利用慢病毒载体方法制备转基因大鼠

摘要

本文旨在提供一种利用将病毒悬液多次注射到受精卵的卵周隙中，从而在大鼠胚胎中进行慢病毒转基因的技术方法。通过将雌性大鼠与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配，以获得假孕的代孕母鼠。

摘要

转基因动物模型对现代生物医学研究至关重要。将外源基因导入小鼠或大鼠的早期胚胎，是活体生物中进行基因功能分析的一种宝贵工具。传统的转基因方法基于将外源DNA片段显微注射到受精卵的原核中。该技术在小鼠中广泛应用，但在其他动物物种中仍相对效率较低且技术要求较高。转基因也可通过慢病毒感染的方式导入单细胞期胚胎，为标准的原核注射提供了一种有效替代方案，尤其适用于胚胎结构较难操作的物种或品系。在此方法中，将含有慢病毒载体的悬浮液注射到受精大鼠胚胎的透明带下腔，该操作技术难度较低且成功率更高。研究表明，慢病毒载体能够高效地将外源基因整合入基因组，从而建立稳定的转基因品系。尽管存在一些局限性（例如需要生物安全二级实验室条件、对外源DNA片段大小有限制），慢病毒介导的转基因技术仍是一种快速且高效的转基因方法。此外，本文还提出一种替代方案：使用与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配的雌性大鼠，作为假孕代孕母鼠的来源。

引言

多年来，实验啮齿类动物（如大鼠和小鼠）一直被用于模拟人类的生理和病理状况。动物研究取得了其他任何方法都无法实现的发现。最初，遗传学研究主要集中在分析自然发生的疾病和表型，这些疾病和表型被认为与人类疾病状况高度相似¹。随着基因工程技术的发展，科学家能够引入或删除特定基因，以获得预期的表型。因此，转基因动物的制备被公认为现代研究中的一项基本技术，使研究人员能够在活体生物中研究基因功能。

转基因动物技术的发展得益于实验胚胎学和分子生物学领域的多项成就。20世纪60年代，波兰胚胎学家A. K. Tarkowski首次发表了关于小鼠胚胎在发育早期进行操作的研究²。此外，分子生物学家开发出了构建DNA载体（即载体分子）的技术，可用于将外源DNA导入动物基因组。这些载体可根据研究类型的不同，实现特定基因的扩增及其相应的修饰。术语“转基因动物”由Gordon和Ruddle提出³。

在神经生物学、生理学、药理学、毒理学以及生物和医学科学的许多其他领域中，最早被广泛接受并使用的物种是挪威大鼠（Rattus norvegicus）⁴。然而，由于大鼠胚胎操作困难，家鼠（Mus musculus）已成为遗传学研究中的主导动....

方案

病毒载体的生产和应用均遵循生物安全二级指南，并获得波兰环境部的批准。下述所有动物实验程序均经当地伦理委员会批准。动物饲养于独立通风的笼具中，环境温度稳定（21–23 °C），湿度为50–60%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，可自由获取水和食物。

1. 慢病毒载体的制备

1. HEK 293T 细胞的转染
   注意：本方案适用于转染二十个直径 Ø10 cm 的培养皿，可产生约 200 mL 的粗制病毒载体上清液。
   1. 在添加胎牛血清（10%，v/v）的 DMEM 培养基中，于 37 °C、湿润的 CO₂ 培养箱中培养 HEK 293T 细胞。用于转染时，准备二十个直径 10 cm 的培养皿，每皿接种 1.5–2 × 10⁶ 个 HEK 293T 细胞。
   2. 当细胞融合度达到约 70% 时，使用 pH 7.0 的聚乙烯亚胺（PEI）试剂进行转染，PEI 与 DNA 的质量比为 3 μg PEI : 1 μg DNA。
      1. 为五个培养皿配制转染混合物（根据培养皿总数调整重复次数）。向 1 mL 无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入三种质粒的混合物，使其终浓度为：VSVg 质粒 25 µg、delta R8.2 质粒 50 µg、目的基因编码质粒 50 µg。
      2. 轻轻吹打混匀，加入 125....

结果

根据本文所述方案，制备了携带 Syn-TDP-43-eGFP 构建体的慢病毒载体（物理滴度 = 3.4 × 10⁸/µL），可用于单细胞期胚胎的透明带下注射。仅选择具有两个清晰可见原核的胚胎进行操作。病毒悬液的注射次数通过实验确定。若观察到较高的着床效率但未获得转基因后代，则提示病毒颗粒数量不足以实现有效转导，此时应增加注射次数。单次注射慢病毒仅产生20只F0代大鼠，均未检测到转基因。将注射次数增加一个数量级后，虽无活产大鼠出生，但100%的胚胎可发育至二细胞阶段。在后续实验中，注射次数在成功获得后代的剂量基础上再增加一次。在两次注射（LV x2）的条件下，共出生8只大鼠，其中3只经证实携带转基因（总结见表1）。其中一位始祖个体未能将转基因传递给后代。在LV x1和LV x2实验组中，每组注射并移植的胚胎数为48枚，在LV x10组中为45枚。每种实验条件下均使用3只代孕母鼠。该策略成功建立了稳定的转基因大鼠品系，可在整个中枢神经系统中，由神经元特异性Synapsin-1启动子驱动表达TDP-43-eGFP融合蛋白（图2<.......

