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方法文章

利用慢病毒载体方法制备转基因大鼠

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DOI：

10.3791/60570

⸱

2020年5月17日

 ,  ,  ,  , 
1Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

本文内容

摘要

本文旨在提供一种利用将病毒悬液多次注射到受精卵的卵周隙中，从而在大鼠胚胎中进行慢病毒转基因的技术方法。通过将雌性大鼠与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配，以获得假孕的代孕母鼠。

摘要

转基因动物模型对现代生物医学研究至关重要。将外源基因导入小鼠或大鼠的早期胚胎，是活体生物中进行基因功能分析的一种宝贵工具。传统的转基因方法基于将外源DNA片段显微注射到受精卵的原核中。该技术在小鼠中广泛应用，但在其他动物物种中仍相对效率较低且技术要求较高。转基因也可通过慢病毒感染的方式导入单细胞期胚胎，为标准的原核注射提供了一种有效替代方案，尤其适用于胚胎结构较难操作的物种或品系。在此方法中，将含有慢病毒载体的悬浮液注射到受精大鼠胚胎的透明带下腔，该操作技术难度较低且成功率更高。研究表明，慢病毒载体能够高效地将外源基因整合入基因组，从而建立稳定的转基因品系。尽管存在一些局限性（例如需要生物安全二级实验室条件、对外源DNA片段大小有限制），慢病毒介导的转基因技术仍是一种快速且高效的转基因方法。此外，本文还提出一种替代方案：使用与具有不同显性毛色的可育雄性品系交配的雌性大鼠，作为假孕代孕母鼠的来源。

引言

多年来，实验啮齿类动物（如大鼠和小鼠）一直被用于模拟人类的生理和病理状况。动物研究取得了其他任何方法都无法实现的发现。最初，遗传学研究主要集中在分析自然发生的疾病和表型，这些疾病和表型被认为与人类疾病状况高度相似1。随着基因工程技术的发展，科学家能够引入或删除特定基因，以获得预期的表型。因此，转基因动物的制备被公认为现代研究中的一项基本技术，使研究人员能够在活体生物中研究基因功能。

转基因动物技术的发展得益于实验胚胎学和分子生物学领域的多项成就。20世纪60年代，波兰胚胎学家A. K. Tarkowski首次发表了关于小鼠胚胎在发育早期进行操作的研究2。此外，分子生物学家开发出了构建DNA载体（即载体分子）的技术，可用于将外源DNA导入动物基因组。这些载体可根据研究类型的不同，实现特定基因的扩增及其相应的修饰。术语“转基因动物”由Gordon和Ruddle提出3。

在神经生物学、生理学、药理学、毒理学以及生物和医学科学的许多其他领域中，最早被广泛接受并使用的物种是挪威大鼠（Rattus norvegicus）4。然而，由于大鼠胚胎操作困难，家鼠（Mus musculus）已成为遗传学研究中的主导动物物种5。小鼠在该研究领域占据主导地位的另一个原因是，已有成熟的胚胎干细胞技术可用于该物种以产生基因敲除动物。最常用的转基因技术是将DNA片段显微注射到受精卵的原核中，其转基因后代占所有出生动物的比例为2–10%。1990年，这一最初在小鼠中建立的方法被成功应用于大鼠6,7。与小鼠相比，通过原核注射进行大鼠转基因的效率较低8，这与大鼠胚胎原核具有弹性较强的质膜和原核膜密切相关9。尽管操作后胚胎的存活率比小鼠低40–50%，该技术仍被视为制备基因修饰大鼠的标准方法10。研究人员已探索了其他可提高外源基因整合效率及注射后合子存活率的替代方法。

