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方法文章

石英晶体微天平测量蛋白质吸附与聚合物力学性能的样品制备

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DOI：

10.3791/60584

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2020年1月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Northwestern University, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

石英晶体微天平可为微米或亚微米级薄膜提供精确的质量和粘弹性特性数据，这在生物医学与环境传感、涂层以及聚合物科学的研究中具有重要意义。样品厚度会影响从与传感器接触的材料中所能获取的信息。

摘要

本研究展示了石英晶体微天平实验中薄膜制备的多种实例，这些实例有助于合理选择数据建模方法，并决定可定量测定薄膜的哪些性质。石英晶体微天平通过检测高频振荡石英晶体机械共振特性的变化，提供了一种极为灵敏的平台，用于测量所施加薄膜的质量和/或机械性质的微小变化。该方法的优势包括实验灵活性高、能够研究不同时间尺度下的性质变化，以及所需样品量小。我们证明，根据沉积在传感器上的薄膜的厚度和剪切模量，可以从材料中获得不同的信息。本文特别利用这一原理，展示了一系列实验参数，用于计算金表面吸附的胶原蛋白以及聚电解质复合物在溶胀过程中随盐浓度变化的质量和粘弹性参数。

引言

石英晶体微天平（QCM）利用石英晶体的压电效应来监测其共振频率，该频率取决于附着在表面的质量。该技术通过比较AT切型石英晶体传感器（通常频率范围为5 MHz）1在空气或流体中的共振频率和带宽，与成膜后传感器的频率和带宽，来进行分析。使用QCM研究薄膜性质和界面具有多项优势，包括对质量具有高灵敏度，以及可能对粘弹性性质变化敏感（取决于样品的均匀性和厚度），能够原位进行研究2，并且能够探测比传统剪切流变学或动态力学分析（DMA）更短的流变时间尺度。探测短流变时间尺度使得研究人员能够观察该时间尺度上的响应在极短（毫秒级）3和极长（数年）时间范围内4的变化。这一能力对于研究多种动力学过程非常有益，同时也是对传统流变测量技术的有力补充5,6。

QCM 的高灵敏度也使其在生物学应用中得到广泛使用，用于研究极小生物分子的基本相互作用。通过使用未包被或功能化的传感器表面，可研究蛋白质的吸附行为；更进一步，还可基于质量变化来检测酶、抗体和适配体之间的复杂结合事件所介导的生物传感过程7,8,9。例如，该技术已被用于研究囊泡向平面脂双层转变的过程，将其视为一个两相过程：通过观察频率和粘弹性相关变化，揭示含流体囊泡在刚性结构上的吸附行为10。近年来，QCM 还为监测囊泡或纳米颗粒介导的药物递送提供了可靠的平台11。在材料工程与分子及细胞生物学的交叉领域，我们可以利用 QCM 阐明材料与蛋白质、核酸、脂质体和细胞等生物活性组分之间的关键相互作用。例如，蛋白质在生物材料上的吸附可介导下游的细胞反应（如炎症），通常被用作生物相容性的正向指标；而在其他情况下，细胞外蛋白质附着于与血液接触的涂层表面，可能诱发血管内危险的血栓形成12,13。因此，QCM 可作为工具用于筛选满足不同需求的最佳候选材料。

进行QCM实验有两种常用方法，均可从实验中获得类似的数据：第一种方法记录电导峰的频率偏移和半带宽（Γ）；第二种方法，即带耗散检测的QCM（QCM-D），记录频率偏移和耗散因子，该耗散因子通过公式1与Γ成正比关系14

动力学分析的数学公式 \( D_n = \frac{2\Gamma_n}{f_n} \)，方程表示。 （1）

其中 D 为耗散因子，ƒ 为频率。D 和 Γ 均与薄膜对传感器的阻尼效应相关，可反映薄膜的刚度。下标 n 表示石英传感器的奇数共振频率（即频率泛音或谐波，n = 1, 3, 5, 7…）。关于利用多个谐波建立模型以获取薄膜质量和黏弹性特性的进一步讨论，可参见 Johannsmann 的综述14 以及 Shull 团队此前发表的多篇论文15,16,17,18。

