclinB1 的双变量图进行 S 期门的绘制。在这些双变量图中，S 期 IdU+ 细胞会形成一个明显的群体（图 2b）。
  5. G0/G1 期和 G2/M 期设门——在 IdU 与 CyclinB1 的图上建立 G0/G1 期和 G2/M 期门，其中 IdU 的掺入对于确定 G0/G1 期与 G2/M 期门之间的边界至关重要。G0/G1 期细胞表现为 CyclinB1low/IdU-，而 G2/M 期细胞表现为 CyclinB1high/IdU-。良好的 CyclinB1 染色会在 G0/G1 和 G2/M 群体之间显示出一个自然的过渡群体；然而，该特征会因实验条件下的样本类型和细胞类型不同而有所变化。在细胞周期分布可能受到影响、CyclinB1 标记的 G0/G1 期与 G2/M 期之间分离不明显的情况下，利用 S 期群体可为特定细胞类型在每次实验中提供一致的设门依据。具体方法如下所述。
    1. 仅将 S 期细胞绘制在 CyclinB1 与 IdU 的图上，以帮助明确 G0/G1 期与 G2/M 期之间的分界。在 CyclinB1high 群体上绘制一个门，并调整至大约 S 期群体顶部的 5% 位于门内（图 2c）。这即确立了 G0/G1 期与 G2/M 期门之间的分界点（图 2e,f）。将活动群体切换为目标群体，位于此前门内的部分即为 G2/M 期群体，其余部分则为 G0/G1 期群体。
  6. G0 期设门——在 pRb 与 IdU 的双变量图上建立 G0 期门。G0 期由 pRblow/IdU- 群体表示。活跃增殖的细胞群体则表现为 pRb 高表达并掺入 IdU，G0 期门可绘制在该边界上，因其通常形成两个明显不同的群体（图 2g,i）。
    1. 通过将先前绘制的 S 期群体（图 2b）设为活动群体，并绘制一个包含 pRbhigh 群体顶部 90–100% 的门来定义 G0 期。此即 pRb+ 增殖群体（图 2i），位于该门之外的 pRblow 群体即为 G0 群体（图 2j）。
    2. 若 pRb 不可用或无法检测，可使用 Ki67 与 IdU 的双变量图来确定 G0 期群体。绘制一个代表大部分 S 期群体的门，并以此门作为 Ki67 与 IdU 图的边界，其余群体即为 G0 期（图 3a）。
  7. M 期设门——在 IdU 与 pH3 的双变量图中建立 M 期门。M 期细胞仅占极小比例，通过 pH3high 群体进行设门（图 2d）。
  8. IdU 掺入失败或不可行——若无法使用 IdU，可通过 Ki67 和 pRb 来定义增殖与非增殖细胞群体。在正常条件下，Ki67 和 pRb 会形成两个明显不同的群体：Ki67high/pRbhigh 和 Ki67low/pRblow。双阳性群体代表活跃增殖细胞，对应于 G1 期、S 期、G2 期和 M 期；双阴性群体代表非增殖细胞，对应于 G0 期（图 3b）。
    注意：使用 Ki67 与 pRb 无法区分各个具体的细胞周期阶段，但可评估实验处理对增殖与非增殖细胞群体比例的影响。
  9. 细胞周期分析——在完成设门后，导出各门的数值以进行进一步分析。各周期阶段的百分比可通过从联合群体中减去单一群体获得。例如，将 G0 期（基于 pRblowIdUlow 门）的百分比从 G0/G1 期（基于 CyclinB1lowIdUneg 门）中减去，即可得到 G1 期的百分比。类似地，G2 期百分比可通过从 G2/M 期门中减去 M 期门的百分比获得。由此可获得每个独立细胞周期阶段（G0、G1、S、G2 和 M）的数值，这些数值可用于后续分析，如作图和统计学分析。