稳定转基因表达及其向后代传递的关键决定因素是外源基因整合到宿主细胞基因组中。慢病毒（LVs）具有能够感染分裂期和非分裂期细胞的独特特性。作为将异源基因导入胚胎的工具，其应用已被证明具有很高的效率11，且转基因个体表现出所插入DNA片段的稳定表达。慢病毒载体在小鼠12,13、大鼠12,14及其他物种11的遗传修饰中均已得到验证。在本方法中，将LV悬液注射至双原核期胚胎的透明带下。该技术基本可确保胚胎100%存活，因为卵细胞膜未受影响。高质量且相对高浓度的LV悬液的制备是关键因素。然而，较低浓度的LV悬液可通过重复注射来弥补11，从而增加病毒颗粒在卵细胞表面的积累，同时不影响膜整合。对卵周隙进行多次注射的胚胎仍可继续发育，并且转基因后代能够通过生殖系传递转基因。利用慢病毒转基因技术制备转基因大鼠的效率可高达80%12。

本文描述了以水疱性口炎病毒（VSV）G包膜蛋白假型化的HIV-1来源的重组慢病毒的制备方法。采用第二代包装系统并形成VSV假型，可赋予病毒颗粒广泛的感染性，并可制备出高度稳定的病毒载体，该载体可通过超速离心浓缩并长期冷冻保存。在完成滴度验证后，这些载体即可用于将外源基因递送至白化Wistar大鼠的受精卵中。经过一系列显微注射操作后，胚胎可在体外培养过夜，并在二细胞阶段移植至代孕母鼠体内。此时可选择两种不同的方案：标准操作使用假孕雌鼠作为胚胎受体；然而，当与输精管结扎雄鼠交配后假孕率较低时，可将胚胎植入已与具有深色毛发雄性大鼠（例如Brown Norway [BN]大鼠）交配的妊娠Wistar/Sprague-Dawley（SD）雌鼠体内。利用毛色差异，可明确区分自然受孕产生的子代与移植操作胚胎发育而来的子代。

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方案

病毒载体的生产和应用均遵循生物安全二级指南，并获得波兰环境部的批准。下述所有动物实验程序均经当地伦理委员会批准。动物饲养于独立通风的笼具中，环境温度稳定（21–23 °C），湿度为50–60%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，可自由获取水和食物。