制备QCM样品时的一个关键考虑因素是如何将薄膜施加到传感器表面。一些常用方法包括旋涂、浸涂、滴涂，或在实验过程中将薄膜吸附到传感器表面。19,20QCM 样品存在四个区域：Sauerbrey 极限、粘弹性区域、体相区域和过阻尼区域。对于足够薄的薄膜，适用 Sauerbrey 极限，此时频率偏移（Δƒ) 提供了薄膜的面质量密度。在Sauerbrey极限范围内，频率偏移与谐振谐波数n及阻尼因子的变化呈线性关系。D 或 γ) 通常较小。在此范围内，若无额外假设，无法根据现有信息唯一确定该层的流变特性。此范围内的数据可用于计算表面质量密度（若密度已知，则可换算为厚度）。 先验的薄膜）的体相区域，当与晶体接触的介质足够厚时，倏逝剪切波会在完全衰减前传播进入介质。在此情况下，无法利用 Δ然而，在该区域内，粘弹性性质可通过以下组合方法可靠地测定： Δƒ 和 ΔΓ 15,18在体相区域中，如果介质过于刚硬，薄膜会抑制传感器的共振，从而无法从石英晶体微天平（QCM）获得任何可靠的数据。粘弹性区域是一个中间状态，在此状态下，薄膜足够薄，使得剪切波能够完全穿透整个薄膜，同时还能获得可靠的阻尼因子数值。阻尼因子和 Δƒ 随后可用于测定薄膜的黏弹性性质及其质量。此处，黏弹性性质由密度与复数剪切模量幅值 | 的乘积给出G*|p 相位角由 Φ = arctan( 给出G / G'）。当薄膜在索耶贝瑞极限下制备时，可直接根据下述索耶贝瑞方程计算单位面积上的质量。21,

频率变化的数学公式；用于质量传感和共振分析。 (2)

其中 Δƒn 表示共振频率的变化，n 为所关注的谐波阶数，ƒ1 为传感器的共振频率，Δm / A 为薄膜的单位面积质量，Zq 为石英的声阻抗，对于 AT 切型石英，其值为 Zq = 8.84 x 106 kg / m2s。粘弹性区域最适用于聚合物薄膜的研究，而体相极限则适用于研究粘性聚合物22 或蛋白质溶液16。不同区域取决于所研究材料的性质，完全粘弹性和质量表征的最佳厚度通常随薄膜刚度的增加而增大。图 1 描述了相对于薄膜的面密度、复剪切模量和相位角的四个区域，此处我们假设了相位角与薄膜刚度之间的特定关系，该关系已被证明适用于此类材料。许多具有实际研究意义的薄膜过厚，无法用 QCM 研究其粘弹性特性，例如某些生物膜，其厚度可达数十至数百微米量级23。这类较厚的薄膜通常不适用于 QCM 研究，但可使用频率更低的谐振器（如扭转谐振器）进行测量23，从而使剪切波在薄膜中传播得更深入。

为了确定给定的石英晶体微天平（QCM）样品所适用的测量区域，理解 d / λn 参数至关重要。该参数表示薄膜厚度（d）与石英晶体传感器机械振荡剪切波长（λn）的比值15,16,18。理想的粘弹性区域为 d / λn = 0.05 - 0.218，其中小于 0.05 的值处于索耶-布雷（Sauerbrey）极限范围内，而大于 0.2 的值则趋近于体相（bulk）区域。关于 d / λn 的更严格描述可参见其他文献15,18，但该参数本质上是一个用于区分索耶-布雷极限与粘弹性极限的定量指标。下文所使用的分析程序可直接提供该参数。

