生成可控的动态化学环境以研究微生物行为

摘要

本文介绍了一种在微流控和毫流控装置内通过光解反应生成动态化学梯度环境的实验方案。该方法适用于研究多种生物学过程，包括微生物在单细胞水平和群体水平上的运动行为、营养摄取以及对化学物质的适应性。

摘要

我们展示了一种生成可控、动态化学脉冲的方法——在微尺度上使局部趋化引诱物突然释放，从而为微生物趋化性实验构建微环境。为了产生化学脉冲，我们开发了一套系统，通过在含有细菌悬浮液的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控腔室内对“笼锁型”氨基酸进行光解，实现氨基酸源近乎瞬时的引入。我们将该方法应用于趋化性细菌Vibrio ordalii，该菌可在这些动态化学梯度中主动上行迁移，并通过视频显微镜进行追踪。氨基酸经光可解保护基团化学修饰后处于生物学惰性状态（“笼锁”），在悬浮液中均匀存在，但在被突然释放前无法被细菌利用；释放过程通过近紫外A波段（UV-A）聚焦LED光束在用户指定的时间和空间位置触发。脉冲中释放的分子数量可通过曝光时间与脱笼比例之间的校准关系确定，其中光解后的吸收光谱采用紫外-可见光谱（UV-Vis）进行表征。可在微流控装置中集成纳米多孔聚碳酸酯（PCTE）膜，以便通过流动持续清除脱笼后的化合物及耗尽的培养基。通过将PCTE膜涂覆3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液，再对需键合的表面进行等离子体活化，可实现PCTE膜与PDMS微流控结构之间牢固且不可逆的键合。由计算机控制的系统可在不同位置以不同强度生成用户自定义的脉冲序列，从而构建具有特定时空变异性的资源分布图景。在每一种化学景观中，均可获取细菌个体尺度的运动动态及其在群体水平上的聚集行为，从而实现对趋化性能的量化分析，并研究其在生态相关环境中对细菌聚集的影响。

引言

微生物依赖于趋化性——即感知化学梯度并相应调整运动能力的过程¹——来导航化学环境、接近营养源和宿主，并逃离有害物质。这些微尺度过程决定了微生物与其环境之间相互作用的宏观动力学特征^2,3。近年来，微流控和微加工技术的进步，包括软光刻技术⁴，极大地提升了我们构建可控微环境以研究微生物相互作用的能力。例如，以往的研究通过生成高度可控、中等到高浓度营养物质的稳定梯度来研究细菌趋化性^5,6。然而，在自然环境中，微尺度化学梯度往往是短暂存在的——会因分子扩散而迅速消散——且背景条件通常极为稀薄⁷。为了直接测量微生物群体在首次暴露于非稳态化学环境时的趋化反应，我们设计并在此描述了一种将微流控技术与光解作用相结合的方法，从而模拟野生细菌在自然环境中所遇到的化学梯度。

解笼技术利用光敏探针，将生物分子以失活形式进行功能性包封。通过照射释放被包封的分子，从而实现对特定生物过程的靶向干扰⁸。由于解笼技术能够快速、精确地调控细胞内的化学反应^9<....

方案

1. 单次化学脉冲实验用微流控装置的制备

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计通道，并将其打印到透明胶片上以制作光刻掩模（图1A）。
2. 通过软光刻技术在洁净室条件下制备母模。
   1. 依次用丙酮、甲醇和异丙醇快速清洗硅片（4英寸），然后用氮气吹干。将硅片放入烘箱中，在130 °C下烘烤5分钟。
   2. 将硅片置于匀胶机中心，并将SU-8光刻胶倒在硅片上。在5秒内将匀胶机转速升至500 rpm，并保持10秒。再用10秒将转速升至最终速度，并在此速度下维持30秒。
      注：最终转速的具体数值取决于目标涂层厚度和所使用的SU-8型号。
   3. 匀胶完成后，先在65 °C下烘烤，再在95 °C下烘烤。让硅片在室温（RT）下冷却至少5分钟。
      注：烘烤时间取决于目标厚度和所用光刻胶的类型。一般原则是，每100 µm厚的涂层应在65 °C下烘烤5分钟，在95 °C下烘烤45分钟。
   4. 将光刻掩模放置在硅片上，确保仅目标区域被曝光并发生聚合。按照SU-8说明书推荐的时间进行紫外光曝光。
      注：本实验中，在波长为350 nm、曝光能量为200 mJ cm^-2的条件下，曝光时间为150秒。
   5. 按照SU-8说明书推荐的时间，在65 °C和95 °C下对硅片进行烘烤。
      注：一般....