1. 慢病毒载体的制备

  1. HEK 293T 细胞的转染
    注意：本方案适用于转染二十个直径 Ø10 cm 的培养皿，可产生约 200 mL 的粗制病毒载体上清液。
    1. 在添加胎牛血清（10%，v/v）的 DMEM 培养基中，于 37 °C、湿润的 CO2 培养箱中培养 HEK 293T 细胞。用于转染时，准备二十个直径 10 cm 的培养皿，每皿接种 1.5–2 × 106 个 HEK 293T 细胞。
    2. 当细胞融合度达到约 70% 时，使用 pH 7.0 的聚乙烯亚胺（PEI）试剂进行转染，PEI 与 DNA 的质量比为 3 μg PEI : 1 μg DNA。
      1. 为五个培养皿配制转染混合物（根据培养皿总数调整重复次数）。向 1 mL 无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入三种质粒的混合物，使其终浓度为：VSVg 质粒 25 µg、delta R8.2 质粒 50 µg、目的基因编码质粒 50 µg。
      2. 轻轻吹打混匀，加入 125 µL 浓度为 3 µg/µL 的 PEI。室温孵育 15 分钟，期间翻转离心管三次。每皿加入 200 µL 转染混合物。随后将培养皿置于 37 °C、湿润的 CO2 培养箱中继续培养。
  2. 慢病毒载体的浓缩
    1. 转染 48 小时后，收集含有慢病毒（LV）颗粒的培养基，使用 50 mL 圆锥形离心管。
      注意：若使用带有荧光标签的质粒，此时可观察细胞以验证转染效率。可更换新的 DMEM 培养基，并继续培养 24 小时。在转染后 48 小时和 72 小时收集的慢病毒产量相近。
    2. 在室温下以 3,000 × g 离心 5 分钟，去除脱落的细胞。
    3. 用 0.45 μm 滤器过滤上清液，并转移至新离心管中。
      注意：此步骤可省略。
    4. 加入 DNase I（无 RNase 污染，1 μg/mL）和 MgCl2（1 mM），在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟。
    5. 将培养基转移至一次性聚乙烯离心管中，使用摆动转子在 4 °C 条件下以 115,000 × g 超速离心 1.5 小时。
    6. 离心结束后，小心倾去管壁上的残留液体。
    7. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS；每管 70–80 µL）重悬沉淀。
    8. 在 4–8 °C 孵育 2 小时。
    9. 通过轻柔吹打将病毒载体重悬于 PBS 中。
      警告：避免产生气泡。
    10. 转移至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 30 秒，将上清液转移至新管中。重复此步骤，直至肉眼不可见细胞碎片沉淀。
    11. 分装后于 -80 °C 冻存。避免对慢病毒分装样品反复冻融。
  3. 使用定量聚合酶链式反应测定病毒滴度
    注意：病毒载体滴度的测定采用定量 PCR（qPCR）方法。该方法基于扩增病毒基因组长末端重复序列（LTR）区域内一段 84 bp 的双链 DNA 片段15。
    1. 通过将 LV 编码质粒进行系列稀释（1:500、1:1,000、1:5,000、1:10,000、1:100,000 和 1:1,000,000）制备标准曲线。计算用于标准曲线的质粒拷贝数。使用以下公式：拷贝数/µL = （浓度 [g/µL] × 6.02 × 1023 [个/mol]）/（660 [g/mol] × 质粒大小 [bp]），其中 6.02 × 1023 个/mol 为阿伏伽德罗常数，660 g/mol 为每个碱基对的平均分子量。
      注意：可使用在线拷贝数计算器。
    2. 对慢病毒悬液进行稀释：1:100、1:500 和 1:1,000。
    3. 配制反应体系（每孔体积）：qPCR Mastermix 10 µL、10 μM 正向引物 1 µL、10 μM 反向引物 1 µL、H2O 7 µL。将混合液加入 96 孔板的各孔中。
      注意：正向引物序列：5’-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA；反向引物序列：5’-TGACTAAAAGGGTCTGAGGGA。
    4. 每种标准品稀释液和慢病毒悬液各取 1 µL，每样本设三个重复孔。
    5. 按照以下参数运行 qPCR 程序：50 °C 孵育 2 分钟，96 °C 预变性 5 分钟，然后进行 35 个循环（96 °C 变性 20 秒，60 °C 退火 40 秒，70 °C 延伸 1 分钟），最后进行熔解曲线分析：95 °C 1 分钟，60 °C 30 秒。
    6. 通过将各稀释样本检测到的分子数与标准曲线比对，分析结果。以每个稀释度三个重复的平均值确定载体分子浓度。
      注意：该定量方法提供的是病毒颗粒的物理浓度，不应将其视为功能性滴度。

