一种高效分离小鼠脑周细胞的方法

摘要

我们提出了一种从小鼠大脑中提取周细胞的方案。该方案基于一种不含抗生素的富集导向型周细胞提取方法，可实现高纯度和高得率，是体外研究的有力工具，有助于减少实验动物的使用数量。

摘要

近年来，脑周细胞已成为血管生物学和病理学领域广泛研究的焦点。周细胞在血脑屏障形成和生理功能中的重要性现已得到证实，但其分子基础在很大程度上仍不清楚。由于脑周细胞在神经系统疾病中的病理生理作用引人关注且具有重要意义，体外模型不仅足够适用，而且能够整合多种技术用于这些研究。尽管已有多种方法被提出作为脑周细胞提取的体外模型，但仍需要一种无抗生素且产量高的实验方案。尤为重要的是，每轮提取产量更高的方法可减少实验动物的使用数量。

本文提出一种简单且高效的脑周细胞提取方法，可获得足够高的产量。将小鼠脑组织匀浆与牛血清白蛋白-葡聚糖（BSA-dextran）溶液混合，以分离组织碎片和微血管沉淀物。我们采用三步分离结合过滤的方法，获得富含微血管的滤液。利用该方法，从10只小鼠获取的微血管片段足以接种9个6孔板中的孔（每孔9.6 cm²）。尤为值得注意的是，使用本方案可在第2代获得27个富含周细胞的培养孔（每孔9.6 cm²）。通过检测经典周细胞标志物NG2、PDGFR-β和CD146的表达，确认了所培养周细胞的纯度。该方法为开展周细胞生理学及病理生理学研究提供了一种高效且可行的体外研究工具。

引言

脑周细胞是神经血管单元（NVU）的重要组成部分，该单元由血脑屏障（BBB）的脑内皮细胞、胶质细胞、细胞外基质和神经元共同构成一个功能整体。周细胞在中枢神经系统（CNS）的调控功能中起着至关重要的作用，因为它们是分子和细胞信息交换的界面之一。

脑周细胞嵌在脑微血管的非管腔侧，对建立¹和维持²血脑屏障（BBB）的生理功能至关重要。近年来多项研究还强调了脑周细胞在血管生成³和血管成熟⁴、内皮细胞形态发生⁵和存活⁶，以及调控脑内胆固醇代谢⁷中的作用。重要的是，上述任一过程的失调均为神经退行性疾病的病因学特征。

事实上，周细胞是血脑屏障正常功能及其抵御多种神经系统疾病进展所必需的功能性成分。周细胞的退行性生理变化和丢失是阿尔茨海默病⁸、白质功能障碍过程中的神经元丢失⁹、多发性硬化¹⁰、脓毒症性脑病¹¹、急性期缺血性脑卒中¹²以及其他神经系统疾病进展中的共同特征。周细胞还在肿瘤转移中发挥重要作用¹³。有趣的是，研究也表明周细胞在神经系统损伤和疾病后具有保护和修复作用：例如在脑内再髓鞘化¹、缺血性脑卒中、脊髓损伤¹⁴以及促进血管生成¹⁵过程中。由于周细胞易参与并加剧神经系统损伤和疾病的病理生理表现，使其成为潜在的治疗靶点¹⁶。

体外血脑屏障周细胞研究模型是开展深入研究的重要工具。这些模型为更复杂的研究提供了平台，可作为血脑屏障及其他功能的运作模型。例如，这些模型可用于理解周细胞内部及其与神经血管单元中其他细胞类型之间的细胞生理学特性。此外，体外模型也是检测新药物和分子对周细胞药理作用的首要研究工具。这些模型还可用于探究周细胞在神经系统疾病中的病理生理学作用。然而，体外模型的建立需要更高的产出效率，以实现更大的实验自由度。理想的模型应操作简便、快速，并减少实验动物的使用数量。此外，能够将此类模型发展为双细胞或三细胞共培养体系也是研究所需的目标。

已开发出多种实验方案。Tigges 等人¹⁷、Chen 等人¹⁸、Thomsen 等人¹⁹、Yamazaki 等人²⁰以及 Crouch 和 Doetsch²¹提出的方案是满足大多数需求的优秀方法。所有这些方法均能获得有效结果，但这些方案普遍存在对大量实验动物的依赖问题。因此，开发一种高产出、能够以尽可能高的效率分离和纯化周细胞的方法成为必要。在本方案中，通过多种周细胞标志物验证了二次传代后所获得细胞的纯度。我们检测了血小板源性生长因子受体-β（PDGFR-β），其被用作周细胞的经典标志物¹⁷；还检测了NG2（神经胶质抗原2），其是周细胞介导血管形态发生²²和血管生成²³的标志物。此外，我们还检测了分化簇146（CD 146），该分子已被报道为在周细胞中表达的分子之一^17,18。