使用QCM分析薄膜时还存在一些额外的局限性。Sauerbrey方程和粘弹性计算均假设薄膜在厚度方向以及QCM电极表面的横向范围内均为均质结构。尽管这一假设使得研究含有孔隙或填料的薄膜变得困难，但仍有一些研究利用QCM对嫁接纳米颗粒的薄膜进行了探索6。如果非均质结构的尺寸远小于薄膜总厚度，则仍可获得复合体系可靠的粘弹性参数。但对于高度非均质的体系，通过粘弹性分析所得的结果必须极为谨慎地对待。理想情况下，对于未知均质性的体系所获得的结果，应通过已知为均质的体系进行验证。本文所描述的示例体系中，我们采用了这一验证方法。

本文阐述的一个重要观点是，在频域（报告Γ）和时域（报告D）中进行的石英晶体微天平（QCM）测量之间存在精确的对应关系。文中描述了两种不同的QCM实验结果，一种为时域实验，另一种为频域实验，每种实验涉及一个不同但概念上相关的模型体系。第一个体系是一个胶原蛋白在传感器表面吸附的简单示例，用于展示在时域（QCM-D）测量过程中典型的结合动力学及吸附随时间达到平衡的过程。胶原蛋白是体内含量最丰富的蛋白质，以其多样的结合行为和形态特征而著称。此处使用的胶原蛋白溶液无需对传感器的金表面进行额外功能化处理即可诱导吸附9。第二个实验体系是由阴离子型聚苯乙烯磺酸盐（PSS）和阳离子型聚（二烯丙基二甲基氯化铵）（PDADMA）组成的聚电解质复合物（PEC），其制备方法与Sadman等人22所述相同。这些材料在盐溶液（本实验中为KBr）中会发生溶胀并变得柔软，为采用频域方法（QCM-Z）研究聚合物力学性能提供了一个简单的平台。对于每种实验方案，样品的制备、测量及数据分析过程均在图2中展示。示意图表明，QCM-Z与QCM-D两种方法的主要区别在于数据采集步骤及实验所用仪器。上述所有样品制备技术均适用于这两种方法，且每种方法均可分析图1所示三种区域中的样品。

我们的数据表明，样品的制备方式——无论是在测量前还是测量过程中进行传感器涂覆——决定了能否有效提取系统的黏弹性特性。通过合理设计实验的初始阶段，我们能够在分析步骤中准确获取所需信息。

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方案

QCM-D 胶原蛋白吸附

1. 样品制备与传感器预清洗

  1. 配制 20 mL 的 0.1 M 醋酸盐缓冲液，必要时用 HCl 和 NaOH 调节 pH 至 5.6。
  2. 在无菌条件下，将大鼠尾部胶原蛋白溶液加入 20 mL 醋酸盐缓冲液中，使其终浓度为 10 µg/mL。
  3. 清洁金镀膜石英传感器，以去除有机物和生物材料25,26。
    1. 将传感器检测面朝上放入紫外/臭氧清洗仪中，处理约 10 分钟。
    2. 将去离子水（dH2O）、氨水（25%）和过氧化氢（30%）按 5:1:1 的比例混合，加热至 75 °C，将传感器置于该溶液中 5 分钟。
    3. 用 dH2O 冲洗传感器，并用氮气流吹干。
    4. 将传感器检测面朝上再次放入紫外/臭氧清洗仪中，处理 10 分钟。
      注：清洁步骤应在测量前立即进行，以最大限度减少环境对传感器表面的污染。