2. 转基因大鼠的制备

  1. 超数排卵与受精胚胎的收集
    1. 给予促性腺激素。
      注意：为增加收集到的胚胎数量（每只雌鼠约30枚），应选用5周龄未成熟Wistar雌鼠进行激素刺激。
      1. 第1天（12:00–13:00），腹腔注射孕马血清促性腺激素（PMSG；每只25 IU）。将激素粉末溶于0.9% NaCl溶液中，配制成浓度为125 IU/mL的工作液，分装为1 mL等份。可在-20 °C保存1个月内，或-80 °C保存6个月内。
      2. 第3天（12:00–13:00），腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（hCG；每只30 IU）。将激素粉末溶于0.9% NaCl溶液中，配制成浓度为150 IU/mL的工作液，分装为1 mL等份。可在-20 °C保存1个月内，或-80 °C保存6个月内。
    2. 注射hCG后，将雌鼠与性成熟的雄鼠（3–10月龄）按1:1比例合笼交配。
    3. 次日早晨（第4天8:00–10:00），检查雌鼠阴道栓的存在情况。检查阴道口是否有乳白色交配栓，为获得最佳观察效果，应在交配夜后的清晨尽早检查。仅使用可见阴道栓的雌鼠进行胚胎收集。
    4. 上午10:00收集胚胎。处死动物后取出输卵管，并将输卵管置于含有预热M2培养基的培养皿中。
      1. 将输卵管转移至含有预热M2培养基的35 mm培养皿中，培养基中添加牛睾丸透明质酸酶，终浓度为0.5 mg/mL。
      2. 在体视显微镜下用精细镊子打开输卵管壁，并轻压壶腹部（即输卵管中膨大的部分，内含被卵丘细胞包裹的受精胚胎），直至胚胎释放出来。
        注意：透明质酸酶可酶解卵丘细胞，从而释放胚胎。
        警告：胚胎长时间暴露于透明质酸酶中对其有害，因此该步骤不应超过5分钟。
      3. 为促进胚胎从卵丘细胞中释放，使用连接口吸装置的玻璃转移吸管轻轻吹打胚胎。
        1. 制备转移吸管时，将玻璃巴斯德吸管在火焰上拉制，形成约5–10 cm长的直尖端，折断后保留约4 cm长的尖端。
      4. 用M2培养基多次洗涤胚胎，以去除透明质酸酶和细胞碎片。将胚胎转移至60 mm培养皿中，培养皿内含有约50 µL预平衡的M16培养基液滴，并以液体石蜡或矿物油覆盖，置于37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中。
  2. 在透明带下对单细胞期胚胎进行慢病毒载体显微注射
    注意：显微注射应选用具有两个清晰可见原核的单细胞期胚胎（图1）。
    1. 室温下解冻慢病毒（LV）等份样品，并在室温下以10,000 x g离心2分钟，以沉淀残留的细胞碎片。
    2. 显微注射装置准备
      1. 使用微电极拉制仪制备玻璃固定吸管（硼硅酸盐玻璃毛细管）。将玻璃毛细管在火焰上拉制，形成5–10 cm长的尖端，折断后保留约4 cm长的尖端。外径应约为80–120 µm。
        注意：确保吸管尖端完全笔直且光滑。
      2. 将拉制好的毛细管安装至微电极拉制仪，使尖端位于加热丝前方。将加热丝靠近吸管尖端加热，使其收缩至直径约15 µm（约为胚胎大小的20%）。将吸管垂直于加热丝放置，距离尖端2–3 mm，开始加热。玻璃软化后继续加热，直至形成15°角。
      3. 使用拉针仪制备带内丝的硼硅酸盐玻璃显微注射毛细管。将毛细管插入拉针室。首次使用新玻璃或每次更换加热丝后均需进行斜坡测试。设置加热参数为斜坡值减10，拉力为100，速度为150，时间为100。
        注意：可根据实际情况调整参数，以获得最佳注射毛细管。
      4. 在生物安全超净工作台内，使用微量加样吸头将约2 µL病毒溶液装入显微注射吸管中。