本文介绍了一种从小鼠（野生型或转基因型）中提取原代周细胞的方案，该方法产量高，可满足上述所有要求。我们采用了一种无需抗生素和免疫筛选的基于增殖的选择方法来培养原代脑周细胞，该方法将被证明是开展体外研究的有效模型。

方案

所有实验均遵循本机构关于动物使用和操作的指南进行。根据法国法律规定，阿拉斯大学的动物实验设施已获得当地主管部门批准（批准编号：B62-498-5）。依照欧盟立法（指令2010/63/EU），所有实验程序均已获得当地动物护理与使用委员会（北部-加来海峡动物实验伦理委员会，编号：C2EA 75）以及法国研究部（编号：2015090115412152）的批准。

1. 溶液的配制

1. 配制500 mL洗涤缓冲液A（WBA）：含10 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）。4 °C保存。
2. 配制500 mL洗涤缓冲液B（WBB）：含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和10 mM HEPES的HBSS溶液。4 °C保存。
3. 在WBA中配制300 mL 30%葡聚糖溶液，室温下混合过夜。使用前于110 °C高压灭菌30分钟。灭菌后，室温静置2–3小时。4 °C保存。
4. 在冷的葡聚糖溶液中配制100 mL 0.1% BSA溶液，剧烈震荡3–4分钟，4 °C保存。
5. 通过在基础DMEM培养基中溶解20%小牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 µg/mL庆大霉素、1%维生素、2% Eagle基础氨基酸（BME），配制完全的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）培养液，4 °C保存。使用前添加1 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
6. 在周细胞培养基础培养基中加入周细胞生长添加剂（随周细胞培养基提供）和20%胎牛小牛血清（FCS），配制完全的周细胞培养基，4 °C保存。

2. 脑组织回收与脑膜去除

1. 为保证一致性，每次提取应使用年龄相近且性别相同的小鼠。使用无病原体动物饲养环境，并提供自由摄取的饮水。为确保实验效率并减少动物使用量，应避免组织材料的损失。
2. 处死4至6周龄的雄性C57BL/6J小鼠（Janvier labs，Le Genest-Saint-Isle，法国）。
3. 在无菌条件下迅速切除脑组织，避免对组织造成任何损伤。将组织小心放入40 mL冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
4. 将含有脑组织的冷PBS转移至一个培养皿（100 mm × 15 mm）中。
5. 将脑组织置于无菌、无绒毛的干燥擦拭纸上，使用弯头镊子去除小脑、纹状体和枕神经。
   1. 用棉签清除所有可见的脑膜。将脑组织倒置，用棉签以轻柔的向外划动方式分开脑叶，并清除所有可见的血管。
   2. 将去除了脑膜的脑组织放入含有15 mL冷WBB的培养皿（100 mm × 15 mm）中。

3. 匀浆化

1. 将组织转移至Dounce组织研磨器的研钵管中，用镊子加入3-4 mL WBB。
2. 用“松散”研杵将组织匀浆研磨55次。用WBB冲洗“松散”研杵。接着用 "紧密" 研磨25次。
3. 将悬液均分为两份，分别加入两个50 mL离心管中，每管加入1.5倍体积的预冷30% BSA-葡聚糖溶液，剧烈振荡混匀。

