大鼠I型复杂性区域疼痛综合征的慢性缺血后疼痛模型

摘要

本文提供了一种建立慢性缺血后疼痛（CPIP）动物模型的实验方案。该模型是模拟人类Ⅰ型复杂性区域疼痛综合征的公认模型。进一步评估CPIP大鼠模型中的机械性和热性痛觉过敏，以及辣椒素诱导的伤害性行为。

摘要

复杂性区域疼痛综合征Ⅰ型（CRPS-I）是一种神经系统疾病，可导致患者出现剧烈疼痛，目前仍属于尚未解决的医学难题。然而，CRPS-I的潜在发病机制尚未被阐明。已知缺血/再灌注是导致CRPS-I的主要因素之一。通过延长后肢缺血及再灌注过程，已建立大鼠慢性缺血后疼痛（CPIP）模型以模拟CRPS-I。CPIP模型已成为研究CRPS-I机制的公认动物模型。本实验方案详细描述了建立大鼠CPIP模型的具体操作步骤，包括麻醉以及后肢缺血/再灌注的实施过程。通过检测后肢的机械性与热性痛觉过敏程度，以及对急性辣椒素注射产生的伤害性反应，进一步评估该CPIP模型的特征表现。大鼠CPIP模型表现出多种类似CRPS-I的症状，包括建模后早期出现的后肢水肿和充血、持续存在的热痛与机械痛觉过敏，以及对急性辣椒素注射引发的伤害性反应增强。这些特征使其成为深入研究CRPS-I相关机制的适宜动物模型。

引言

复杂性区域疼痛综合征（CRPS）是由骨折、创伤、手术、缺血或神经损伤引起的复杂且慢性的疼痛症状^1,2,3。CRPS分为两个亚型：I型和II型（CRPS-I和CRPS-II）⁴。流行病学研究表明，CRPS的患病率约为1:2000⁵。CRPS-I无明显神经损伤表现，但可导致慢性疼痛，并显著影响患者的生活质量。目前可用的治疗方法疗效有限，因此CRPS-I仍然是一个亟待解决的重要且具有挑战性的临床问题。

建立模拟复杂性区域疼痛综合征-I（CRPS-I）的临床前动物模型，对于探索CRPS-I的潜在机制至关重要。为解决这一问题，Coderre等人设计了一种大鼠模型，通过对后肢施加 prolonged ischemia（缺血）和再灌注来模拟CRPS-I⁶。已知缺血/再灌注损伤是导致CRPS-I的主要原因之一⁷。该大鼠CPIP模型表现出多种类似CRPS-I的症状，包括建模后早期阶段出现的后肢水肿和充血，随后出现持续性的热痛和机械性痛觉过敏⁶。借助此模型，研究提出中枢痛觉敏化、外周TRPA1通道激活以及活性氧物质的生成等因素均参与了CRPS-I的发生发展^8,9,10。我们近期成功建立了CPIP大鼠模型，并对支配患侧后足的背根神经节（DRGs）进行了RNA测序分析¹¹。研究发现了一些可能参与介导CRPS-I痛觉过敏的潜在机制¹¹。我们进一步鉴定出背根神经节神经元中的瞬时受体电位香草酸1（TRPV1）通道在CRPS-I的机械性和热性痛觉过敏中发挥重要作用¹²。

在本研究中，我们描述了建立CPIP大鼠模型所涉及的详细步骤。我们通过检测机械性及热痛觉过敏程度，以及对急性辣椒素刺激的反应性，进一步评估了该CPIP大鼠模型的有效性。我们提出，CPIP大鼠模型可作为研究CRPS-I相关机制的一种可靠动物模型。

方案

动物实验方案已获浙江中医药大学动物伦理委员会批准。

1. 动物

1. 从上海实验动物中心获取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重280–320 g，8–10周龄），饲养于浙江中医药大学实验动物中心。饲养条件应保持12 h/12 h明暗循环，温度恒定在24 °C。自由供应水和饲料 随意摄取注意，本研究共使用48只大鼠。需要说明的是，在该模型中，需在整个过程中观察疼痛反应。若使用镇痛药物，则无法成功建立疼痛模型。实验结束后，处死大鼠。

2. CPIP 模型建立

1. 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射 [i.p.]）对所有大鼠（包括假手术组和CPIP模型组）进行麻醉。必要时以戊巴比妥钠（最多20 mg/kg/h，i.p.）维持麻醉。使用镊子夹捏大鼠后肢足垫或尾尖，检查每只动物的反射反应。确保大鼠在建模前无反应。术中在大鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。将麻醉后的大鼠置于维持在37 °C的加热垫上，进行后续操作。
2. 后肢足部缺血与再灌注
   1. 大鼠麻醉后，用甘油润滑其右后肢足部和踝关节。
   2. 将一个内径为7/32"（5.5 mm）的腈类70邵氏硬度O型环滑入1.5 mL Eppendorf管较大的一端（使用前将管盖切除）。小心地将后肢足部插入中空的Eppendorf管，直至到达管底。
   3. 将O型环从Eppendorf管逐渐滑移到右后肢踝关节附近，并保持3小时。对假手术组大鼠进行相同操作，但使用已切断的O型环（无法造成缺血）套于踝部。
   4. 缺血处理3小时后剪除O型环。密切观察大鼠，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。注意接受麻醉的大鼠在完全恢复前不得与其他大鼠合笼饲养。