结果

我们使用微流控和毫流控装置（图1）研究细菌在动态营养条件下的聚集特性。通过相差显微镜记录细菌群体在光解释放化学脉冲后的聚集-消散动态视频，从中提取细菌运动轨迹（图2 和 图3）。通过对数百万条轨迹进行平均，获得了径向漂移速度和细菌浓度的时空动态数据。在独立实验中，通过更高空间和时间分辨率的观测，获得了无化学梯度条件下细菌游动行为的统计特征（图4）。

图1：在动.......

讨论

该方法可使研究人员在微流控和毫流控装置中研究细菌趋化性，通过可控的动态浓度梯度实现可重复的数据采集。利用光解反应在微尺度上近乎瞬时地生成化学脉冲，旨在模拟细菌在自然环境中所遇到的多种营养脉冲，例如，下沉海洋颗粒后方羽流的扩散²⁵，或裂解的浮游植物细胞释放营养物质的扩散过程²⁶。

我们展示了该方法的两个应用：1）释放单个化学脉冲，以研究从均匀条件开始的细菌聚集−消散动态过程；2）释放多个脉冲，以表征非平衡营养条件下细菌的聚集特征。第一种应用特别适用于表征微生物首次接触营养源时的行为响应。在此类条件下，化学引诱剂分子浓度极低，趋化作用的早期阶段主要由化学引诱剂分子与趋化受体之间的随机结合−解离事件所主导¹⁷。我们的方法通过在无营养背景中快速且精确地释放已知质量的化学引诱剂，相较于以往方法在表征细菌在动态条件下的响应方面具有显著优势^27,28.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% 纯度，高毒性
CELLSTAR 管	Greiner Bio-One	210261	50 ml
离心机	Eppendorf	5424R	用于去除细菌培养物中的废培养基
数字培养箱 Incu-Line	VWR-CH	390-0384	用于烘烤 3D 母模
除尘枪	VWR-CH	16650-22	用于清洁晶圆和微通道
加热板	VWR-CH	444-0601	用于键合微通道
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe 微量离心管	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		用于图像分析和细菌追踪
微量离心管	Eppendorf	30120086	1.5 ml
显微镜载玻片	VWR-CH	631-1552
尼康 Eclipse TiE 显微镜	Nikon Instruments	MEA53100	配备电动载物台
MNI-谷氨酸	Tocris Bioscience	1490	>98% 纯度，光敏性
模具打印设备	Stratasys		Objet30 3D 打印机
模具打印服务	3D Printing Studios	定制	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One 紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	用于校准解笼反应
NIS Elements	Nikon Instruments		显微镜成像软件
鼓风干燥箱 Venti-Line	VWR-CH	466-3516	用于烘烤 PDMS（强制对流）
光刻胶 SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
等离子体处理腔 Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	用于键合前表面功能化
聚碳酸酯膜	Sterlitech	PCT0447100	孔径 0.4 µm，开孔面积 19%，厚度 24 µm
聚乙烯微管	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	内径 × 外径：0.015" × 0.043" / 0.38 mm × 1.09 mm
聚苯乙烯培养皿	VWR-CH	25373-100	底部表面（90 mm × 15 mm），用于键合毫流控装置
电子天平	VWR-CH	611-2605	用于称量 PDMS 混合物
sCMOS 相机 Andor Zyla	Oxford Instruments		用于相差显微镜和荧光显微镜（最高 100 fps）
海水盐	Instant Ocean	产品编号 SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		用于设计模具
Spectra X 光源引擎	Lumencolor		用于 395 nm LED
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS 硅弹性体套件；固化剂
注射器（鲁尔锁）	B Braun Omnifix	4616308F
注射器针头	Agani	A228	适用于 10 至 30 ml
注射泵 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 号针头，5/8 英寸（16 mm）
VeroGrey	Stratasys		双通道注射泵
Vortex-Genie 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236	模具材料