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方法文章

冠状动脉血管生成的体外模型

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DOI:

10.3791/60558

2020年3月10日

本文内容

摘要

冠状血管生成的体外模型可用于揭示冠状血管生成的细胞和分子机制。静脉窦和心内膜组织的体外植块培养在VEGF-A刺激下表现出显著的生长,并显示出与体内相似的COUP-TFII表达模式。

摘要

本文介绍了一种用于研究冠状血管生成的体外培养实验方法。冠状血管为心肌供血,具有重要的临床意义。这些血管的缺陷会带来严重的健康风险,例如动脉粥样硬化,可能导致患者发生心肌梗死和心力衰竭。因此,冠状动脉疾病是全球主要的死亡原因之一。尽管其临床重要性显著,但关于如何再生受损冠状动脉的研究进展仍然相对有限。然而,近年来在理解冠状血管发育的细胞来源及其分化通路方面已取得一定进展。研究工具和技术的发展使科研人员能够对前体细胞进行荧光标记,追踪其命运,并在体内可视化其子代细胞,这些技术对阐明冠状血管发育机制起到了关键作用。体内研究具有重要价值,但在实验设计的速度、可及性和灵活性方面存在局限性。相比之下,精确的体外冠状血管生成模型可克服这些限制,使研究人员能够更快速、灵活地探究重要的生物学问题。缺乏合适的体外模型系统可能阻碍了人们对冠状血管生长过程中细胞与分子机制的理解。本文中,我们描述了一种体外培养系统,可用于从静脉窦(SV)和心内膜(Endo)这两种主要冠状血管前体组织中培养出冠状血管。我们还证实,该培养系统能够准确重现一些已知的体内发育机制。例如,我们发现,来自静脉窦的血管生成芽在培养中会下调COUP-TFII的表达,这与体内观察到的现象一致。此外,我们证明了VEGF-A(一种在体内已被广泛认知的促血管生成因子)能够显著促进静脉窦和心内膜来源的培养组织中的血管生成。综上所述,我们建立了一种精确的体外培养模型,可用于研究冠状血管生成。

引言

心脏的血管通常被称为冠状血管。这些血管由动脉、静脉和毛细血管组成。在发育过程中,首先形成高度分支的毛细血管,随后这些毛细血管重塑为冠状动脉和静脉1,2,3,4,5。这些初始的毛细血管由位于心外膜前体组织(proepicardium)、静脉窦(SV)和心内膜(Endo)组织中的内皮祖细胞构建而成1,6,7,8。静脉窦是胚胎心脏的流入道结构,而心内膜是心腔的内层衬里。来源于静脉窦和心内膜的内皮祖细胞构成了冠状血管系统的大部分,而心外膜前体组织仅贡献相对较小的部分2。冠状血管的毛细血管网络由已存在的前体细胞在心脏中生长发育的过程称为冠状血管生成(coronary angiogenesis)。冠状动脉疾病是全球主要的死亡原因之一,但目前仍缺乏有效的治疗方法。深入理解冠状血管生成的详细细胞与分子机制,有助于设计新型且有....

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方案

本方案中所有动物的使用均遵循鲍尔州立大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指导原则。

1. 建立小鼠繁殖对并检测阴道栓以确定定时妊娠

  1. 设置一个用于小鼠繁殖的笼子,放入野生型雄性和雌性小鼠。确保繁殖用小鼠的年龄在6至8周之间。可采用配对方式(1只雄性与1只雌性)或三只组合方式(1只雄性与2只雌性)进行繁殖。
  2. 次日早晨检查阴道栓。使用斜面金属探针插入阴道开口,以检测深部栓塞。将发现阳性阴道栓的当天早晨定为胚胎发育0.5天(e0.5)。
    注意:阴道栓可分为表浅型(易于观察,见图1)和深部型(不易观察)。若存在深部栓塞,探针无法完全插入;若无栓塞,则探针可无阻力地完全插入。
  3. 维持定时妊娠,直至胚胎发育至e11.5阶段,随后进行胚胎采集。在采集胚胎前,为确认是否妊娠,应在e7.5至e11.5期间记录雌性小鼠的体重变化。
    注意:母鼠体重每日增加表明妊娠成功,而体重无变化则提示妊娠失败。

2. 从怀孕小鼠中采集胚胎

注意:开始前,请确保备齐以下仪器和试剂:CO2 安乐死舱、70% 乙醇、纸巾、普通镊子、精细镊子、剪刀、1× 无菌磷酸盐缓冲液(PBS)、10 cm 无菌培养皿、装有冰的容器、带孔....