2. QCM-D 测量数据采集

  1. 开启所有必要的设备以进行测量，包括泵、电子单元和计算机软件。
  2. 从腔室平台上取下流体模块，并拧开大号手拧螺丝以打开模块。
  3. 如果传感器在初次清洁后（步骤1.3.1–1.3.4）已暴露在空气中，需用去离子水（dH2O）冲洗传感器，并用氮气流吹干，以确保表面无污染物。
  4. 将传感器安装到流体模块中暴露的O型圈上，首先用氮气流吹干该区域，并检查O型圈是否平整贴合。传感器应将活性表面朝下放置，锚形电极朝向流体模块中的标记方向。
  5. 拧紧手拧螺丝以密封流体模块，并将其放回腔室平台。将必要的PTFE泵管连接至流体模块和外部泵。
  6. 使用相应的计算机软件，将流体模块的温度设定为37 °C。监测温度变化10–15分钟，以确保其达到设定值并保持平衡。
  7. 查找传感器的初始共振频率。如果软件未能检测到任何共振频率，请检查流体模块是否正确放置在腔室平台上，或重新安装传感器以确保其居中并形成良好的电接触。
  8. 将进样泵管插入1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中。启动外部泵，流速设为25 µL/min，并目视检查管路，确保液体正常流动。
    注意：可通过短暂将流速提高至100 µL/min或更高，使液体流动更易观察。若液体未在管中移动，最可能的原因是流体模块的两部分未形成良好密封。可尝试拧紧手拧螺丝、拧紧管路与进/出口的连接件，或重新安装传感器以确保O型圈平整且居中。
  9. 让1× PBS溶液在流体模块中持续流动至少15分钟，以充分平衡系统。
  10. 在计算机软件中开始测量以启动数据采集。监测频率和耗散值至少5分钟，以确保获得稳定的基线。
  11. 停止泵运行，将进样管移至胶原-乙酸缓冲液中，然后恢复液体流动。记录此操作的时间，以便后续分析。
  12. 让新的频率和耗散值达到稳定状态。在此实验中，预计该稳定过程需8–12小时。
  13. 停止泵运行，将进样管移回1× PBS溶液中，然后恢复液体流动。记录此操作的时间，以便后续分析。
  14. 让新的频率和耗散值达到稳定状态。在此实验中，该稳定过程约需30分钟。
    注意：在更严格的多阶段实验中，可针对每个新的液体流动阶段重复步骤2.13和2.14。
  15. 结束测量的数据采集，并保存数据。
  16. 清洁并拆卸QCM设备。
    1. 将外部泵的流速提高至500 µL/min或更高，并将进样管插入2% Hellmanex清洗液中，至少清洗20分钟。
      注意：对于其他实验，若需对传感器进行进一步分析，应在步骤2.16.1前取出传感器，并在模块中更换为另一清洁用传感器。
    2. 停止泵运行，将进样管移至dH2O中，恢复液体流动，进一步冲洗系统至少20分钟。
    3. 停止液体流动，并从流体模块中取出传感器。用氮气流吹干传感器及流体模块内部。关闭计算机软件、电子单元和蠕动泵。
      注意：镀金传感器可按照步骤1.3.1–1.3.4进行适当清洗，并可重复用于多次测量。若传感器不再适用于可靠测量，可能表现为初始共振频率波动较大，或在缓冲液流动条件下基线漂移显著。数据可在首选软件中打开并分析，包括专营QCM-D设备的公司所提供的软件。

QCM 聚电解质复合物溶胀

3. 样品制备

注意：本实验使用 Shull 研究团队开发的 MATLAB 程序进行数据采集与分析。

  1. 首先，将一个裸露的石英晶体传感器放置在与矢量网络分析仪和计算机相连的样品架上。开启分析仪，对传感器施加交变电压，并采集传感器在空气中的参考电导谱。
  2. 将样品架浸入盛有蒸馏水的无嘴100 mL烧杯中，采集裸露传感器在水中的参考电导谱。
  3. 配制0.5 M的溴化钾（KBr）溶液。
    1. 将1.79 g KBr溶解于30 mL蒸馏水中，振荡至完全溶解。
    2. 将一小块硅片以一定角度插入KBr溶液中，作为石英传感器在退火步骤中的支架，以防止薄膜从传感器表面脱落。
  4. 准备进行旋涂的传感器。
    1. 设置旋涂参数为10,000 rpm、加速度8,000、时间5 s。
    2. 将传感器安装到旋涂仪上，并开启真空吸附。
    3. 在传感器表面滴加乙醇，运行旋涂仪以清洁传感器表面。
    4. 将PEC（PSS:PDADMA，制备方法同Sadman等.22中所述）滴加至传感器表面。
      1. 若该复合物分为两相（富聚合物相和贫聚合物相），缓慢将移液枪插入溶液中。在将移液枪插入较重的富聚合物相过程中，通过吹出气泡的方式排出移液枪内的空气。
      2. 在富聚合物相中释放数个气泡后，吸取0.5–0.75 mL富聚合物相溶液进入移液枪。保持移液枪球部压力，防止贫聚合物相进入枪内，随后将移液枪从溶液中取出。
      3. 用Kimwipe擦拭移液枪外壁。将足够量的溶液逐滴加至石英传感器表面，确保完全覆盖整个表面，并确保传感器表面溶液中无可见气泡。
  5. 对PEC样品进行旋涂后，立即将传感器浸入0.5 M KBr溶液中，以防止盐在薄膜表面结晶。
    注意：此步骤有时较难协调，建议将传感器释放至KBr溶液液面稍上方，以获得最佳效果。
  6. 让薄膜退火至少12小时。
    注意：为便于实验操作，建议在傍晚完成第4步，并让薄膜过夜退火。

