近红外敏感型核壳疫苗递送平台的制备

摘要

本文描述了用于开发一种新型疫苗递送平台的实验方案， "多泡体，" 以实现延迟爆破释放。采用聚酯类材料如聚（乳酸-共-乙醇酸）和聚己内酯形成聚泡，小分子和抗原被用作载荷。

摘要

能够限制抗原在递送过程中接触有机溶剂，同时实现新型释放模式的疫苗递送策略，对于提高全球免疫覆盖率至关重要。本文介绍了一种新型可注射、可紫外光固化并能实现延迟爆发释放的疫苗递送平台——聚泡（polybubbles）。将抗原载入在10%羧甲基纤维素水溶液中形成的聚酯基聚泡内。本文提供了维持聚泡球形结构、优化抗原定位与保留效果的实验方案，以最大化聚泡内部的抗原载量。为确保安全性，采用中子活化分析法检测了聚泡中氯化溶剂的残留含量。通过将小分子作为模型抗原进行释放实验，验证了聚泡的延迟爆发释放特性。为进一步展示聚泡按需递送抗原的潜力，将金纳米棒掺入聚合物壳层中，以实现近红外激光触发释放。

引言

免疫接种覆盖率不足导致每年有300万人死于疫苗可预防疾病¹。由于储存和运输条件不当，有效疫苗被浪费，从而进一步降低了全球免疫接种水平。此外，未能遵循规定的疫苗接种时间表导致接种不完全，这一问题在发展中国家尤为突出²。在推荐的时间范围内，接种加强针需要多次前往医疗机构，因此限制了完成全程接种的人口比例。因此，亟需开发新型的疫苗控释策略以应对这些挑战。

目前，疫苗递送技术的开发研究包括基于乳液的聚合物系统^3,4。然而，货物通常会暴露于较大量可能引起聚集和变性的有机溶剂中，特别是在基于蛋白质的货物背景下尤为明显^5,6。我们开发了一种新型疫苗递送平台——"polybubbles"，该平台可容纳多个货物区室，同时最大限度地减少暴露于溶剂中的货物体积⁷。例如，在我们的 polybubble 核-壳平台中，一个直径为 0.38 mm（SEM）的货物袋被注入到一个 1 mm 的 polybubble 中心。在此情况下，暴露于有机溶剂的货物表面积约为 0.453 mm²。在考虑了球体....

方案

1. 聚己内酰胺三丙烯酸酯（PCLTA）的合成

1. 将 3.2 mL 分子量为 400 Da 的聚己内酯三醇（PCL 三醇）在 50 °C 下于敞口的 200 mL 圆底烧瓶中干燥过夜，同时将 K₂CO₃ 在玻璃小瓶中于 90 °C 干燥。
2. 在氩气氛围下，将该三醇与 6.4 mL 二氯甲烷（DCM）及 4.246 g 碳酸钾（K₂CO₃）混合。
3. 将 2.72 mL 丙烯酰氯溶于 27.2 mL DCM 中，然后在 5 分钟内逐滴加入圆底烧瓶中的反应混合物中。
4. 用铝箔包裹反应混合物，在氩气氛围下于室温静置 24 小时。
5. 反应 24 小时后，在减压条件下使用布氏漏斗和滤纸过滤反应混合物，以除去多余的试剂。
6. 将步骤 1.5 所得滤液（含有封端聚合物）在二乙醚中以 1:3（体积比）的比例沉淀，并在 30 °C 下旋转蒸发以除去二乙醚。

2. 多重气泡的形成

注意：将聚合物注入去离子（DI）水中会导致多泡迁移至小瓶底部，从而形成扁平底部。应使用10%（wt/vol）羧甲基纤维素（CMC）填充玻璃小瓶，以避免多泡变形。

1. 在去离子水中配制10%（wt/vol）的羧甲基纤维素钠（CMC）溶液。<....

