石英晶体微天平测量蛋白质吸附与聚合物力学性能的样品制备

摘要

石英晶体微天平可为微米或亚微米级薄膜提供精确的质量和粘弹性特性数据，这在生物医学与环境传感、涂层以及聚合物科学的研究中具有重要意义。样品厚度会影响从与传感器接触的材料中所能获取的信息。

摘要

本研究展示了石英晶体微天平实验中薄膜制备的多种实例，这些实例有助于合理选择数据建模方法，并决定可定量测定薄膜的哪些性质。石英晶体微天平通过检测高频振荡石英晶体机械共振特性的变化，提供了一种极为灵敏的平台，用于测量所施加薄膜的质量和/或机械性质的微小变化。该方法的优势包括实验灵活性高、能够研究不同时间尺度下的性质变化，以及所需样品量小。我们证明，根据沉积在传感器上的薄膜的厚度和剪切模量，可以从材料中获得不同的信息。本文特别利用这一原理，展示了一系列实验参数，用于计算金表面吸附的胶原蛋白以及聚电解质复合物在溶胀过程中随盐浓度变化的质量和粘弹性参数。

引言

石英晶体微天平（QCM）利用石英晶体的压电效应来监测其共振频率，该频率取决于附着在表面的质量。该技术通过比较AT切型石英晶体传感器（通常频率范围为5 MHz）¹在空气或流体中的共振频率和带宽，与成膜后传感器的频率和带宽，来进行分析。使用QCM研究薄膜性质和界面具有多项优势，包括对质量具有高灵敏度，以及可能对粘弹性性质变化敏感（取决于样品的均匀性和厚度），能够原位进行研究²，并且能够探测比传统剪切流变学或动态力学分析（DMA）更短的流变时间尺度。探测短流变时间尺度使得研究人员能够观察该时间尺度上的响应在极短（毫秒级）³和极长（数年）时间范围内⁴的变化。这一能力对于研究多种动力学过程非常有益，同时也是对传统流变测量技术的有力补充^5,6。

QCM 的高灵敏度也使其在生物学应用中得到广泛使用，用于研究极小生物分子的基本相互作用。通过使用未包被或功能化的传感器表面，可研究蛋白质的吸附行为；更进一步，还可基于质量变化来检测酶、抗体和适配体之间的复杂结合事件所介导的生物传感过程^7,....

方案

QCM-D 胶原蛋白吸附

1. 样品制备与传感器预清洗

1. 配制 20 mL 的 0.1 M 醋酸盐缓冲液，必要时用 HCl 和 NaOH 调节 pH 至 5.6。
2. 在无菌条件下，将大鼠尾部胶原蛋白溶液加入 20 mL 醋酸盐缓冲液中，使其终浓度为 10 µg/mL。
3. 清洁金镀膜石英传感器，以去除有机物和生物材料^25,26。
   1. 将传感器检测面朝上放入紫外/臭氧清洗仪中，处理约 10 分钟。
   2. 将去离子水（dH₂O）、氨水（25%）和过氧化氢（30%）按 5:1:1 的比例混合，加热至 75 °C，将传感器置于该溶液中 5 分钟。
   3. 用 dH₂O 冲洗传感器，并用氮气流吹干。
   4. 将传感器检测面朝上再次放入紫外/臭氧清洗仪中，处理 10 分钟。
      注：清洁步骤应在测量前立即进行，以最大限度减少环境对传感器表面的污染。

2. QCM-D 测量数据采集

1. 开启所有必要的设备以进行测量，包括泵、电子单元和计算机软件。
....

结果

蛋白质吸附过程中频率随时间的变化呈现出特征性曲线并达到稳定平台，如图3A-B所示。用1×PBS缓冲液对裸露的传感器表面进行初始冲洗时，频率仅发生可忽略的变化，从而提供一个稳定的基线，作为后续数据点的参考。加入胶原蛋白溶液后，蛋白质吸附开始发生，表现为频率随时间持续下降，直至附着的胶原蛋白密度达到稳定基线（图3A）。最终的频率和质量数值将高度依赖于传感器的纯度和表面能。在这些参数条件下，最后的缓冲液冲洗仅从传感器表面去除少量未结合的蛋白质，导致频率轻微上升。在此阶段，我们始终预期质量仅有轻微下降，表明结合到传感器上的蛋白质数量保持稳定（图3B）。

每个周期内获得稳定的频率测量值的重要性再怎么强调也不为过。环境变量（如温度、湿度和溶液浓度）的微小波动都可能导致原始数据出现可观测的差异。因此，若在频率和耗散因子.......

讨论

胶原蛋白吸附结果跨越了索耶布雷（Sauerbrey）区域和粘弹性区域。通过绘制相对于相应谐波数归一化的频率偏移，我们观察到索耶布雷极限在测量的前约2小时内成立。然而，随着吸附到传感器上的质量增加，第三和第五谐波的归一化频率偏移开始出现差异（t > 2 h），表明可据此测定吸附膜的粘弹性特性。

软件生成的粘弹性模型结果与Shull小组的幂律模型结果之间的直接比较表明，计算所得的材料特性存在显著差异。在整个测量过程中，商用软件生成的粘弹性模型数据代表了一个更厚、更软的层，其复数剪切模量较低（图5）。这些模型在黏弹性特性上的差异源于每种系统计算中所采用的假设。其中一个差异涉及对黏弹性特性频率依赖性的假设。必须做出某种假设，是因为在特定谐波（例如 n = 3）下的频率响应取决于三个参数（pd, |G*₃|p，Φ₃）但仅有两个独立量（Δƒ₃ 和 ΔΓ_<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283	用于胶原蛋白吸附
氢氧化铵溶液	Sigma-Aldrich	221228	用于胶原蛋白吸附
水相QCM探针	AWSensors	CLS 00050 A	用于聚电解质溶胀
大鼠尾胶原蛋白I型	Thermo Fisher Scientific	A1048301	用于胶原蛋白吸附
蒸馏水	Sigma-Aldrich	EM3234	用于聚电解质溶胀；在科研实验室中通常易于获取，但若需订购可参考此货号
乙醇	Sigma-Aldrich	793175-1GA-PB	用于聚电解质溶胀
Gibco 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher Scientific	20012-027	用于胶原蛋白吸附
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	用于胶原蛋白吸附
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	216763	用于胶原蛋白吸附
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task 擦拭纸，单层	Fisher Scientific	06-666A	用于聚电解质溶胀
NP2K VNA	Makarov Instruments		用于聚电解质溶胀
聚（二烯丙基二甲基氯化铵），分子量 200,000	Sigma-Aldrich	409022	用于聚电解质溶胀；完整合成步骤参见 Sadman 等人
聚（苯乙烯磺酸钠）水溶液，含30%重量比	Sigma-Aldrich	561967-500G	用于聚电解质溶胀；完整合成步骤参见 Sadman 等人
溴化钾	Sigma-Aldrich	793604-1KG	用于聚电解质溶胀
QSense QCM Explorer 系统	Biolin Scientific		用于胶原蛋白吸附
无水乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	用于胶原蛋白吸附
旋涂仪，型号 WS-650MZ-23NPP	Laurell technologies		用于聚电解质溶胀