4. 薄膜在空气与水中的测量

  1. 将传感器转移至盛有蒸馏水的烧杯中，以去除薄膜表面及传感器背面残留的过量溴化钾（KBr）。将传感器在溶液中放置 30–60 分钟。
  2. 在空气中测量薄膜。以空气中裸露的传感器作为参比。待薄膜数据达到平衡。
  3. 将干燥的硫酸钙放入一个 100 mL 无嘴烧杯中，测量完全干燥状态下薄膜的厚度。随后从烧杯中取出硫酸钙，并用蒸馏水冲洗烧杯。
  4. 向 100 mL 无嘴烧杯中加入 30 mL 蒸馏水。放入搅拌子，确保水流在薄膜周围循环。将薄膜在水中测量约 30–45 分钟，或直至薄膜数据达到平衡。以水中裸露的传感器作为参比。
  5. 配制 15 mL 浓度为 3 M 的溴化钾（KBr）水溶液。称取 5.35 g KBr 置于量筒中，加蒸馏水定容至 15 mL，轻轻摇动至完全溶解。
  6. 以 0.1 M 为增量，逐步将 KBr 溶液加入盛有蒸馏水的烧杯中。表 1 列出了每次加入 3 M KBr 溶液的对应体积（mL）。添加 KBr 溶液时，应使薄膜朝向远离加液位置的一侧，以防薄膜溶解。每次添加后需确保系统已达到平衡，再进行下一次添加。
  7. 完成所有数据采集后，将薄膜从支架上取下，放入盛有蒸馏水的烧杯中。使盐分从薄膜中析出（30–60 分钟），然后将薄膜在空气中晾干。
  8. 为清除传感器表面的 PEC 薄膜，向烧杯中加入 KBr 并轻轻摇动溶液。静置 5–10 分钟。重复此过程 2–3 次，然后用蒸馏水冲洗传感器。
    注意：若传感器响应仍良好，则可清洗后重复使用。可通过传感器对目标谐波的绝对带宽读数较小（<100 Hz）来判断其性能是否合格。

5. 数据分析

  1. 打开由 Sadman 创建的 QCM-D 数据分析 MATLAB 图形用户界面（https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI）27。通过选择“Load QCM”来打开空气中薄膜的数据文件。
    注：Shull 团队已开发出一个类似的 Python 图形用户界面，用于 QCM 的数据采集与分析（https://github.com/shullgroup/rheoQCM）。部分分析代码已在本论文的补充信息中提供，可用于数据分析及生成图表。
  2. 选择所需的计算模式（3,5,3 或 3,5,5）、gamma 以及 film in air 图标，然后点击 Plot QCM。
  3. 利用实验中最平衡的数据点（通常为最后一个数据点）确定干膜的厚度，并记录该数值。
  4. 打开水中薄膜的数据文件。选择与步骤 5.2 相同的参数，但将“film in air”替换为“film in water”。
  5. 在溶胀实验的每一次平衡步骤后，确定薄膜厚度、复数剪切模量以及黏弹性相位角，并将这些数值连同离子强度（范围为 0–1 M，以 0.1 M 为增量）一并记录。
  6. 按下式计算溶胀百分比：
    溶胀百分比公式示意图，显示通过密度比较计算聚合物溶胀 (3)
    其中 dp 为溶液中测得的薄膜厚度，dpdry 为干膜厚度。