结果

采用扫描电镜（SEM）和中子活化分析（NAA）对聚合物泡进行了全面表征。成功实现了载荷的中心化定位，从而产生延迟的突发释放效果。由于聚合物泡内含有金纳米棒（AuNRs），还可实现成功的激光激活。

多泡体表征
将多泡体注入不含羧甲基纤维素（CMC）的水溶液中时，由于多泡体与玻璃小瓶底部接触，导致其形状变扁平（图1A,B）。当使用5% CMC水溶液替代去离子水时，观察到多泡体部分扁平化（图1C）。随后，在玻璃小瓶中使用10% CMC水溶液时，多泡体悬浮于溶液中，从而成功维持了多泡体的球形形态（图1D）。

讨论

现有技术与挑战
基于乳液的微粒和纳米颗粒常被用作药物递送载体。尽管这些载体中货物分子的释放动力学已被广泛研究，但控制突释动力学仍是主要挑战¹¹。由于货物在过量水相和有机溶剂中暴露，基于乳液的系统在货物多样性与功能性方面也受到限制。蛋白质类货物通常难以与微粒和纳米颗粒兼容，因为存在货物变性和聚集的风险¹²。除了货物稳定性外，货物释放动力学在疫苗应用中尤为重要，因为需要通过加强针实现血清学转换。以往针对疫苗递送中这些挑战所进行的努力尚未取得足够成功，单次注射疫苗系统的概念虽已提出数十年，但至今尚未实现临床转化。

我们的多泡疫苗递送平台有望通过减少货物暴露于有机溶剂的体积，从而克服因暴露增加而带来的挑战。该技术可容纳至少两个货物区室：壳层中的货物和中心区域的货物。具有中心化货物的多泡结构可用于控制货物的突释行为，同时兼容多种类型的货物，包括小分子和抗原。在本研究中，我们采用具有不同降解时间的聚酯类聚合物——PLGADA（降解时间较短）和 PCL/P.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法超敏四甲基联苯胺（TMB）-酶联免疫吸附测定（ELISA）底物溶液	Thermo scientific	34028
2-羟基-2-甲基苯丙酮	TCI AMERICA	H0991
TMB底物用450 nm终止液	Abcam	ab17152
丙烯酰氯	Sigma Aldrich	A24109-100G
吖啶黄	Chem-Impex International	22916
无水乙醚	Fisher Chemical	E138-500
抗HIV1 gp120抗体-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488染料偶联物	Invitrogen	A13100
溴水杨酸	Acros Organics	AC162142500
羧甲基纤维素（CMC）	Millipore Sigma	80502-040
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）	MP Biomedicals	ICN19400480
氯仿	Fisher Chemical	C2984
包被缓冲液	Abcam	ab210899
二氯甲烷（DCM）	Sigma Aldrich	270997-1L
乙醚	Fisher Chemical	E1384
十二胺	Acros Organics	AC117665000
盐酸多柔比星	Fisher BioReagents	BP251610
L-抗坏血酸	Acros Organics	A61 100
Legato 100注射泵	KD Scientific	14 831 212
mPEG 巯基	Laysan Bio	NC0702454
脱脂奶粉	Andwin Scientific	NC9022655
碳酸钾	Acros Organics	AC424081000
磷酸盐缓冲液	Fisher BioReagents	BP3991
聚（己内酯）	Sigma Aldrich	440744-250G
聚（己内酯）三醇	Acros Organics	AC190730250
聚（乳酸-共-乙醇酸）二丙烯酸酯	CMTec	280050
碳酸钾	Acros Organics	AC424081000
重组HIV1 gp120 + gp41蛋白	Abcam	ab49054
硝酸银	Acros Organics	S181 25
硼氢化钠	Fisher Chemical	S678 10
四氯金酸	Fisher Chemical	G54 1
海藻糖	Acros Organics	NC9022655
三乙胺	Acros Organics	AC157910010