讨论

转基因技术的进步使得啮齿类动物模型成为生物医学研究中不可或缺的工具。它们为在活体中研究基因型与表型之间的关系提供了机会。在此，我们介绍一种可广泛获得的替代传统原核显微注射的转基因方法。利用慢病毒介导的基因转导，可将病毒载体注射至透明带下，从而避免了技术要求较高的显微注射操作。该方法不会影响胚胎的完整性，基本可确保注射后的受精卵存活率达到100%。通过慢病毒载体整合的外源基因能够稳定地插入宿主基因组中，实现长期表达并可遗传至生殖系。此外，我们还介绍了两种改良的胚胎移植技术，用于将胚胎转移至代孕母鼠体内。其中一种技术是将胚胎移植到假孕雌鼠体内，这些雌鼠通过与输精管结扎的不育雄鼠交配而预先制备获得。另一种技术则利用自然妊娠的雌鼠，这些雌鼠与具有不同毛色的可育雄鼠（例如BN大鼠）交配。这种更为生理性的妊娠过程有助于经历复杂遗传修饰的胚胎正常发育¹⁶。

首例成功培育转基因大鼠的尝试于1990年被报道⁷。然而，由于大鼠转基因技术存在困难¹⁷，近几十年来.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7500 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems
异氟烷（Aerrane）	Baxter	FDG9623
校准微量毛细移液管用吸管组件	Sigma	A5177-5EA
阿替帕姆 5 mg/ml	Eurovet Animal Health BV	N/A	0.5 mg/kg
拜耳清 25 mg/ml（恩诺沙星）	Bayer	N/A	5–10 mg/kg
带内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	注射毛细管
布比卡因 25 mg/ml	Advanz Pharma	N/A	0.25% 溶于 0.9% NaCl
布托啡诺 10 mg/ml（酒石酸布托啡诺 ）	Orion Pharma	N/A	1 mg/kg
CELLSTAR 组织细胞培养皿 35 mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR 组织细胞培养皿 60 mm	Greiner Bio-One	628160
CellTram Oil	Eppendorf	5176 000.025
赛彼托（美托咪定）1 mg/ml	cp-pharma	N/A	0.5 mg/kg
绒促性素（人绒毛膜促性腺激素 ）	Intervet	N/A	150 IU/ml 溶于 0.9% NaCl
DMEM 低糖培养基	Sigma Aldrich	D6048
无 DNase 和 RNase 的 DNase	A&A Biotechnology	1009-100
EmbryoMax 过滤轻质矿物油	Sigma	ES-005-C
慢病毒载体包膜蛋白编码质粒（VSVg 质粒）	ADDGENE	14888
FemtoJet	Eppendorf	4i /5252 000.013
胎牛血清	Sigma Aldrich	F9665-500ML
孕马血清促性腺激素（Folligon）’	Intervet	N/A	125 IU/ml 溶于 0.9% NaCl
HEK 293T 细胞	ATCC	ATCC CRL-3216
牛睾丸来源透明质酸酶	Sigma	H4272-30MG	在 M2 培养基中配制成 0.5 mg/ml
倒置显微镜	Zeiss	Axiovert 200
氯胺酮 100 mg/ml	Biowet Pulawy	N/A	50 mg/kg
液体石蜡	Merck Millipore	8042-47-5
M16 培养基 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D
M2 培养基	Sigma	M7167
氯化镁 1 M	Sigma Aldrich	63069-100ML
微电极拉制仪	Narishige	MF-900
矿物油	Sigma	M8410-500ML
0.9% 氯化钠溶液	POLPHARMA OTC	N/A	无菌，5 ml 安瓿瓶
手术显微镜	Inami Ophthalmic Instruments	Deca-21
慢病毒载体包装系统编码质粒 （delta R8.2 质粒）	ADDGENE	12263
PEI 试剂（聚乙烯亚胺，分子量 ~25,000）	Polysciences, Inc	23966-1
青霉素-链霉素双抗溶液	Sigma Aldrich	P0781-100ML
磷酸盐缓冲液，pH 7.4，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养	Sigma Aldrich	806552-500ML
拉针仪	Sutter Instrument Co.	P-97
Reflex 夹施加器 / Reflex 夹	World Precision Instruments	500345/500346
Safil，聚乙醇酸编织涂层可吸收缝线	B.Braun Surgical	1048029
体视显微镜	Olympus	SZX16
外科缝合线	B.Braun	C1048040
SYBR Green PCR 主混合液	Applied Biosystem	4334973
托法替尼 4%（托芬那酸）	Vetoquinol	N/A	2 mg/kg
TransferMan NK2	Eppendorf	N/A
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma Aldrich	T3924-500ML
超速离心机	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
VacuTip	Eppendorf	5175108.000	毛细管固定夹
Vita-POS	Ursapharm	N/A	眼膏
加热板	Semic	N/A
钟表匠镊子	VWR	470018-868