      5. 准备显微注射培养皿（60 mm培养皿盖），中央加入100 µL M2培养基液滴，并以液体石蜡或矿物油覆盖。
      6. 将固定吸管和装有病毒溶液的显微注射毛细管安装至倒置显微镜下的显微操作仪，并将注射培养皿置于载物台上。
    3. 进行显微注射。
      1. 将15–20枚单细胞期胚胎转移至显微注射培养皿中的M2液滴内，使用固定吸管固定胚胎。
      2. 在400倍放大倍数下，使用连接自动注射仪的玻璃毛细管将LV溶液注射至透明带下方的卵周隙。将毛细管在透明带下停留片刻。
        注意：通过轻微正压，病毒溶液会持续从注射毛细管中流出，但无法精确控制注入体积。
      3. 使用精细吸管将注射后的胚胎转移回培养箱中的培养皿内，于37 °C、5% CO2条件下继续培养。每个受精卵的注射次数可根据病毒载体浓度进行调整。
        注意：注射后的胚胎可在单细胞期直接移植至假孕母鼠体内，也可在M16培养基中过夜培养至双细胞期后再移植。应避免大鼠胚胎的长期体外培养。
  3. 将注射后的胚胎移植至假孕母鼠体内
    1. 通过将性成熟的SD雌鼠与可育的BN雄鼠或结扎的SD雄鼠（结扎手术见下文第3节）在第3天（用于单细胞期胚胎移植）或第4天（用于双细胞期胚胎移植）合笼交配，以准备假孕母鼠。
      注意：用于输卵管移植时，应选用交配后0.5天（dpc）的雌鼠。
    2. 次日早晨检查SD雌鼠是否存在阴道栓，仅使用有可见阴道栓的个体。
    3. 进行胚胎移植。
      注意：手术应在体视显微镜下使用无菌器械进行。手术前一天，将剪刀、精细镊子、持针器和手术刀柄进行高压灭菌。
      1. 通过腹腔注射给予雌鼠氯胺酮（50 mg/kg）和美托咪啶（0.5 mg/kg）混合溶液进行麻醉。在开始手术前测试反射以确认麻醉效果。
      2. 皮下注射托芬那酸（2 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（1 mg/kg）和恩诺沙星（5–10 mg/kg），分别用于预防炎症、缓解疼痛和防止感染。
      3. 双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。剃除背部毛发，使用无菌不粘敷料依次以手术消毒液和70%酒精消毒皮肤，待皮肤干燥。
      4. 在切口部位皮下注射100 µL 0.25%布比卡因（局部麻醉剂）。将动物俯卧位置于加热垫上的洁净台面上，置于手术显微镜物镜下。用无菌手术巾覆盖动物，仅在下背部留一小孔。
      5. 做长约2 cm的皮肤切口，方向与腰椎平行。
      6. 使用锐利剪刀切开腹壁。用镊子夹住卵巢脂肪垫，将卵巢和输卵管拉出，并置于用0.9% NaCl润湿的纱布上。
      7. 用移植毛细管吸取M2培养基、三段空气泡以及胚胎。建议移植胚胎总数（单侧或双侧）：妊娠雌鼠（≤15–16枚胚胎），假孕雌鼠（≤30枚胚胎）。
      8. 使用显微剪在输卵管（漏斗部与壶腹部之间）做一小切口，将移植吸管插入输卵管内。
      9. 轻柔地将胚胎和气泡从吸管中推出至输卵管内。用钝头镊子将生殖道复位至腹腔内。
      10. 使用聚乙醇酸可吸收缝线缝合腹壁，并用伤口夹闭合皮肤切口。根据可用胚胎数量，可对另一侧输卵管重复此操作。
      11. 腹腔注射阿替美唑（0.5 mg/kg）以逆转麻醉作用。
      12. 将动物转移至清洁笼盒中，并置于加热板上直至完全苏醒。大鼠分娩时间约为21天后。
        注意：若使用雄性BN大鼠进行交配，则仅白色仔鼠可能为转基因个体；棕色仔鼠来自自然妊娠。
      13. 采集组织样本（建议取自耳部）用于3周龄仔鼠的基因型鉴定。