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结果

利用HL-60细胞和人骨髓穿刺液，可以展示实验条件如何影响细胞周期分布及分析。首先，必须建立设门策略，以说明细胞周期各时相是如何确定的。在 图1 我们展示了单细胞门控的建立，该步骤对于分离细胞碎片和双联体细胞、获得单细胞群体至关重要。对于细胞系而言，建立单细胞门控后即可直接进行细胞周期分析。图 2a）。对于人源样本，通常需要在细胞周期分析之前确定免疫表型群体，因为不同细胞类型的各个细胞周期门控边界可能有所不同。一旦确定了目标群体（通常通过设门特定表面标志物来定义该群体），就需要建立相应的细胞周期门控。 图2b 在IdU与CyclinB1双轴图上展示S期的确定方法。该图还用于确定G2/M期门控的边界图 2f）。一旦确立G2/M期，其余部分即为G0/G1期门控（图 2f）。IdU 与 pRb 的比较用于确定 pRb+ 通过建...

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讨论

本文展示的示例说明了如何使用 MCM 平台分析细胞周期分布。同时已证明，细胞周期分析对实验条件（如时间和温度）具有敏感性，这是研究人员在考虑将 MCM 用于细胞周期分析时必须重视的因素14。样本在储存条件下停留较短时间（不超过一小时）时，其 IdU 掺入水平与正常状态相当；而在密闭系统中长时间存放（约两小时）的样本，其 IdU 掺入量会降低，但循环与非循环细胞的比例仍保持不变，因此仍可进行粗略的细胞周期分析。深低温储存及后续的解冻过程会在较长时间内显著干扰正常的细胞周期分布。此前已有报道指出深低温储存会破坏蛋白质和 RNA 的分布，而最近的研究进一步表明其同样会干扰细胞周期14,15,16,17。综上所述，若预计需要长期储存或采用深低温保存样本，则最好在储存或深低温冷冻前先用 IdU 对细胞进行染色，随后固定细胞并保存，直至进行分析。由...

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披露

Behbehani 博士获得 Fluidigm 提供的差旅资助。Fluidigm 还为实验室采购了试剂和材料。

致谢

作者谨此感谢Palak Sekhri、Hussam Alkhalaileh、Hsiaochi Chang和Justin Lyeberger在实验方面提供的支持。本研究由Pelotonia研究员项目资助。本文所表达的观点、发现和结论均为作者（们）的观点，不一定反映Pelotonia研究员项目的立场。"

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA3059CSM 的组分
离心机Thermo Scientific75-217-420样品离心
裂解-PARP（D214）BD BiosciencesF21-852凋亡细胞的鉴定
细胞周期蛋白 B1BD BiosciencesGNS-1G2 期解析
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD2650冷冻保护剂
EQ 四元素校准微球Fluidigm201078CyTOF 性能的内部金属标准品
带滤网的 FACS 管Corning08-771-23在 CyTOF 运行前去除细胞团块/碎片的细胞滤器
胎牛血清（FBS）VWR97068-085细胞培养生长补充剂
HeliosFluidigmCyTOF 系统/平台
肝素SigmaH3393防止非特异性染色的染色添加剂
IdU（5-碘-2′-脱氧尿苷）SigmaI7125在 S 期掺入 DNA
Ki-67eBiosciencesSolA15确认 G0/G1 期
MaxPar 多重标记试剂盒Fluidigm201300金属标记试剂盒，用于将金属连接至抗体
微孔板振荡器Thermo Scientific88880023染色过程中混合样品
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Services15710固定剂
五甲基环戊二烯基-铱(III)-二吡啶并菲嗪Fluidigm201192CyTOF 检测过程中的细胞识别
p-H2AX（S139）MilliporeJBW301DNA 损伤检测
p-HH3（S28）BiolegendHTA28M 期解析
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190-144细胞培养洗涤液及固定液组分
p-Rb（S807/811）BD BiosciencesJ112906G0/G1 期解析
蛋白质组稳定剂SmartTube IncPROT1样品固定剂
RPMI 1640Gibco21870-076细胞培养生长培养基
叠氮化钠Acros OrganicsAC447810250CSM/抗体缓冲液组分，杀菌剂

参考文献

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