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结果

SV 血管生成在体内的一个最显著特征是,它遵循特定的路径,并涉及细胞去分化和再分化事件,这些事件在典型的时间和位置发生1。当初始的 SV 细胞生长至心脏心室时,它们停止产生静脉标志物,例如 COUP-TFII(图 7)。随后,冠状血管 sprout 采取两条迁移路径,一条沿心脏表面迁移,另一条深入心肌层内。表面血管最终发育为静脉,而侵入性血管则形成动脉和毛细血管1,6,7。随着心脏的生长和冠状血管系统的扩展,这种区别得以维持。

为了促进冠状动脉发育分子机制的研究,我们建立了一种体外静脉窦(SV)出芽模型,可用于基因功能缺失和功能获得实验。从小鼠胚胎心脏中分离出静.......

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讨论

成功从SV和内皮祖细胞组织中培养冠状血管的最关键步骤包括:1)正确识别并分离SV组织用于SV培养;2)使用胚胎年龄为e11至e11.5天之间的心室组织以获得准确的内皮细胞培养;3)在整个解剖过程中保持无菌条件,并始终将组织保持在低温状态;4)使外植体保持附着在ECM包被的膜上,以避免组织在培养基中漂浮。

首先,分离静脉窦(SV)组织可能具有挑战性。需要注意的是,静脉窦位于心脏背侧、左心房与右心房之间,隐藏于肺叶内部,因此难以直接分离和获取。取而代之的是,应先完整取出心脏与肺组织的联合标本(pluck)。随后,借助精细镊子小心去除肺叶并清理周围邻近组织,从该标本中分离出静脉窦。此外,在清理邻近组织时必须格外小心,以免丢失静脉窦组织。

其次,为了准确研究心内膜血管生成,培养胚胎年龄不超过 e11.5 的心室至关重要。在 e12.5 及更晚期的胚胎中,静脉窦(SV)来源的冠状血管已生长至心室的相当大比例区域。因此,来自较晚期心室的冠状血管可能同时包含静脉窦来源和心内膜来源的血管成分1<.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Sharma实验室的成员提供了支持性的研究环境。我们特别感谢Diane (Dee) R. Hoffman,她负责维护和照料我们的小鼠种群。我们还要感谢Philip J. Smaldino博士和Carolyn Vann博士对稿件进行了仔细的校对,并提出了有益的建议。本研究得到了鲍尔州立大学教务长办公室和生物学系向B.S.提供的资金、印第安纳科学院高级研究资助向B.S.提供的资助,以及美国国立卫生研究院(RO1-HL128503)和纽约干细胞基金会向K.R.提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 x 20 毫米组织培养皿Fisher Scientific877222在实验方案中称为培养皿
24孔板Fisher Scientific08-772-51
8.0 µm PET膜培养小室Millipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor 驴抗兔 555Fisher ScientificA31572二抗
Alexa Fluor 驴抗大鼠 488Fisher ScientificA21206二抗
带角度金属探针Fine science tools10088-1545度角,用于检测深层凝块
抗ERG 1/2/3抗体AbcamAb92513一抗
抗VE-钙黏蛋白抗体Fisher ScientificBDB550548一抗,生产商为BD BioSciences
CO2 气瓶多家供应商N/A
CO2 培养箱Fisher Scientific13998223用于37 °C、5% CO2 条件下的培养
解剖体视显微镜LeicaS9iLeica S9i 体视显微镜
EBM-2基础培养基LonzaCC-3156内皮细胞生长基础培养基
ECM溶液Corning354230商品名为Matrigel
EGM-2 MV SingleQuots试剂盒LonzaCC-4147微血管内皮细胞补充剂试剂盒;与EBM-2混合配制成EGM-2完全培养基
胎牛血清(FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNA图像处理软件(https://imagej.net/Fiji/Downloads
精细镊子Fine science tools11412-11用于胚胎解剖
Fisherbrand直刃手术剪Fisher Scientific13-808-4
Hyclone磷酸盐缓冲液(1×)Fisher ScientificSH-302-5601LR
层流式组织培养罩Fisher Scientific提供多种型号
封片剂Vector LaboratoriesH-1200含DAPI的Vectashield
多聚甲醛(PFA)Electron Microscopy/Fisher50-980-494商品浓度为32%;需稀释至4%
带孔勺子Fine science tools10370-18用于从溶液中取出胚胎或组织
重组小鼠VEGF-A 165PeproTech450-32
标准镊子,Dumont #5Fine science tools11251-30
Sure-Seal小鼠/大鼠安乐死舱EasysystemincEZ-1785安乐死舱

参考文献

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. ....

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重印与许可

标签

VEGF A