3. 输精管结扎术

注意：手术前一天，将剪刀、精细镊子和持针器进行高压灭菌。

  1. 通过腹腔注射给予一只5周龄雄性SD大鼠氯胺酮（50 mg/kg）和美托咪啶（0.5 mg/kg）溶液进行麻醉。 在开始手术前测试反射以确认麻醉效果。
  2. 皮下注射托芬那酸（2 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（1 mg/kg）和恩诺沙星（5–10 mg/kg），分别用于预防炎症、疼痛和感染。
  3. 在双眼涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。将大鼠仰卧置于加热垫上的清洁表面上，使用无菌不粘敷料依次以手术清洗剂和70%酒精对睾丸区域皮肤进行消毒。待皮肤干燥后，用无菌洞巾覆盖大鼠身体，仅在睾丸部位留一小孔。轻压腹部以使睾丸暴露于阴囊囊中。
  4. 使用手术剪在阴囊囊中部做约0.5 cm的切口。找到位于两睾丸之间的中线壁（白色线条）。
  5. 在睾丸膜靠近中线壁左侧处做5 mm切口。
  6. 小心将左侧睾丸向左推移，寻找输精管（位于睾丸与中线之间），其为一条带有单根血管的白色导管。
  7. 使用钟表镊轻轻将输精管从阴囊囊中拉出。用一对镊子夹住输精管，用精细剪刀剪断（或用另一对镊子烧灼红热的尖端进行电凝）。移除约1 cm长的输精管片段。
    注意：若采用电凝法，需将第二对镊子的尖端置于火焰中加热至红热。
  8. 对另一侧睾丸重复上述操作。使用聚乙醇酸可吸收缝线缝合皮肤，并通过腹腔注射给予阿替美唑（0.5 mg/kg）。
  9. 将大鼠置于加热板上的清洁笼中，直至其从麻醉中恢复。
    注意：雄性大鼠在术后约2周恢复期后可用于交配测试。确认不育后，可用于假孕诱导。

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结果

根据本文所述方案，制备了携带 Syn-TDP-43-eGFP 构建体的慢病毒载体（物理滴度 = 3.4 × 108/µL），可用于单细胞期胚胎的透明带下注射。仅选择具有两个清晰可见原核的胚胎进行操作。病毒悬液的注射次数通过实验确定。若观察到较高的着床效率但未获得转基因后代，则提示病毒颗粒数量不足以实现有效转导，此时应增加注射次数。单次注射慢病毒仅产生20只F0代大鼠，均未检测到转基因。将注射次数增加一个数量级后，虽无活产大鼠出生，但100%的胚胎可发育至二细胞阶段。在后续实验中，注射次数在成功获得后代的剂量基础上再增加一次。在两次注射（LV x2）的条件下，共出生8只大鼠，其中3只经证实携带转基因（总结见表1）。其中一位始祖个体未能将转基因传递给后代。在LV x1和LV x2实验组中，每组注射并移植的胚胎数为48枚，在LV x10组中为45枚。每种实验条件下均使用3只代孕母鼠。该策略成功建立了稳定的转基因大鼠品系，可在整个中枢神经系统中，由神经元特异性Synapsin-1启动子驱动表达TDP-43-eGFP融合蛋白（图2<...

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讨论

转基因技术的进步使得啮齿类动物模型成为生物医学研究中不可或缺的工具。它们为在活体中研究基因型与表型之间的关系提供了机会。在此，我们介绍一种可广泛获得的替代传统原核显微注射的转基因方法。利用慢病毒介导的基因转导，可将病毒载体注射至透明带下，从而避免了技术要求较高的显微注射操作。该方法不会影响胚胎的完整性，基本可确保注射后的受精卵存活率达到100%。通过慢病毒载体整合的外源基因能够稳定地插入宿主基因组中，实现长期表达并可遗传至生殖系。此外，我们还介绍了两种改良的胚胎移植技术，用于将胚胎转移至代孕母鼠体内。其中一种技术是将胚胎移植到假孕雌鼠体内，这些雌鼠通过与输精管结扎的不育雄鼠交配而预先制备获得。另一种技术则利用自然妊娠的雌鼠，这些雌鼠与具有不同毛色的可育雄鼠（例如BN大鼠）交配。这种更为生理性的妊娠过程有助于经历复杂遗传修饰的胚胎正常发育16。

首例成功培育转基因大鼠的尝试于1990年被报道7。然而，由于大鼠转基因技术存在困难17，近几十年来...