4. 血管组分的分离

1. 剧烈振荡试管后，将试管在3,000 x下离心25分钟 g 和 4 °C。
2. 将上清液（连同顶层的髓鞘层）转移至2个新离心管中，在3,000 x g条件下离心25分钟 g 以及 4 °C。通过加入 3 mL 冷 WBB（保持沉淀物处于 4 °C）保存第一次离心所得的沉淀物。
3. 重复步骤 4.2，并小心保留来自 2 的沉淀物^nd 离心
4. 弃去第4.3步中试管中的葡聚糖、髓鞘及组织碎片。将沉淀物保存在冷的WBB中。
5. 将第4.1步中的试管1和试管2的内容物合并，并用冷的WBB定容至终体积10 mL。
6. 对第4.2步和第4.3步中的试管重复此步骤。
   注意：最后，经过3次离心后得到3个试管。
7. 用10 mL移液管上下吹打6次，使沉淀重悬，直至肉眼不可见沉淀团块。
8. 使用真空过滤装置和尼龙网滤器，分别过滤每根试管中的细胞悬液。
   注意：此过滤步骤对于通过滤网去除较长/较大的血管至关重要。
9. 用平头镊子或刮刀在室温下轻轻刮取滤膜，回收毛细血管并重悬于WBB中。使用新的滤膜过滤该悬液，以回收更多毛细血管。
10. 将滤液等分为两份，分别加入两个离心管中，在1,000 x g条件下离心7分钟 g 和 RT。
    注意：在离心步骤期间，准备酶解溶液。根据所使用的动物数量确定所需WBB的体积（参见 材料表). 加入 1x 的 DNase 1 和 1x 的甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐（TLCK）（参见 材料表) 在 WBB 中并预热至 37 °C。
11. 收集步骤 4.10 中的沉淀物，置于一个含有预热 WBB 酶液的离心管中。加入预热的 1× 胶原酶/分散酶。将离心管放入 37 °C 摇床水浴中，准确孵育 33 分钟。
12. 通过加入30 mL冷的WBB终止酶反应。将悬浮液在1,000 x g下离心7分钟 g 和 RT。
13. 小心弃去上清液，用10 mL移液器在WBB中上下吹打6次以重悬沉淀。此步骤应较轻柔且相对快速。
14. 将悬液在1,000 x g条件下离心7分钟 g 以及室温（RT）。
    注意：此步骤中，弃去培养皿中的包被液，用室温 DMEM 冲洗一次。在室温下对细胞培养皿包被至少 1 小时。
15. 弃去第4.14步所得离心管中的上清液，用新鲜的完全DMEM培养基重悬沉淀，将细胞接种至6孔板中的9个孔（每孔面积9.6 cm²）（第0天，P0）。² 每个

5. 脑周细胞的增殖

1. 将细胞培养物置于无菌培养箱中，37 °C、5% CO₂ 条件下培养。接种细胞后 24 小时（第 1 天），小心去除碎片并更换培养基。自第 1 天起，每 48 小时更换一次培养基。
2. 观察细胞培养至少 7–8 天。在此期间，应可观察到内皮单层表面出现细胞生长。
3. 在第 8–10 天（根据融合度而定），将细胞以周细胞培养基传代至明胶包被的培养板，进行第 1 代（P1）培养。每 2 天更换一次培养基。继续观察细胞 6–7 天。根据需要，在第 17 天连续传代至第 2 代（P2）[若需要，可在第 24 天传代至第 3 代（P3）]，使用明胶包被的培养板并在周细胞培养基中培养。
   注意：细胞在融合度达到约 80–90% 时即可用于实验或观察。

结果

该方案（图1）在P0代接种时（图2A（P0：第1天））可高效获得9个孔（6孔板）。

从P0到P2阶段，可以观察到内皮细胞（白色箭头指示）和周细胞（黑色箭头指示）数量逐渐增加的特定形态学特征。在P0阶段，源自微血管的长条形内皮细胞数量丰富（图2A，P0：第3天），而此类长条形细胞在P1阶段减少，在P2阶段则消失。相反，周细胞呈四边形，在P2阶段数量较多（图2A，P2：第18天）。

为了验证P2代周细胞培养物的纯度，我们通过定量PCR（图2B）、免疫细胞化学（图2C）和蛋白质印迹法（图3）检测了周细胞标志物NG2、CD146和PDGFR-β的表达。与小鼠全脑（Ms Br）提取物相比，P2代周细胞中CD146、NG2和PDGFR-β的表达水平更高。作为对照，内皮细胞标志物Occludin和CD31、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及小胶质细胞标志物CD11b在P2代中均未检测到表达。

图1：实验方案概要。 该流程图展示了周细胞提取的关键步骤，首先使用玻璃匀浆器进行组织破碎，随后通过葡聚糖梯度和过滤进行三步分离。本方案采用33分钟的酶消化步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：细胞形态及标志物表达。（A）P0、P1和P2增殖阶段的周细胞相位差图像。P0阶段中丰富的内皮细胞以白色箭头标示，其数量在P1阶段减少，并在P2阶段完全消失。周细胞以黑色箭头标示。（B）通过PCR分析P2阶段周细胞中CD146、NG2和PDGFR-β的表达水平，并与P1阶段周细胞及小鼠脑组织（Ms Br）样本进行比较。（C）P2阶段周细胞的代表性图像，显示CD146、PDGFR-β和NG2呈阳性免疫染色。比例尺：50 μm（20倍放大）和20 μm（40倍放大）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：细胞培养物代表性的纯度分析。 通过蛋白质印迹法检测第2代周细胞（P2）及小鼠脑组织（Ms Br）样本中CD146、PDGFR-β、NG2、Occludin、GFAP、CD31、CD11b和Tubulin的表达情况。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：不同组织解离、纯化、富集及酶消化方法的代表性比较。 每种已发表的实验方案均汇总列出了各方案所使用的动物数量。同时标明了接种后获得的培养孔数量等产出结果。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