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结果

蛋白质吸附过程中频率随时间的变化呈现出特征性曲线并达到稳定平台，如图3A-B所示。用1×PBS缓冲液对裸露的传感器表面进行初始冲洗时，频率仅发生可忽略的变化，从而提供一个稳定的基线，作为后续数据点的参考。加入胶原蛋白溶液后，蛋白质吸附开始发生，表现为频率随时间持续下降，直至附着的胶原蛋白密度达到稳定基线（图3A）。最终的频率和质量数值将高度依赖于传感器的纯度和表面能。在这些参数条件下，最后的缓冲液冲洗仅从传感器表面去除少量未结合的蛋白质，导致频率轻微上升。在此阶段，我们始终预期质量仅有轻微下降，表明结合到传感器上的蛋白质数量保持稳定（图3B）。

每个周期内获得稳定的频率测量值的重要性再怎么强调也不为过。环境变量（如温度、湿度和溶液浓度）的微小波动都可能导致原始数据出现可观测的差异。因此，若在频率和耗散因子...

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讨论

胶原蛋白吸附结果跨越了索耶布雷（Sauerbrey）区域和粘弹性区域。通过绘制相对于相应谐波数归一化的频率偏移，我们观察到索耶布雷极限在测量的前约2小时内成立。然而，随着吸附到传感器上的质量增加，第三和第五谐波的归一化频率偏移开始出现差异（t > 2 h），表明可据此测定吸附膜的粘弹性特性。

软件生成的粘弹性模型结果与Shull小组的幂律模型结果之间的直接比较表明，计算所得的材料特性存在显著差异。在整个测量过程中，商用软件生成的粘弹性模型数据代表了一个更厚、更软的层，其复数剪切模量较低（图5）。这些模型在黏弹性特性上的差异源于每种系统计算中所采用的假设。其中一个差异涉及对黏弹性特性频率依赖性的假设。必须做出某种假设，是因为在特定谐波（例如 n = 3）下的频率响应取决于三个参数（pd, |G*3|p，Φ3）但仅有两个独立量（Δƒ3 和 ΔΓ<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家科学基金会（NSF）（项目编号：DMR-1710491、OISE-1743748）资助。J.R. 和 E.S. 感谢美国国家科学基金会（NSF）（项目编号：DMR-1751308）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma-AldrichA6283用于胶原蛋白吸附
氢氧化铵溶液Sigma-Aldrich221228用于胶原蛋白吸附
水相QCM探针AWSensorsCLS 00050 A用于聚电解质溶胀
大鼠尾胶原蛋白I型Thermo Fisher ScientificA1048301用于胶原蛋白吸附
蒸馏水Sigma-AldrichEM3234用于聚电解质溶胀；在科研实验室中通常易于获取，但若需订购可参考此货号
乙醇Sigma-Aldrich793175-1GA-PB用于聚电解质溶胀
Gibco 磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific20012-027用于胶原蛋白吸附
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939用于胶原蛋白吸附
过氧化氢溶液Sigma-Aldrich216763用于胶原蛋白吸附
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task 擦拭纸，单层Fisher Scientific06-666A用于聚电解质溶胀
NP2K VNAMakarov Instruments用于聚电解质溶胀
聚（二烯丙基二甲基氯化铵），分子量 200,000Sigma-Aldrich409022用于聚电解质溶胀；完整合成步骤参见 Sadman 等人
聚（苯乙烯磺酸钠）水溶液，含30%重量比Sigma-Aldrich561967-500G用于聚电解质溶胀；完整合成步骤参见 Sadman 等人
溴化钾Sigma-Aldrich793604-1KG用于聚电解质溶胀
QSense QCM Explorer 系统Biolin Scientific用于胶原蛋白吸附
无水乙酸钠Sigma-AldrichS2889用于胶原蛋白吸附
旋涂仪，型号 WS-650MZ-23NPPLaurell technologies用于聚电解质溶胀

参考文献

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