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披露

作者（W.K.）拥有波兰共和国专利局授予的专利“转基因动物的生产方法”（专利号：P 355353；授权日期：2008年3月21日）的专利权。

致谢

本研究由波兰科学基金会的团队科技核心设施增强计划（Team Tech Core Facility Plus）中的ANIMOD项目资助，并由欧洲区域发展基金（European Regional Development Fund）根据欧盟资助，共同资助给WK。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7500 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems
异氟烷（Aerrane）BaxterFDG9623
校准微量毛细移液管用吸管组件SigmaA5177-5EA
阿替帕姆 5 mg/mlEurovet Animal Health BVN/A0.5 mg/kg
拜耳清 25 mg/ml（恩诺沙星）BayerN/A5–10 mg/kg
带内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 GC100TF-15Harvard Apparatus Limited30-0039注射毛细管
布比卡因 25 mg/mlAdvanz PharmaN/A0.25% 溶于 0.9% NaCl
布托啡诺 10 mg/ml（酒石酸布托啡诺 ）Orion PharmaN/A1 mg/kg
CELLSTAR 组织细胞培养皿 35 mmGreiner Bio-One627160
CELLSTAR 组织细胞培养皿 60 mmGreiner Bio-One628160
CellTram OilEppendorf5176 000.025
赛彼托（美托咪定）1 mg/mlcp-pharmaN/A0.5 mg/kg
绒促性素（人绒毛膜促性腺激素 ）IntervetN/A150 IU/ml 溶于 0.9% NaCl
DMEM 低糖培养基Sigma AldrichD6048
无 DNase 和 RNase 的 DNaseA&A Biotechnology1009-100
EmbryoMax 过滤轻质矿物油SigmaES-005-C
慢病毒载体包膜蛋白编码质粒（VSVg 质粒） ADDGENE14888
FemtoJetEppendorf4i /5252 000.013
胎牛血清Sigma AldrichF9665-500ML
孕马血清促性腺激素（Folligon）’ IntervetN/A125 IU/ml 溶于 0.9% NaCl
HEK 293T 细胞 ATCCATCC CRL-3216
牛睾丸来源透明质酸酶 SigmaH4272-30MG在 M2 培养基中配制成 0.5 mg/ml
倒置显微镜 ZeissAxiovert 200
氯胺酮 100 mg/mlBiowet PulawyN/A50 mg/kg
液体石蜡Merck Millipore8042-47-5
M16 培养基 EmbryoMaxSigmaMR-016-D
M2 培养基SigmaM7167
氯化镁 1 MSigma Aldrich63069-100ML
微电极拉制仪NarishigeMF-900
矿物油SigmaM8410-500ML
0.9% 氯化钠溶液POLPHARMA OTCN/A无菌，5 ml 安瓿瓶
手术显微镜 Inami Ophthalmic InstrumentsDeca-21
慢病毒载体包装系统编码质粒 （delta R8.2 质粒）ADDGENE12263
PEI 试剂（聚乙烯亚胺，分子量 ~25,000）Polysciences, Inc23966-1
青霉素-链霉素双抗溶液Sigma AldrichP0781-100ML
磷酸盐缓冲液，pH 7.4，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养Sigma Aldrich806552-500ML
拉针仪 Sutter Instrument Co.P-97
Reflex 夹施加器 / Reflex 夹World Precision Instruments500345/500346
Safil，聚乙醇酸编织涂层可吸收缝线B.Braun Surgical1048029
体视显微镜OlympusSZX16
外科缝合线B.Braun C1048040
SYBR Green PCR 主混合液Applied Biosystem4334973
托法替尼 4%（托芬那酸）VetoquinolN/A2 mg/kg
TransferMan NK2EppendorfN/A
胰蛋白酶-EDTA 溶液Sigma AldrichT3924-500ML
超速离心机Beckman CoulterOptima L-100 XP 
VacuTipEppendorf5175108.000毛细管固定夹
Vita-POSUrsapharmN/A眼膏
加热板SemicN/A
钟表匠镊子VWR470018-868

参考文献

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