脑周细胞是神经血管单元（NVU）的重要组成部分，在血脑屏障（BBB）的形成和维持中发挥着积极作用²⁴。同样，这些细胞在不同神经退行性疾病和血管病理过程中的作用也引人关注。因此，一种高效且高产量的原代周细胞模型将为体外研究提供一个有效的平台。

目前已提出多种分离原代周细胞的方案（图4）。Tigges 等人¹⁷提出了一种包含脑膜的皮质组织分离方法。该方法首先将6只小鼠的组织进行消化（在37 °C下用木瓜蛋白酶/DNase酶消化70分钟），随后通过21 G和18 G针头进行机械解离。该方案采用一步分离法（在22% BSA/PBS溶液中离心），可获得至少2个包被了I型胶原的6孔板孔。细胞最初在内皮细胞生长培养基（ECGM）中培养至第3代，之后换用周细胞生长培养基（PGM）进行传代，以促进周细胞增殖。在另一种类似方法中，Chen 等人¹⁸建议使用无菌剃刀片将组织切碎，并在37 °C下用胶原酶/DNase消化90分钟。细胞经一步分离（在22% BSA中离心）后，去除髓鞘层，沉淀物用ECGM洗涤两次。微血管被接种于3个包被了I型胶原的6孔板孔中。待细胞达到汇合状态后，进行两次传代，之后维持在PGM中培养。最终，若以1:3比例传代细胞，仅需初始使用10只小鼠，即可获得27个6孔板孔的细胞量。

在 Thomsen 等人的研究中，作者提出通过两步酶消化法分离脑周细胞¹⁹。去除脑膜和白质后，将脑组织样本切成小块。组织块在胶原酶/DNase I 中于 37 °C 进行第一次酶反应，持续 75 分钟，随后在 20% BSA 中进行一步分离。收集沉淀物，并在胶原酶/分散酶/DNase I 中于 37 °C 进一步消化 50 分钟。接着通过 33% Percoll 梯度分离微血管，并再洗涤一次。将微血管接种于包被有 IV 型胶原蛋白/纤连蛋白的 35 mm 培养皿中。在 DMEM 培养基中添加 10% 胎牛血清（FCS）和硫酸庆大霉素，培养 10 天以促进周细胞增殖。在另一种两步酶消化方法中，Yamazaki 等人建议将切除的组织在冷 DMEM 中剪碎²⁰。在第一次酶反应中，样本在胶原酶/DNase I 中于 37 °C 处理 75 分钟。经过一步离心后，沉淀物再洗涤一次，并在胶原酶/分散酶中于 37 °C 启动第二次酶反应，持续 60 分钟。经过一步分离后，将沉淀物重悬并于 22% BSA 溶液中离心。最后，将微血管沉淀物重悬并接种至 6 孔板中。每 5 只小鼠脑组织可接种 6 孔板中的 1 孔。为获得周细胞，需将内皮细胞培养物在小鼠脑内皮细胞（mBEC）培养基 II 中连续传代三次。Crouch 和 Doetsch²⁰ 提出通过荧光激活细胞分选（FACS）进行周细胞纯化的方法。从小鼠脑皮层和脑室-脑下室区获取的组织样本经显微解剖后，用手术刀充分剪碎。在 37 °C 下用胶原酶/分散酶孵育 30 分钟后，将消化后的组织在 22%（v/v）Percoll 溶液中离心，以分离髓鞘和碎片。细胞悬液随后与荧光标记的抗体孵育，用于 FACS 分析和分选。分选后的细胞接种于包被有胶原蛋白的 24 孔板孔中。据建议，一个皮层组织可获得足够用于 24 孔板 1 孔接种的细胞数量。