3. 伤害性行为测试

1. 将大鼠置于一个透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）箱内，箱体底部为网格结构。在进行任何行为学测试前，让大鼠适应环境0.5小时。
2. 机械性异常性疼痛
   1. 使用von Frey纤维丝（0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0和26.0 g）进行测试。从中间强度的纤维丝（4.0 g）开始，将其垂直作用于后肢足底中部区域，施加适当力度使纤维丝轻微弯曲，持续时间最长为5秒。若后肢出现突然回缩反应，则视为伤害性行为。在第-3、-2、-1天以及之后每隔一天进行一次机械性异常性疼痛测试，直至第13天。
   2. 采用上下法（up-down testing method）测定疼痛阈值，并使用Dixon法计算50%足底回缩阈值（PWT）^13,14,15。
3. 热痛觉过敏
   1. 采用Hargreaves法检测热痛觉过敏。将灯泡（50 W）发出的光束直接对准后肢足底，测量足底回缩潜伏期（PWL）。设定20秒为截断时间，以避免加热造成过度损伤。
   2. 对每侧后肢在5分钟间隔内重复测试3次，取三次结果的平均值作为该大鼠的PWL¹⁶。在第-3、-2、-1天以及之后每隔一天进行一次热痛觉过敏测试，直至第13天。
4. 辣椒素诱导的急性伤害性行为
   1. 使用二甲基亚砜（DMSO）配制辣椒素储备液（200 mM），再用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1000稀释后用于后肢足底注射。PBS中最终DMSO浓度为0.1%（对照溶剂为仅含0.1% DMSO的PBS）。使用连接1 mL注射器的30 G针头，向后肢足底（足垫内注射）注入50 μL辣椒素溶液或对照溶剂。
   2. 注射后立即用摄像机记录10分钟内的伤害性行为（如舔舐、咬噬或抽动注射侧足部），并按照先前描述的方法进行量化分析^17,18,19。
5. 后肢足部水肿评估：通过测量足部直径的增加程度来评估后肢足部水肿。使用数显卡尺测量，并计算不同时间点测得值与基础值之间的差值。在造模后15分钟、24小时、48小时和72小时评估足部厚度的变化。

结果

将O形环套在踝部后，同侧后肢足垫皮肤出现发绀，提示组织缺氧（图1A）。剪断O形环后，同侧后肢足垫开始充血并出现明显肿胀，表现出显著的充血征象（图1A）。足垫肿胀逐渐减轻，并在缺血/再灌注操作后48小时恢复至正常水平（双因素方差分析，Sidak事后检验，图1B）。上述所有表现均与既往研究结果一致^6,12。

随后，采用 von Frey 纤毛试验测定机械性异常性疼痛。与假手术组相比，CPIP 组同侧后肢足底在造模后第 1 天即出现明显的机械性异常性疼痛，并持续至观察期第 13 天（双因素方差分析，Sidak 事后检验，图 1

讨论

本方案详细描述了通过在大鼠后肢施加缺血/再灌注建立大鼠慢性术后疼痛（CPIP）模型的方法。包括评估后肢外观、水肿、机械性/热性痛觉过敏，以及对辣椒素注射引起的急性伤害性行为反应。

肢体缺血/再灌注是导致人类CRPS-I的常见因素¹²。本方案描述了如何建立大鼠CPIP模型，该模型是一种常用于模拟人类CRPS-I的动物模型⁶。在麻醉条件下，将一个紧贴的O型环套在大鼠后肢踝关节处持续3小时，以诱导缺血。随后移除O型环，实现再灌注。模型建立后，CPIP模型大鼠后肢出现早期充血和水肿。该模型还表现出神经病理性疼痛行为，包括持续性的机械性/热性高敏感性。这些症状均模拟了人类CRPS-I的典型特征²¹。

复杂性区域疼痛综合征（CRPS）患者在受累肢体对辣椒素诱导的疼痛表现出明显增强的反应²⁰。然而，尚不清楚CPIP模型动物是否表现出类似的反应。因此，在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml Eppendorf 离心管	Eppendorf	22431021
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D1435
辣椒素（Capsaicin）	APEXBIO	A3278
数显卡尺	Meinaite	NA
O型圈	O-Rings West	丁腈橡胶 70 肖氏硬度	7/32 英寸 内径
足底测试装置	UGO Basile, 意大利	37370
von Frey 纤维丝	UGO Basile, 意大利	NC12775