即使具有生产性，这些方法仍存在若干局限性，从单次批次分离需要使用大量动物，到产量极为有限。

在开发本方案的过程中，我们成功实现了较高的产量：仅使用10只小鼠即可获得多达6孔板中的9个孔的细胞。为此，去除软脑膜可一步去除组织中的大血管。Dounce组织研磨器更适合脑等柔软组织，它可通过松散研杵实现组织破碎，通过紧密研杵实现匀浆化，同时避免不必要的细胞损伤。原代细胞培养方案的主要目标之一是最小化组织浪费并最大限度地回收脑血管组织。在本方案中，通过反复离心葡聚糖-BSA灌注后的组织匀浆物来实现这一目标。采用三步离心法有助于从组织匀浆物中回收大量血管组织，使微血管回收率提高3倍。分离后，过滤是下一步关键操作，有利于排除与平滑肌细胞相关的大血管。如前所述，已提出使用多种酶组合进行酶消化。虽然DNase用于减少细胞团块，胶原酶/分散酶用于分离单个细胞，但在这种侵入性环境中防止细胞死亡至关重要，而TLCK可有效防止细胞死亡，从而提高最终细胞得率。最初，允许第一代细胞生长形成内皮单层，随后该单层支持周细胞在其表面附着生长。由于原代内皮细胞在传代后存活率降低，这提高了获得周细胞的可能性。此外，本方案采用额外的传代步骤，以确保避免内皮细胞污染。需要注意的是，若P2代细胞数量较多，则可减少对进一步传代的依赖，同时降低增殖速度更快的平滑肌细胞过度生长而抑制周细胞生长的可能性。

为了获得更高的产量，有几个步骤至关重要，必须严格控制温度和时间。将组织匀浆快速混入BSA-葡聚糖溶液中是必要的。离心后的沉淀物应迅速解离，以防止细胞死亡。此外，酶消化过程应精确控制在33分钟，并谨慎操作。本方案的一个局限性在于内皮单层细胞需要7-8天的培养时间，以促进周细胞的进一步生长。显然，微血管分离效果更好时，单层细胞生长更快，从而获得更多的周细胞。建议每次提取至少使用10只小鼠，以确保有足够的微血管组分支持周细胞的后续生长。若能仔细遵循上述要点，则可轻松达到脑周细胞培养所需的细胞密度。

体外模型为构建衍生模型提供了可行的平台，有助于获取更多关于神经系统疾病期间神经血管单元（NVU）内其他细胞之间的病理生理相关性及相互通讯的信息。分离得到的周细胞可应用于双细胞共培养（与内皮细胞或胶质细胞）以及三细胞共培养（内皮细胞和胶质细胞）模型中。本文未讨论这些模型的建立。总之，本方案提供了一种可获得较高产量原代细胞的方法，为与脑周细胞生物学相关的体外研究提供了更优的实验平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨基酸 BME	Sigma	B-6766	4 °C 保存。
基础 DMEM 培养基	Invitrogen	316000083	4 °C 保存。
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma	F-0291	-20 °C 保存。
BSA	Sigma	A-8412	4 °C 保存。
胶原酶-分散酶	Sigma	10269638001	用无菌 PBS-CMF 配制 10 倍储存液。使用 0.22 μm 注射器滤器过滤溶液，并于 -20 °C 保存。注意：在实验方案的酶消化步骤中，每提取 10 只小鼠的组织，需要 300 µL 的 10 倍浓度胶原酶-分散酶。
葡聚糖	Sigma	31398
DNase I	Sigma	11284932001	将 100 mg 溶解于 10 mL 无菌水中，配制 1000 倍储存液，并于 -20 °C 保存。
明胶	Sigma	G-2500	通过将明胶配制成 0.2% 的无菌 PBS-CMF 溶液（8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.2 g/L KH2PO4，2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O)，pH 7.4）来制备工作包被液。在 120 °C 下高压灭菌至少 20 分钟，并于室温保存。培养皿需在 4 °C 下包被至少 4 小时。
庆大霉素	Biochrom AG	A-2712	4 °C 保存。
谷氨酰胺	Merck	I.00289	-20 °C 保存。
HBSS	Sigma	H-8264	4 °C 保存。
HEPES	Sigma	H-0887	4 °C 保存。
Matrigel	BD Biocoat	354230	将 Matrigel 储存液用冷 DMEM 按 1:48 比例稀释，配制工作包被液，最终浓度为 85 µg/cm²。细胞培养皿应在室温下包被至少 1 小时。
小鼠周细胞培养基	Sciencell 研究实验室	1231	4 °C 保存。
甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮	Sigma	T-7254	将 16 mg 溶解于 10.88 mL WBA 中，配制 1000 倍储存液，得到 4 mM 溶液，并于 4 °C 保存。
维生素	Sigma	B-6891	-20 °C 保存。
设备要求
过滤工具	Sefar，尼龙网，60 微米孔径
实验室设备	水平转子离心机
带振荡器的水浴锅
层流罩：BSL2
玻璃器皿（所有组件需热力灭菌）	玻璃匀浆器（带玻璃研杵）
研杵 I：0.0035 - 0.0065 英寸
研杵 II：0.0010 - 0.0030 英寸
带粗孔径烧结玻璃滤板支撑底座的真空过滤装置
手术解剖工具（所有组件需热力灭菌）	镊子、剪刀、本生灯、棉签、纱布